Guio Laboratori Integrat III pràctica integrada PDF

Preview

Summary

Guió de la pràctica integrada del Laboratori Integrat III....

Description

LABORATORI INTEGRAT III PRÀCTICA INTEGRADA

GRAU DE MICROBIOLOGIA Curs 2021-2022

Assignatura impartida pel professorat de les Unitats de Bioquímica i Biologia Molecular, Immunologia i Microbiologia Campus. 1ra edició setembre 2010 2ona edició setembre 2014 3era edició setembre 2018 4a edició setembre 2019

TAULA DE CONTINGUTS DE LA PRÀCTICA INTEGRADA SESSIONS 1 i 2 Clonació i sobreexpressió ..................................................... 7 Clonació del gen d’interès .................................................... 7 Sobreexpressió de la proteïna .............................................. 9

SESSIÓ 3 Cromatografia d’afinitat ..................................................... 11

SESSIONS 4 i 5 Electroforesis de proteïnes en gels SDS-PAGE ...................15 Transferència de les proteïnes del gel a un suport sòlid ..................................................................................... 17 Detecció immunològica de proteïnes immobilitzades . .................................................................. 18

PROTOCOLS PROTOCOL 1 TRANSFORMACIÓ DE CÈL·LULES COMPETENTS DE CACL2 .......20 PROTOCOL 2 PCR DE COLÒNIA ..................................................................... 20 PROTOCOL 3 SOBREEXPRESIÓ DE PROTEÏNES DE 6-HIS TAG ........................ 21 PROTOCOL 4 PREPARACIÓ i ELECTROFORESIS DE GELS SDS-PAGE ............... 22 PROTOCOL 5 4

LLIGACIÓ D’UN GEN A UN VECTOR .........................................25 PROTOCOL 6 CROMATOGRAFIA D’AFINITAT ................................................ 25 PROTOCOL 7 TRANSFERÈNCIA A FILTRE PER A LA REALITZACIÓ DEL WESTERN BLOT ....................................................................................... 28 PROTOCOL 8 IMMUNODETECCIÓ DE LA PROTEÏNA AMB LA CUA DE 6-HIS (WESTERN BLOT) ....................................................................30

Annex 1. Preparació de solucions i reactius ............................ 32 Annex 2. Informació sobre els productes emprats .................36

5

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Pràctica integrada

L’objectiu de la pràctica integrada és aplicar els coneixements interdisciplinaris adquirits les sessions pràctiques anteriors per a la realització de l’amplificació, clonació i sobreexpressió d’un gen bacterià concret i la posterior purificació del seu producte gènic així com la detecció del mateix mitjançant la tècnica de Western Blot.

Gen d’interès

PCR

Vector sobreexpressió

Lligació

DNA cromosòmic C+

MP C-

Western

C+

MP C-

Purificació

C+

Sobreexpressió

Esquema de la pràctica integrada proposada.

6

Transformació sobre E. coli

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Sessions 1 i 2: Clonació i sobreexpressió CLONACIÓ DEL GEN D’INTERÈS 1. Amplificació del gen codificant. El gen d’interès serà introduït en el vector de sobreexpressió utilitzant les dianes adients del multicloning site (MCS) del vector. Per aquest motiu es procedirà a l’amplificació mitjançant PCR del gen d’interès des del DNA cromosòmic bacterià, usant uns oligonucleòtids corresponents que a més incorporaran en el seu extrem 5’ les dianes adients per permetre la inserció en el vector de sobreexpressió. 2. Lligació al vector de sobreexpressió. El vector de sobreexpressió que s’usarà en aquesta pràctica integrada serà el pET15b. Un vector que permet col·locar el gen d’interès sota control d’un promotor reconegut per la RNA polimerasa del bacteriòfag T7.

Fig. 1 Esquema del vector pET15b (Extret del pET system manual de Novagen)

Un cop obtingut el gen d’interès mitjançant l’amplificació per PCR es procedirà a la digestió amb els enzims de restricció adients (en aquest cas NdeI i BamHI). Igualment també es

7

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

digerirà el vector de sobreexpressió on el gen d’interès serà clonat amb els mateixos enzims de restricció. La clonació del gen en aquesta posició també permetrà la incorporació en l’extrem N-terminal del producte gènic d’una cua d’His (His·Tag) que facilitarà la purificació posterior d’aquesta proteïna mitjançant columnes d’afinitat.

Fig. 2 Multicloning site del vector de sobreexpressió pET15b (Extret del pET system manual de Novagen)

3. Transformació de la lligació sobre competents de E. coli DH5α. Un cop feta la lligació, aquesta serà transformada sobre cèl·lules competents d’E. coli DH5α i se seleccionaran aquells clons que hagin incorporat el plasmidi al seu interior sembrant la transformació en les plaques selectives adients. Donat que el vector de sobreexpressió presenta el gen bla, que confereix resistència a ampicil·lina, aquest antibiòtic serà incorporat a les plaques per a la selecció dels clons transformants.

Fig.3. Esquema del procediment de transformació de competents per CaCl 2

4. Selecció dels transformants amb la construcció pET15b amb el gen d’interès

8

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Un cop obtinguts els clons transformants és necessari seleccionar d’entre ells aquells que hagin incorporat la construcció adient, és a dir, el vector de sobreexpressió pET15b que hagi incorporat en el seu MCS el gen d’interès. Per fer-ho s’utilitzarà una tècnica ràpida de cribratge com és la PCR de colònia. 5. Obtenció del plasmidi pET15b amb el gen d’interès A partir del/s clon/s transformant/s que s’hagi/n confirmat la presència del vector de sobreexpressió amb el gen d’interès clonat es procedirà a una extracció de DNA plasmídic del mateix per a poder continuar amb el procediment experimental

SOBREEXPRESSIÓ DE LA PROTEÏNA 1. Transformació del plasmidi sobre la soca E. coli BL21 i comprovació dels clons. El plasmidi obtingut serà transformat a la soca BL21 d’E. coli, que serà la soca que permetrà la sobreexpressió del producte gènic del gen clonat ja que és portadora, en el seu genoma, de la RNA polimerasa del bacteriòfag T7, capaç de reconèixer el promotor sota el que es troba el gen d’interès. En les condicions adients es produirà un increment de la quantitat de RNA polimerasa de fag T7 i això generarà la sobreexpressió. 2. Mecanisme de sobreexpressió. El increment de la quantitat de RNA polimerasa del fag T7 i per tant la sobreexpressió del gen d’interès, està lligada a la presència en el medi de cultiu d’inductors de l’operó lactosa. En aquest cas, per a generar la sobreexpressió del producte gènic s’addiciona en el medi de cultiu del compost IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) un anàleg no hidrolitzable de la lactosa. L’IPTG interacciona amb el regulador LacI generant-li un canvi conformacional que evita la interacció d’aquest repressor amb la seva regió operadora, situada en el promotor del gen de la RNA polimerasa T7, però, a diferència de la lactosa, l’IPTG no és reconegut ni degradat per LacZ i per tant produeix una inducció constant del gen de la RNA polimerasa del fag T7 mentre està present en el medi. El increment d’aquesta polimerasa, que només reconeix el promotor que controla l’expressió del gen d’interès, produeix l’increment massiu de la seva transcripció i per tant un augment del seu producte gènic dins de la cèl·lula.

9

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Fig. 4 Esquema del sistema de control de l’expressió del gen clonat en el vector pET15b (Extret del pET system manual de Novagen)

3. Detecció de la sobreexpressió del producte gènic d’interès. La sobreexpressió de la proteïna d’interès es detecta mitjançant la càrrega en un gel SDS PAGE d’una petita mostra dels cultius tractats amb IPTG, on després de tenyir el gel ha d’aparèixer, en comparació amb la mostra no tractada, una banda incrementada de la mida corresponent al producte gènic que es pretén sobreexpressar.

Fig. 5. Imatge d’un gel SDS-PAGE on es visualitza l’increment de l’expressió gènica del gen d’interès. En la imatge es mostren les proteïnes d’un cultiu en absència (carril 1) o en presència (carril 2) d’IPTG.

10

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Sessió 3: Cromatografia d’afinitat En aquesta sessió és purificarà per mètodes cromatogràfics de la proteïna recombinant. Quantificació per mètodes espectrofotomètrics de la proteïna i càlcul del rendiment de la purificació. La cromatografia d'afinitat és un tipus particular de cromatografia d'absorció amb elevat grau d'especificitat i en la qual l’afinitat entre la molècula a purificar i un lligand que conté el medi és molt més gran, aconseguint-se una separació específica de la proteïna d’interès en un sol pas. Normalment la interacció de la molècula a purificar i el grup que s'utilitza com a lligand és de tipus funcional o biològic, per exemple: enzim/inhibidor, anticòs/antigen o hormona/receptor. Aquestes unions, a més de ser específiques, han de ser reversibles. Normalment hi ha un equilibri d'associació / dissociació que es pot desplaçar cap un sentit o un altre modificant les condicions iòniques, el pH, o bé introduint elements competidors.

La fase estacionària d’una cromatografia d'afinitat està formada per una matriu inert, un braç espaiador i un lligand. La matriu ha de ser macroporosa per tal que de permetre que les macromolècules (proteïnes) accedeixin als llocs d'unió. El braç espaiador es sol introduir entre la matriu i el lligand per permetre que les proteïnes tinguin accés als llocs d'unió. Si el braç és massa curt poden haver-hi impediments estèrics i si és massa llarg s'incrementa el risc d'absorció inespecífica, en particular, de compostos hidrofòbics. En general s'observa que un braç espaiador d'una llargada de 2-10 carbonis funciona òptimament. Finalment, el lligand s'uneix al medi de suport. El tipus de reïna que es pot utilitzar és molt variable perquè depèn directament de les propietats i funcions biològiques de la proteïna que volem purificar. Per exemples, s’utilitza l’heparina per purificar factors de coagulació o la proteïna A si es volen purificar immunoglobulines.

Una cromatografia d’afinitat englobarà les següents etapes: 1) Preparació del material o reïna; 2) Empaquetament de la columna; 3) Aplicació de la mostra i unió de la proteïna que es pretén purificar (binding); 4) Rentats; 5) Elució de la proteïna unida per canvis en les condicions de binding (elució inespecífica) o per competència amb una molècula de major afinitat pel lligand (elució específica). Algunes vegades pot interessar realitzar l’etapa de binding abans que l’empaquetament, és a dir, amb la reïna en suspensió, procediment que es coneix amb el nom

11

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

de “operació per tandes” de l’anglès “batch operation”. Ni el volum de la reïna ni les dimensions de la columna no són factors importants en aquest tipus de cromatografia. En canvi, sí que ho són la capacitat d’unió de la reïna i la quantitat de proteïna que es vol purificar. El flux de la columna, durant l'aplicació de la mostra, i la seva posterior purificació pot ser una variable crítica en aquells casos en què la velocitat de la reacció d'associació i dissociació sigui baixa. De manera general és recomanable utilitzar fluxos baixos durant l'aplicació i l'elució, mentre que en els rentats es poden utilitzar fluxos més ràpids.

El sistema de purificació per afinitat de proteïnes His-Tagged s'utilitza per aïllar proteïnes amb propietats quelants. La capacitat quelant d'una proteïna està determinada per la presència d'aminoàcids com la histidina, la cisteïna o el triptòfan, les cadenes laterals dels quals poden unir ions com el Cu, Zn, Co, Ni. Aquest sistema de purificació presenta característiques de cromatografia de bescanvi iònic (doncs el grup que s'utilitza com a lligand no deixa de ser un ió) i de cromatografia d'afinitat, ja que la unió és específica entre una proteïna determinada i un grup unit a la reïna. La elució també sol ser específica, és a dir, utilitzant un agent que tingui més afinitat que la proteïna per aquests ions.

La primera reïna que es va utilitzar amb propietats quelants estava basada en l'àcid iminodiacètic, que té tres llocs d'unió a metalls (Zn, Cu, Ni). El sistema que s'utilitza en l'actualitat consisteix en una matriu basada en l'àcid nitrilotriacètic (NTA) que és capaç de retenir els ions de níquel per quatre dels sis llocs de unió del níquel, deixant dos llocs lliures per interaccionar amb les cadenes laterals dels aa de His (Fig 6). El grup NTA es pot trobar unit a diferents matrius cromatogràfiques com l'agarosa o la sílice

Fig. 6 Interacció de la cua d’histidines amb la matriu

El principi bàsic de la purificació amb el sistema 6xHis-tag es descriu a la fig 8. Es pot descriure com una primera etapa d'unió del lisat bacterià a la reïna que es pot fer amb columna o bé amb

12

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

el sistema de tandes (batch), una etapa de rentats per eliminar possibles unions no específiques i una etapa d'elució competitiva utilitzant imidazol. L’imidazol s'uneix a la reïna i competeix amb el aminoàcids d'histidina; a baixa concentració (20 mM) inhibeix les unions inespecífiques i a elevades concentracions (>100 mM) elueix la proteïna 6xhis-tagged. Per eluir la proteïna també es podria fer servir un gradient de pH, o bé utilitzar quelants del níquel com l'EDTA o l'EGTA.

Fig 7 Esquema del procés de purificació

Les proteïnes que es poden separar amb aquest sistema han de tenir en la seva seqüència una concentració important d'aminoàcids d'His. Normalment això succeeix a poques proteïnes. Aquest fet s'ha aprofitat per idear un sistema de purificació de proteïnes recombinants, en què s’haurà manipulat la seqüència d'aminoàcids de la proteïna recombinant afegint en el seu extrem N o C-terminal una cua d'histidines. Aquesta cua d'histidines (tan sols són necessàries 6

13

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

histidines) confereix a la proteïna recombinant una gran afinitat pel níquel, propietat que es aprofitada per la seva purificació en una columna de NTA-Ni com la descrita anteriorment. Normalment aquesta cua de 6 histidines en l'extrem de la proteïna no afecta ni l'estructura ni la funció de la proteïna, doncs representa un fragment molt petit de la seqüència de la proteïna. En cas que afectés (proteïnes molt petites o pèptids) i fos necessària la seva eliminació s'utilitzen proteases com la carboxipeptidasa A o rTEV proteasa per eliminar la cua de l'extrem amino o carboxi terminal, respectivament.

En aquesta sessió es purificarà la proteïna RecA, la recombinasa principal de Salmonella enterica serovar Typhimurium, el gen de la qual es troba clonada en el vector d’expressió pET15b, i que té un pes molecular de 38 Kda.

14

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

Sessions 4 i 5: Western Blot Per a confirmar la sobreexpressió i purificació del producte gènic d’interès es procedirà a l’aplicació de la tècnica de Western Blot, tècnica de gran utilitat per a detectar i semi-quantificar proteïnes en barreges complexes (com per ex. en extractes de teixits). El Western blot es basa en fer córrer l'extracte proteic en un gel SDS-PAGE per tal de separar les proteïnes incloses en un extracte mitjançant un corrent elèctric i després transferir les proteïnes separades a un suport sòlid com membranes de nitrocel·lulosa o de PVDF (polyvinylidene fluoride). Per revelar la banda on es troba la proteïna d'interès, s'usen anticossos específics que permetran visualitzar a quina banda es troba la proteïna que aquests reconeixen. Depenent de l'afinitat de l'anticòs usat, si és un anticòs monoclonal o policlonal, es poden arribar a detectar-se quantitats molt petites de proteïna (1-5 ng). En el nostre cas, la proteïna purificada serà detectada de forma indirecta mitjançant l’ús de anticossos

anti-cua

d’histidines.

(Per

informació

addicional

podeu

consultar

http://www.westernblotting.org.)

ELECTROFORESIS DE PROTEÏNES EN GELS SDS-PAGE 1.

Gels de poliacrilamida (PAGE) En aquestes pràctiques es realitzaran electroforesis que fan servir poliacrilamida com a suport per separar proteïnes. L'electroforesi en gels de poliacrilamida (PAGE) és una tècnica emprada per a separar i visualitzar proteïnes i també DNA i RNA de baix pes molecular. Els gels es formen per polimerització dels monòmers d'acrilamida CH2=CH-CO-NH2 en llargues cadenes de poliacrilamida i l'entrecreuament de les cadenes amb un reactiu bifuncional com la N, N'-metilen-bis-acrilamida CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2.

La reacció de polimerització és iniciada pel TEMED (tetrametiletilendiamida) i el persulfat amònic; aquest últim dóna lloc a un radical lliure de persulfat que a la vegada activa el TEMED. El TEMED actua com un transportador d'electrons que activa el monòmer d'acrilamida, aportant un electró desaparellat que converteix el monòmer d'acrilamida en un radical lliure. El monòmer d'acrilamida activat reaccionarà amb un altre monòmer no activat originant-se la reacció de polimerització. Qualsevol compost que actuí com a trampa de radicals lliures inhibirà la polimerització, aquest és el cas de l'oxigen atmosfèric.

15

LABORATORI INTEGRAT III – GRAU DE MICROBIOLOGIA – FACULTAT DE BIOCIÈNCIES - UAB

2.

Gels de poliacrilamida en presència de SDS En aquest cas s’usaran gels de poliacrilamida en presència de SDS (els coneguts com a gels SDS-PAGE). El pes molecular de moltes proteïnes es pot determinar per la mesura de la seva mobilitat en un gel de poliacrilamida que conté com a detergent aniònic dodecilsulfat de sodi (SDS).

Les cadenes polipeptídiques de les proteïnes perden l'estructura quan s'escalfen durant 5 minuts a 100 °C, a pH neutre, en 1%SDS i 0.1 M mercaptoetanol. Els ponts disulfur es trenquen per l'acció d'un agent reductor com el mercaptoetanol que s'unirà a les cisteïnes, i els complexes formats per les subunitats de proteïna i el SDS adquireixen una configuració de bastó. Les proteïnes sotmeses a aquest tractament es comporten com si tinguessin una forma semblant i una relació càrrega - massa idèntica. Això és degut a que la quantitat de SDS unida a la proteïna per unitat de pes és constant (1.4 g de SDS /g de proteïna). La càrrega ve doncs determinada pel SDS més que per aquella intrínseca de cada aminoàcid. Les molècules de detergent s'uneixen a la proteïna per la seva part hidrofòbica, mentre que el grup àcid del SDS queda cap a l'exterior, el que destrueix la conformació nativa de la proteïna i li confereix una càrrega superficial negativa uniforme. Ja que els complexes SDS-proteïna tindran la mateixa relació càrrega-massa, la mobilitat electroforètica de cada proteïna vindrà determinada pel número d'enllaços peptídics de la molècula; és a dir la mobilitat serà proporcional al pes molecular. El gel actua com un garbell a través del qual han de passar les molècules, les més petites trobaran més fàcilment el camí pels porus del gel: la mobilitat és més gran a mida que disminueix el pes molecular de les proteïnes. Segons el marge de pesos moleculars a estudiar cal utilitzar gels de malla diferent. En els gels de poliacrilamida la variació del grau d'entrecreuament es pot aconseguir fent variar la concentració inicial d'acrilamida. Aquí es mostren alguns exemples de les concentracions d'acrilamida (%) a emprar ...