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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Código: 504130 Horas semanales: 3 Componente: Practico Ubicación: III semestre Número de créditos: 4 Requisitos: R504112 – R504114 Docentes: Cindy Rodiño y Carlos Castro

PRACTICA N° 6 FLOCULACIÓN VDRL /RPR

1. FUNDAMENTO TEORICO La sífilis es una enfermedad infectocontagiosa con afectación sistémica causada por la bacteria en forma de espiral llamada Treponema, subespecie pallidum. Esta bacteria es capaz de penetrar en el organismo a través de las membranas mucosas intactas o a través de heridas en la piel; aproximadamente un 30% de la transmisión se da por contacto sexual, también puede transmitirse a través de la placenta y por transfusiones sanguíneas. A partir de aquí el microorganismo se disemina por el cuerpo humano a través de los vasos linfáticos o sanguíneos, por lo tanto cualquier órgano del cuerpo humano puede ser invadido incluyendo el sistema nervioso central (SNC). Clínicamente, la sífilis se divide en una serie de etapas: fase de incubación, sífilis primaria, secundaria, sífilis latente y tardía. El período de incubación medio es de tres semanas (varía de tres a 90 días). La fase primaria consiste en el desarrollo de la primera lesión en la piel o las mucosas conocida como chancro y que aparece en el lugar de inoculación, pudiendo ser única o múltiple. Se acompaña a veces por el desarrollo de una adenopatía regional. Las espiroquetas son fácilmente demostrables en dichas lesiones y el chancro cura espontáneamente entre dos y ocho semanas. La fase secundaria o estadio diseminado comienza al cabo de dos a 12 semanas después del contacto. Se caracteriza por manifestaciones parenquimatosas, constitucionales y mucocutáneas. Es posible demostrar la presencia de Treponemas en la sangre y otros tejidos, como la piel y los ganglios linfáticos.

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA Tras la sífilis secundaria, el paciente entra en un período latente durante el cual el diagnóstico sólo se puede hacer mediante pruebas serológicas. Este período se divide, a su vez, en latente precoz y en latente tardío. La recaída de una sífilis secundaria es más probable en esta fase precoz y se produce como consecuencia de una disfunción inmunológica. La sífilis tardía se refiere a la aparición de manifestaciones clínicas aparentes o inaparentes que se desarrollan en más de un tercio de los pacientes no tratados y las lesiones características denominadas gomas. Para el diagnóstico de la sífilis tradicionalmente se cuenta con tres grupos de pruebas. Por examen directo mediante microscópia en campo oscuro y por fluorescencia directa, mediante serología y por cultivo en células epiteliales de conejo. Por serología se tienen dos tipos de pruebas, las pruebas no treponémicas como VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), RPR (Rapid plasma reagin) y las pruebas treponémicas como FTA ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption) o como MHA-TP (Microhemaglutinación para T pallidum) La infección sifilítica produce dos tipos de anticuerpos: el reagínico inespecífico y el antitreponémico específico, que se miden con pruebas no treponémicas y treponémicas respectivamente. Las pruebas no treponémicas (VDRL y RPR) detectan la reagina (IgM o IgG), contra el material lipídico liberado por el daño celular de la célula hospedera, también contra el material lipoprotéico y posiblemente contra las cardiolipinas liberadas por los treponemas. Estos anticuerpos no son producidos únicamente como consecuencia de la sífilis o de las otras Treponematosis, sino que pueden ocurrir como respuesta a enfermedades de naturaleza aguda o crónica que dañan los tejidos. Entre las pruebas Treponémicas se encuentra el FTA ABS y/o MHA-TP. Estas pruebas son de utilidad principalmente para verificar los resultados de las pruebas no treponémicas. También se pueden utilizar para confirmar un diagnóstico clínico de sífilis cuando las pruebas no treponémicas no son reactivas, pero existen evidencias de Sífilis, como puede ocurrir en la sífilis tardía. PRUEBAS NO TREPONÉMICAS (VDRL, RPR) VDRL (fundamento) El antígeno VDRL es un preparado no treponémico especialmente diseñado para la detección y semi-cuantificación en porta de reaginas plasmáticas, un grupo de anticuerpos dirigidos contra componentes tisulares producidos por los pacientes infectados por T. pallidum. En la prueba de VDRL, el suero del paciente se mezcla con un antígeno, que es una solución buffer salina de cardiolipina y lecitina adosadas a partículas de colesterol. Esta prueba se puede realizar en lámina y ser observada al microscopio como un precipitado de partículas finas (floculación). Los resultados de VDRL en lámina son reportados como reactivos y no reactivos. Todos los sueros reactivos se diluyen seriadamente, a cada dilución se le realiza la prueba de VDRL y se registra el título máximo obtenido.

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RPR (fundamento) La prueba rápida para la detección de reaginas plasmáticas (RPR) es una técnica no treponémica para la detección serológica de la sífilis. El antígeno -una suspensión de micro partículas de carbón sensibilizadas con lípidos complejos (cardiolipina, lecitina, colesterol), aglutina en presencia de reaginas, anticuerpos presentes en el suero de pacientes afectados por sífilis. Si la muestra es positiva se observa pequeños grumos negros (floculación). El resultado se reporta como reactivo o no reactivo; todos aquellos reactivos deben ser diluidos seriadamente para realizar la titulación, y se reporta la dilución más alta que exhibe reacción 2. NECESIDAD  Reconocer las reacciones de floculación como una herramienta para visualizar una reacción antígeno – anticuerpo, utilizando como modelo el VDRL y RPR.  Manejar el procedimiento para realizar una prueba floculación y su visualización. 3. OBJETO DE ESTUDIO FLOCULACIÖN: VDRL, RPR 4. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA 4.1 Comprender el fundamento de la floculación y sus aplicaciones: para determinar la presencia de anticuerpos no treponémicos mediante pruebas de floculación microscópica (VDRL) y pruebas de floculación macroscópica (RPR). 4.2 Interpretar en forma adecuada las pruebas de floculación microscópica y macroscópica. 4.3 Realizar correctamente la determinación de ASTO PCR y RA. 4.4 Realizar correctamente los cálculos para obtener el resultado a informar. 4.5 Interpretar los resultados obtenidos en dicha práctica. 4.6 Aplicar las normas generales de bioseguridad y el manejo adecuado de los materiales utilizados en ésta práctica. 4.7 Demostrar disponibilidad de trabajo e interés por el tema a desarrollar en la práctica de laboratorio. 5. COMPETENCIAS 5.1 Aplica las normas de bioseguridad dentro del laboratorio. 5.2 Conoce y comprende el fundamento de las pruebas de floculación utilizadas como modelo en la práctica. 5.3 Realiza de forma adecuada el manejo de material, equipos, y procesamiento de muestra para la realización de la prueba de VDRL y RPR 5.4 Interpreta de forma correcta la presencia o ausencia de aglutinación.

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6. PRELABORATORIO 6.1 ¿Qué son Ac no treponemicos y treponemicos? 6.2 ¿Qué es floculación? Descríbala. 6.3 ¿Por qué se dice que la prueba de VDRL y RPR son pruebas presuntivas? 6.4 ¿A qué se debe el fenómeno de prozona y postzona? 6.5 ¿Qué afecciones (diferente de Sífilis) pueden provocar reactividad del VDRL y RPR? 6.6 ¿En el caso de VDRL y RPR que títulos de Ac tienen significado clínico? 7. MATERIALES Y REACTIVOS              

Portas o placas de vidrio con círculos de 14 mm de diámetro. Placas fondo blanco. Pipetas automáticas Puntas para pipetas automáticas Kit (VDRL, RPR) Recipiente para desechos Solución salina 0.85% Palillos Agitador mecánico Microscopio Bata Guantes Panola (franela) para limpiar microscopio Papel absorbente.

Muestra: suero 8. PROCEDIMIENTO Interprete el fundamento de cada una de las pruebas a realizar (Inserto). Realizar el procedimiento de acuerdo con las indicaciones del kit comercial.

9. POSTLABORATORIO 9.1. ¿Qué diferencia existe entre la reactividad del VDRL y RPR? 9.2. ¿En qué casos un paciente con sífilis puede tener una prueba serológica no reactiva?

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA 9.3. ¿En qué otras pruebas es utilizada la técnica de floculación? 9.4. Consulte cual o cuales son las pruebas diagnósticas específicas para Sífilis. 9.5. Porque se debe diluir el LCR para realizar el VDRL 9.6. CASO CLÍNICO: Mujer de 24 años de edad, acude al servicio de urgencias del Hospital por fiebre, nódulos linfáticos inflamados y manchas irregulares en la piel, más visibles en la palma de las manos y en la planta de los pies. Refiere una lesión de pequeño tamaño, translucida de color pardo-grisáceo en la parte interna de su labio inferior. El médico reconoce el rash cutáneo de las palmas y de las plantas y la lesión en el labio y le pregunta a la paciente acerca de sus hábitos sexuales y manifiesto que su última relación sexual, fue un contacto ocasional, sin protección, hace 10 meses en una fiesta. Debido a lo anterior el médico ordenó practicarle en el laboratorio una prueba serológica para sífilis la cual fue reportada como Reactiva 1/32. Teniendo en cuenta estos antecedentes, Conteste: A) Que Prueba le fue realizada a la paciente? B) Con base a este resultado se podría dar un diagnóstico definitivo de sífilis? Sustente su respuesta. C) Qué pruebas haría usted para confirmar este resultado y porque? D) Cual o cuales cree usted que fueron las causas para que la paciente no acudiera al medico en la fase temprana de la Sífilis? E) En caso que esta joven este embarazada, ¿qué probabilidad existe que su hijo padezca Sífilis y cuál sería el procedimiento a realizar en este caso? BIBLIOGRAFÍA William Rojas M. Inmunología. Medellín, Colombia.Corporación para investigaciones Biológicas CIB. Goldsby Richard, Kindt Tomas, Osborne Barbara, Kubt Janis. Inmunología. Mexico. Mc Graw Hill. Guías Básicas Corerelación Clínica-VII semestre-H. Diez, O Bact, M.Sc S,FLORENTINO, M.F.GUTIERREZ,N,S RUEDA.La Inmunología en el Diagnóstico.

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Solución 6. PRELABORATORIO 6.1 ¿Qué son Ac no treponemicos y treponemicos? R/= 6.2 ¿Qué es floculación? Descríbala. R/= 6.3 ¿Por qué se dice que la prueba de VDRL y RPR son pruebas presuntivas? R/= 6.4 ¿A qué se debe el fenómeno de prozona y postzona? R/= 6.5 ¿Qué afecciones (diferente de Sífilis) pueden provocar reactividad del VDRL y RPR? R/= 6.6 ¿En el caso de VDRL y RPR que títulos de Ac tienen significado clínico? R/= 9. POSTLABORATORIO 9.1. ¿Qué diferencia existe entre la reactividad del VDRL y RPR? R/= 9.2. ¿En qué casos un paciente con sífilis puede tener una prueba serológica no reactiva? R/= 9.3. ¿En qué otras pruebas es utilizada la técnica de floculación? R/= Además de la prueba de VDRL y de la RPR existen otros métodos en los que también se hace uso de la técnica de floculación tales como TPHA y TPPA. 9.4. Consulte cual o cuales son las pruebas diagnósticas específicas para Sífilis. R/= Las pruebas diagnósticas que son específicas para Sífilis son:

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Inmunofluorescencia directa: Esta prueba es realizada en un microscopio de fluorescencia a campo oscuro y se basa en un examen en el cual se puede detectar la presencia de Treponema pallidum en fluidos corporales, tejidos, secreciones o exudados de lesiones.



Prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS): Se realiza a partir de una muestra de sangre o líquido cefalorraquídeo del paciente en la que se busca detectar anticuerpos contra Treponema pallidum y es considerada la prueba confirmatoria por excelencia.



Prueba de Micro Hemoaglutinación del Treponema pallidum (MHA-TP): Se basa en el principio de micro aglutinación y se realiza por medio d el suero del paciente el cual es

mezclado con un diluyente-absorbente hecho a base de treponemas de Reiter y tampones estabilizadores. 

Prueba ELISA: Es un método de cuantificación inmunológica que evalúa la reacción antígeno-anticuerpo mediante una reacción enzimática, según el diseño de la prueba se puede detectar una o más inmunoglobulinas o se puede hacer la detección de antígenos específicos- para lo cual se utiliza un conjugado, formado por un anticuerpo o un antígeno, el cual ha sido marcado con una enzima

Aunque las dos siguientes pruebas no son específicas para la Sífilis ayudan a realizar un diagnóstico cuando se sospecha de esta enfermedad, sin embargo, para llevar a cabo la confirmación y estar seguros de que el paciente la posee deben realizarse en conjunto con las pruebas mencionadas anteriormente. 

Reagina plasmática rápida (RPR): Es una prueba realizada partir de una muestra de plasma o suero del paciente en la cual se busca evaluar anticuerpos llamados reaginas plasmáticas que actúan contra antígenos no treponémicos (No es específica).



Pruebas del laboratorio de investigación de enfermedades venéreas (VDRL): Se trata de una técnica de aglutinación no treponémica la cual se realiza a partir de una muestra de suero, plasma o líquido cefalorraquídeo (No es específica).

9.5. Porque se debe diluir el LCR para realizar el VDRL R/= Se debe hacer la dilución del LCR para realizar esta prueba debido a que por exceso de anticuerpos en la muestra que interfieren en el resultado de esta dando un falso negativo, a esto se le conoce como fenómeno de prozona.

9.6. CASO CLÍNICO: Mujer de 24 años de edad, acude al servicio de urgencias del Hospital por fiebre, nódulos linfáticos inflamados y manchas irregulares en la piel, más visibles en la palma de las manos y en la planta de los pies. Refiere una lesión de pequeño tamaño, translucida de color pardo-grisáceo en la parte interna de su labio inferior. El médico reconoce el rash cutáneo de las palmas y de las plantas y la lesión en el labio y le pregunta a la paciente acerca de sus hábitos sexuales y manifiesto que su última relación sexual, fue un contacto ocasional, sin protección, hace 10 meses en una fiesta. Debido a lo anterior el

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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA médico ordenó practicarle en el laboratorio una prueba serológica para sífilis la cual fue reportada como Reactiva 1/32. Teniendo en cuenta estos antecedentes, Conteste: A) Que Prueba le fue realizada a la paciente? R/= A la paciente le fue realizada la prueba del VDRL. B) Con base a este resultado se podría dar un diagnóstico definitivo de sífilis? Sustente su respuesta. R/= C) Qué pruebas haría usted para confirmar este resultado y por qué? R/= D) Cual o cuales cree usted que fueron las causas para que la paciente no acudiera al médico en la fase temprana de la Sífilis? R/= E) En caso que esta joven este embarazada, ¿qué probabilidad existe que su hijo padezca Sífilis y cuál sería el procedimiento a realizar en este caso? R/= Referencias bibliográficas 1. Cigna individuals and families. (2017, 20 marzo). Pruebas de sífilis | Cigna. 2. Sáez Pozas, Nery, Delgado Cabrera, Caridad, Romero Ahumada, Francisco, & Báez Dueñas, Rosa María. (1997). El diagnóstico de laboratorio de la sífilis: Revisión bibliográfica. Revista Cubana de Medicina General Integral. 3. A.D.A.M. (2019, 25 agosto). Prueba de sangre FTA-ABS. 4. Arevalo Ramirez, O. (2013, mayo). Evaluación de un Inmunoensayo Cromatográfico para el Diagnóstico de Sífilis. 5. Sanguineti Díaz, C. (2000, diciembre). Pruebas de laboratorio en el diagnóstico de la sífilis. 6. V.D.R.L. (Venereal Disease Research Laboratory). (2017). 7. Alcaldía Mayor de Bogotá D.C (2017, mayo) Sifilis gestacional y congenita

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