FOLDING E CONTROLLO DELLE PROTEINE PDF

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FOLDING E SMISTAMENTO DELLE PROTEINE, UBIQUITINA, TRASPORTO DELLE PROTEINE A LIVELLO DL NUCLEO E DEL MITOCONDRIO...

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Argomenti: folding e controllo della qualità delle proteine, smistamento delle proteine Folding delle proteine Una proteina, prima di svolgere la sua funzione, deve subire una sorta di p  rocesso di maturazione, perché la proteina viene sintetizzata come una semplice successione di amminoacidi, che deve acquisire la corretta s truttura tridimensionale . In realtà, prima ancora che la sintesi proteica termini, alcune regioni della proteina iniziano a stutturarsi tridimensionalmente, cioè iniziano a ripiegarsi dello spazio, subendo quello che si chiama processo di folding. La proteina può subire anche una serie di modifiche post-traduzionali di cui abbiamo già parlato, come la fosforilazione, metilazione, demetilazione, solfatazione, nitrosilazione ecc.; ma la cosa “più importante” è il ripiegamento tridimensionale. E’ fondamentale che questo processo avvenga in maniera corretta, perché la funzione della proteina è strettamente correlata al corretto ripiegamento di quest’ultima: se la proteina non riesce a ripiegarsi correttamente non avrà attività biologica, perché avrà la conformazione dei siti attivi diversa da quella che dovrebbe essere che impedirà il funzionamento dal punto di vista enzimatico. Un’alterazione nel raggiungimento della struttura 3d può portare una particolare reattività della proteina mal ripiegata rispetto ad altre proteine . Questa interazione potrebbe poi provocare una distorsione anche nella proteina (ripiegata correttamente) legata dalla proteina mal ripiegata, fino a formare aggregati proteici privi della struttura tridimensionale corretta.

Come avviene il processo di folding? Il processo di folding è c  otraduzionale, cioè inizia quando la traduzione non è stata ancora completata. Alcune proteine riescono a ripiegarsi correttamente in autonomia, cioè senza l’aiuto di altre proteine. Per le proteine invece un po’ più grosse, che hanno maggiori difficoltà nel ripiegamento, intervengono quelli che si chiamanochaperon molecolari. Gli chaperon molecolari sono p  roteine che mediano il processo di folding, collaborando in modo ATP dipendente o indipendente (in base al tipo di chaperon). Abbiamo tantissimi tipi di chaperon, raggruppati in famiglie diverse. Ognuno di questi chaperon ha una determinata funzione, ad esempio esistono chaperon chiamati disolfuro tra residui di cisteina disolfuro isomerasi , che creano e disfano ponti nell’ambito di una proteina. Quindi, alcune proteine raggiungono una corretta struttura tridimensionale se avvengono intramolecolarmente anche un corretto tipo di legami tra specifici residui di cisteina che instaurano ponti disolfuro (cisteina: amminoacido che termina con un gruppo SH, due cisteine possono interagire tra loro formando legami covalenti, chiamato ponte disolfuro). Sono stati proposti vari modelli del processo di folding, ma il modello più accreditato è quello che prende in considerazione quello che si chiama intermedio a globulo fuso ( molten globule ). Ci sono porzioni della proteina da cui si inizia a ripiegare. In di enucleazione queste regioni gli amminoacidi si ripiegano formando un centro  intorno al quale tutta la restante parte della proteina inizierà a ripiegarcisi sopra,

acquisendo in un tridimensionale.

determinato

intervallo

di tempo una corretta struttura

Facciamo un esempio: Immaginiamo che in una proteina, la parte più esterna debba interagire con l’ambiente acquoso. Le regioni che inizieranno a ripiegare per prime, e che quindi finiranno all’interno, saranno regioni idrofobiche, che instaureranno tra loro interazioni idrofobiche tali da ridurre al minimo il contatto con l’acqua. Le porzioni idrofobiche formeranno quindi il centro di enucleazione, le ultime porzioni invece a ripiegarsi, che quindi andranno a formare lo strato più esterno sono le regioni formate da amminoacidi idrofilici.

Le proteine più complesse, che hanno ad esempio vari domini transmembrana, vengono foldate da chaperon che lavorano in modo ATP dipendente o indipendente. In particolare, il meccanismo di azione potrebbe essere quello di andare a coprire le regioni che devono foldare per ultime. Se ho una proteina svolta e ho bisogno di indurre alcune regioni a formare il centro di enucleazione, è sufficiente che queste vengano lasciate libere. Dunque gli chaperon coprono alcune regioni della proteina da foldare, che si ripiegherà a partire dalle regioni lasciate libere. Gli chaperon mano a mano si andranno a staccare dalle regioni coperte, in base alla forma che la proteina deve assumere. Questi chaperon fanno parte della famiglia H  sp 70 e sono ATP dipendenti.

Un’altra famiglia di chaperon molecolari è quella delle Hsp  60 . Queste proteine hanno una struttura a botte, nella quale entra la proteina svolta. La superficie interna è ricca di residui idrofobici. La botte è in grado di cambiare conformazione dopo che è entrata la proteina da foldare, producendo dunque continui cambi di

conformazione che inducono interazioni tra la proteina chaperon e la proteina da foldare, interazioni che facilitano il processo di folding. Il corrispondente batterico di questa famiglia di chaperon è uno chaperon formato da due subunità: G  ro ES e G  ro ER. La parte er è la più grande. Queste due subunità, dopo l’ingresso della proteina da foldare, cambiano continuamente conformazione che facilitano il folding della proteina. Lo chaperon libererà la proteina solo una volta che il processo di folding sarà completato.

Hsp significa h  eat shock protein , sono cioè proteine responsive allo shock termico. Normalmente le cellule crescono a 37 gradi. Se aumentiamo la temperatura anche solo fino a 40 gradi le cellule vanno in shock termico, che è una risposta fisiologica in cui vengono prodotte una serie di molecole che bloccano la sintesi proteica in generale, ma viene mantenuta la sintesi proteica delle hsp, perché lo shock termico innesca problemi di folding delle proteine. Quindi è inutile produrre altre proteine, ma bisogna foldare correttamente quelle già prodotte, la cellula quindi risponde producendo hsp. Se questo shock rimane, verrà innescata l’apoptosi.

Controllo della qualità delle proteine

Una proteina mal ripiegata, come abbiamo detto in precedenza, può creare danni enormi nell’organismo, andando a formare aggregati proteici chiamati placche

amiloidi che precipitano nella cellula, sono insolubili e manderanno le cellule a morte. Esiste, per questo motivo, il c  ontrollo di qualità delle proteine , come ad esempio quello che segue allo shock termico. Bisogna ricordare che lo chaperon è una proteina che ha bisogno di tempo per foldare le proteine: in una condizione di assenza di stress gli chaperon riescono normalmente a foldare le proteine prodotte; in presenza di uno stress gli chaperon richiedono maggiore tempo per foldare la proteina, quindi è chiaro che la catena di assemblaggio potrebbe incepparsi. In quel caso, cosa deve fare la cellula? Prima di arrivare all’apoptosi, cerca di eliminare tutte le proteine mal ripiegate. Del processo del controllo di qualità delle proteine fa parte, oltre agli chaperon molecolari stessi, quello che si chiama s  istema ubiquitina-proteasoma . E’ un sistema che permette di degradare le proteine che hanno terminato di svolgere la loro funzione o sono non correttamente ripiegate.

Quando una proteina deve essere degradata, può essere targetata con una proteina chiamata u  biquitina, tramite un sistema di u  biquitina-ligasi. L’ubiquitinazione rappresenta, quindi, un m  archio di degradazione. Dopo l’ubiquitinazione la proteina sarà inviata al p  roteasoma, complesso proteico molto grosso in grado di riconoscere le proteine ubiquitinate e degradarle.

Il p  roteasoma è  un grosso complesso multiproteico fatto da tre parti: due esterne, che prendono il nome di cappucci 1  9s, che delimitano una camera interna chiamata 20s. I cappucci 19s fanno da barriera selettiva per le proteine che arrivano al proteasoma, controllando se sono ubiquitinate: se non sono ubiquitinate non le lasciano passare, se lo sono verranno passate nella camera interna, che ha una forte attività proteolitica. Tutto quello che arriva nella camera interna 20s viene degradato tramite specifiche proteasi. Questo processo della degradazione di proteine ubiquitinate è ATP dipendente. La traslocazione delle proteine ubiquitinate nella camera interna avviene ad opera di proteine molto simili agli chaperon

molecolari, chiamate u nfoldasi, che svolgono le proteine da degradare e le “tirano” nella camera interna.

L’ubiquitina è una proteina globulare molto piccola, di 76 amminoacidi, altamente termostabile, quindi in grado di svolgere la sua funzione anche ad alte temperature. E’ una proteina talmente importante dal punto di vista evolutivo che risulta essere conservata, infatti l’ubiquitina dei lieviti ha delle omologie strutturali enormi con l’ubiquitina umana.

Come avviene l’ u  biquitinazione delle proteine target? Il sistema di ubiquitinazione è di tipo gerarchico. Esiste una famiglia di proteine non molto grandi che lega l’ubiquitina, famiglia chiamata c omplesso E1 . Questo complesso E1 lega delle specifiche proteine che fanno parte del c omplesso E2. L’E1 trasferisce l’ubiquitina ad E2. Ogni proteina E1 (ne abbiamo poche) legherà un certo numero di E2. Ogni E2 può legare molteplici p  roteine E3. Ogni E3 legherà diversi target a cui verrà trasferita l’ubiquitina. In questo modo a partire da poche E1 vengono ubiquitinate un numero molto elevato di proteine da mandare a degradazione.L’ubiquitina viene aggiunta della proteina target. nella proteina bersaglio a livello delle lisine 

Non esiste solo una m  ono-ubiquitinazione. Normalmente, le proteine da mandare a degradazione sono p  oli-ubiquitinate, viene aggiunto loro cioè una catena di ubiquitine legate tra loro. Solitamente la mono-ubiquitinazione non ha funzione degradativa. La poli-ubiquitinazione varia la sua funzione in base alla posizione della lisina a cui è legata: se è legata alla lisina 48 avrà funzione degradativa, se è legata alla lisina 63 può avere tutta una serie di funzioni, come ad esempio funzioni di reclutamento di altre proteine e quindi induzione di una cascata biochimica.

Difetti di questo sistema ubiquitina proteasoma possono scatenare molte patologie, come quelle neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer), o anche nella fibrosi cistica. Nella fibrosi cistica si verifica una mutazione del canale del cloro, che non va in membrana, ma non riesce più a farlo e svolge una funzione di tipo patogenetico, quindi la patologia sarà data dalla mancanza del canale cloro e dalla cattiva funzione che assume non essendo in posizione corretta.

Smistamento delle proteine Una proteina che fine fa una volta sintetizzata? Le proteine vengono sintetizzate a livello del citoplasma, alcune dai ribosomi liberi, altre dai ribosomi adesi alla superficie del reticolo endoplasmatico. La spiegazione di questa differenziazione è l’argomento che vedremo adesso, che prende il nome di smistamento delle proteine.

L’enorme differenza tra la cellula procariotica e la cellula eucariotica sta nella compartimentazione cellulare , presente solo nella cellula eucariotica, mentre nei procarioti è tutto racchiuso dalla membrana e dalla parete cellulare e nell’interno della cellula è disperso il materiale genetico nel citoplasma. I compartimenti cellulari delle cellule eucariotiche, contenenti i vari organuli, sono delimitati da una membrana, che ha la funzione di regolare lo scambio di molecole tra l’ambiente interno che delimita e quello esterno. Come arrivano le diverse

proteine destinate ai diversi organuli nei diversi compartimenti, visto che una membrana non permetterebbe mai il trasporto di una proteina attraverso essa. Origini del nucleo:Si pensa che il nucleo si sia evoluto per invaginazione della membrana citoplasmatica esterna che ha inglobato il materiale genetico, infatti il nucleo è dotato di doppia membrana. Anche nei batteri, il DNA non è perfettamente disperso nel citoplasma, ma si aggancia a dei siti che sono attaccati alla membrana plasmatica in corrispondenza di invaginazioni dette mesosomi. Origini del mitocondrio e del cloroplasto: teoria endosimbiotica.

Come arrivano le proteine a livello di questi organelli? Arrivano grazie a tre tipi trasporto: trasporto regolato, trasporto transmembrana e trasporto vescicolare. -

-

di

trasporto regolato: avviene nei pori nucleari trasporto transmembrana: avviene grazie a proteine traslocatrici o trasloconi, che formano canali transmembrana attraverso i quali passano le proteine in forma non ripiegata e raggiungono il compartimento finale trasporto vescicolare: si avvale dell’utilizzo di specifiche vescicole, che sono fatte da pezzi di citoplasma o pezzi di specifici compartimenti che contengono proteine. Successivamente, esse si uniscono al loro compartimento bersaglio riversandogli il loro contenuto. Le vescicole gemmano da un compartimento donatore, racchiudendo ciò che si trovava all’interno del lume del compartimento. Così come anche la membrana (e tutto ciò che vi faceva parte) del compartimento donatore ora la troveremo sulla membrana della vescicola e conseguentemente, dopo la fusione della vescicola con il compartimento bersaglio, anche sulla membrana del compartimento bersaglio. Se invece la vescicola si fonde con la membrana plasmatica, essa riverserà il suo contenuto al di fuori della cellula, e la sua membrana diventerà parte integrante della membrana plasmatica.

SEQUENZA SEGNALE In che modo una proteina viene riconosciuta da questi sistemi di trasporto? Come fa la cellula a capire come smistare le proteine? Lo fa grazie alle sequenze segnale presenti in ogni proteina. La sequenza segnale è una sequenza amminoacidica presente nelle proteine che contiene l’informazione necessaria a un determinato sistema di trasporto per indirizzare quella proteina verso un compartimento bersaglio. Quindi ogni proteina avrà una sua specifica sequenza segnale che la indirizzerà verso uno specifico

compartimento finale. Le uniche proteine non dotate di sequenza segnale sono le proteine citoplasmatiche e non essendo riconosciute da nessun sistema di trasporto rimarranno nel citoplasma. Le proteine nucleari hanno una doppia sequenza segnale: una sequenza di localizzazione nucleare che le indirizzano verso il nucleo , e una sequenza di esporto nucleare che le indirizzano verso il citoplasma. Solitamente, le proteine nucleari, come i fattori trascrizionali, assumono nel citoplasma una forma inattiva. Questo perché i fattori trascrizionali funzionano in risposta ad uno stimolo ed hanno determinata durata nel tempo, perciò quando c’è bisogno di intensificare la trascrizione di un gene essi vengono lasciati operare, ma ad un certo punto questi fattori trascrizionali devono terminare la loro attività, e lo fanno quando viene esposta la loro sequenza di esporto nucleare venendo dunque trasportate nuovamente nel citoplasma dove resteranno in forma inattiva. Quando ci sarà nuovamente il bisogno di trascrivere un determinato gene verrà invece esposta la loro sequenza di localizzazione nucleare. La sequenza segnale nucleare è caratterizzata da uno stretch di amminoacidi basici come la lisina e l’arginina. In laboratorio per studiare se una sequenza ha funzione di segnale si va a studiare una proteina e in particolare si legge la sua sequenza amminoacidica e per esempio se si nota la presenza di una sequenza ricca di lisina e arginina, come si fa a capire se quella è la sequenza che ne determina l’importo nel nucleo? Si crea una mutazione a livello di quei amminoacidi (ad esempio si muta la lisina in alanina che è un amminoacido privo di carica) e si vede se la localizzazione della proteina cambia o non cambia. Se la localizzazione della proteina cambia, ovvero ritorna al citoplasma allora si stabilisce che quella sequenza era responsabile dell’importo nucleare.. VARIE SEQUENZE DI IMPORTO CELLULARE Oltre alle sequenze di importo nucleare vi sono: Sequenze di importo mitocondriale: di solito le troviamo all’N terminale della proteina,sono sequenze di circa 20 amminoacidi prevalentemente idrofobici e carichi positivamente. Sequenza di importo reticolare: queste riguardano tutte le proteine sintetizzate dai ribosomi associati al reticolo endoplasmatico che hanno questa sequenza segnale all’N terminale ricca di amminoacidi idrofobici. Sequenze di importo nei perossisomi: tutte le proteine associate ai perossisomi hanno come sequenza segnale SKL al C terminale ovvero serina lisina leucina. Sequenze di recupero del reticolo: Dai ribosomi associati al reticolo endoplasmatico rugoso vengono prodotte tutte le proteine cellulari destinate a tutti gli organelli cellulari.Pero’ alcune proteine si stabiliscono stabilmente nel reticolo, esse hanno una sequenza segnale al C terminale che prende il nome di KDEL cioè lisina aspartato glutammato leucina.

Alcune di queste sequenze, solitamente quelle all’N terminale, vengono rimosse(come quella di importo nei mitocondri o quella di importo nel reticolo) tramite una sorta di processo di maturazione in cui la sequenza viene rimossa una volta che la proteina raggiunge il suo compartimento bersaglio. La sequenza segnale non acquisisce una forma tridimensionale particolare ma essa tende a formare una struttura non ripiegata che viene riconosciuta dai sistemi di trasporto. Ciò non avviene nelle proteine nucleari, perché gli amminoacidi basici delle loro sequenze segnale vengono riconosciuti da questi sistemi di trasporto come sequenze strutturate e senza aver raggiunto tale struttura non possono essere riconosciute. Ciò non vale però per quelle proteine che hanno la sequenza segnale all’N terminale come le proteine che vanno nel reticolo o le proteine che vanno al mitocondrio.

Argomento: nucleo e

Meccanismo di trasporto delle del mitocondrio.

proteine a

livello

Meccanismi di trasporto delle proteine a livello del nucleo. La membrananucleare è una costituita da una parteesterna contigua con quello che è innumerevoli pori, associati a volta di origine multiproteica dal citoplasmaal nucleo.

membranache e da una il reticolo dei complessi capaci di

si ripiega su se st parteinterna. La partee endoplasmatico, inoltre del poro nucleare, a lo regolare il passaggio d

Infatti, regolano il passaggio non solo di ma ancheacidi degli proteine da un versante all’altro. nucleici -Vi sono alcune proteine, tipo i fattori trascrizionali, che insegui determinato stimolo devono entrare nel nucleo per svolgere la

funzione, e una volta svolta, tali fattori usciranno dal nucleo p al citoplasma. -Gli RNA, sintetizzati a livello del nucleo, per essere tradotti d essere esportati dl nucleo al citoplasma. Inoltre essi non a liberamente la membrananucleare, infatti sono mediati da alcuni specifici sistemi di trasporto i quali si servono di alcune p costituiscono quello che èporo nuclare. detto Il traffico attraverso la membrananucleare delle proteine e degli a nucleici tramite il poro nucleare avviene in modo regolato. importine Ciò è regolato da proteine detteed esportine . Dal momento che la membranaè costituita da questi pori nuclea potrebbe aspettare una poca stabilità e quindi un suo stesso sf ma un ulteriore grado di rigidità è fornito da una lamina costituita da filamenti citoscheletrici che prendono il filamenti nome di intermedi , posti nella parteinterna della membrana . Esistono tre tipi di questi microfilamenti: • Microfilamenti: ovvero i filamenti di actina e sono i fi piccoli (per spessore) che costituiscono il citoscheletro. • Microtubuli: sono i filamenti più grandi (per spessore) all’inte della cellula. • Filamenti intermedi: prendono il nome laminedisvolgono , svariate funzioni tra cui il rivestimento della membrananucleare, ed in conferiscono la forma “sferica”al nucleo. Durante la mitosi però la membrananucleare si sfalda e l’ nucleare si disassembla sottoforma di piccole vescicole che si nel citoplasma...