IL Genoma DEI Procarioti PDF

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studio approfondito sul genoma dei procarioti e la loro funzione. spiegazione dettagliata e semplice....

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IL GENOMA DEI PROCARIOTI La Genetica è quella scienza che tratta i meccanismi mediante quali i caratteri vengono trasmessi da un organismo all’altro. •Il Gene può essere definito come l’entità che specifica la struttura di una singola catena polipeptidica. •Le macromolecole si distinguono in informazionali (DNA, RNA , proteine ecc.) e non informazionali.  I fenomeni genetici implicano 3 tipi di molecole informazionali: –DNA acido deossiribonucleico: depositario dell’informazione genetica –RNA acido ribonucleico: intermediario o messaggero –Proteine: entità funzionali della cellula. •In DNA e RNA l’informazione è codificata nella sequenza di basi puriniche e pirimidiniche. I microrganismi sono i sistemi più semplici su cui basarsi per studiare i fenomeni genetici. Sono usati per molti clonaggi dato che molti producono sostanze utili per la vita dell’uomo. Ad esempio i microrganismi che producono insulina, agendo geneticamente se ne aumenta notevolmente la quantità di produzione ottenendo cosi un vantaggio. Oppure per molte malattie è importante saperne la genetica per poterle combattere. Il genoma è l’apparato che detiene l’informazione genetica. In E.Coli ad esempio, il genoma è costituito da DNA organizzato in un unico cromosoma circolare libero nel citoplasma, che costituisce il nucleoide (il dna di E.Coli venne definito “theta” per via della somiglianza strutturale con la lettera greca). L’informazione genetica dei batteri può essere arricchita da elementi genetici accessori. Questi possono essere extracromosomali autoreplicanti (come i plasmidi) o integrati nel cromosoma stesso (come profagi, elementi genetici trasponibili ecc). è importante sottolineare che lo scambio genetico nei microrganismi può avvenire anche tra specie filogeneticamente distanti, anche se con bassa frequenza. Il nucleoide: nei procarioti il nucleoide ha le stesse funzioni che ha il nucleo nella cellula eucariota. Il fatto che la cellula procariote sia sprovvista di membrana non significa che il DNA si trovi disperso nel citoplasma. La cellula contiene DNA molto piu grande delle sue stesse dimensione. Ad esempio E.Coli misura 2 micron, mentre il suo dna è lungo 2 millimetri (mille volte la lunghezza del batterio). il dna infatti per esser contenuto nella cellula ha la necessità di esser ripiegato e raggomitolato occupando solo un quarto di tutto lo spazio cellulare. Questo compattamento del dna non è casuale e permette il normale svolgimento di tutte le funzioni biologiche in particolare replicazione, ricombinazione e trascrizione. Eucarioti e procarioti hanno sviluppato strategie diverse per compattare il loro DNA. Negli eucarioti il dna è avvolto da istoni e formano strutture dette nucleosomi (struttura a “collana di perle” dovuta alle proteine che si legano al dna). Nei procarioti invece data l’assenza di istoni, si sono sviluppati meccanismi di condensazione del dna diversi ma simili al loro funzionamento. Inoltre è importante sottolineare che la struttura del nucleoide varie in base alla fase di crescita del microrganismo: molto compatto durante la fase stazionario, meno compatto durante la fase esponenziale. STRUTTURA DEL DNA

Chimica del DNA: •Varie forze agiscono sulla stabilità della doppia elica di DNA •legami ad idrogeno –stabilizzano Relativamente deboli ma aggiungono e facilitano lo “stacking”; •interazioni elettrostatiche –destabilizzano maggior contributo da parte dei fosfati (negativi) agiscono su le interazioni intra e inter filamento le repulsioni possono essere neutralizzate da cariche positive. Enzimi che agiscono sul DNA: nucleasi (che servono anche per nutrire il DNA e fanno anche il ploof reading, vedere se il processo procede bene), endonucleasi che tagliano all’interno ed esonucleasi che tagliano all’esterno ed endonucleasi di restrizione. Il dna si trova in una condizione di equilibrio tra lo stato superavvolto e rilassato grazie all’attività opposta di due topoisomerasi: dna girasi (topoisomerasi di tipo I, presente in tutti i procarioti) che da avvolgimenti negativi al dna, e un’altra topoisomerasi di tipo II, dna ligasi che rilassa la molecola. A volte la fisiologia del dna può variare in risposta a stress ambientali , temperatura, ph ecc ad esempio il dna di E.Coli è più superavvolgo se viene esposto ad alte temperature. Inoltre i procarioti sono organismi geneticamente aploidi cioe contengono un solo corredo cromosomico. Per anni si è pensato che i microrganismi avessero un unico grande cromosoma circolare, oggi invece sappiamo che in diverse specie vi sono piu di un cromosoma e che esistono anche cromosomi lineari, altri specie presentano ad esempio due crromosomi di cui uno lineare e uno circolare, oppure due o tre circolari di diverse dimensioni, o ancora presenza di megaplasmidi. I cromosomi lineari sono stati scoperti per la prima volta nel genere Borrelia. Per le caratteristiche della dna polimerasi, la replicazione di un cromosoma lineare puo portare problemi, che negli eucarioti vengono risolti dalla presenza di telomeri. Una caratteristica delle cellule batteriche è quella di poter variare il numero di copie dei cromosomi in base alla fase di crescita in cui si trovano: E.Coli ad esempio, in condizioni di crescita rapida presenta 2 o piu copie identiche del cromosoma, mentre nella crescita lenta solo una copia. La poliploidia, anche se raramente, è presente anche nei batteri e maggiormente negli Archea. Nei batteri, questa non dipende però da eventi sessuali in cui cellule diverse mettono in compartecipazione i loro genomi, ma da duplicazioni di un singolo genoma. Nei procarioti quasi tutto il dna è codificante, al contrario degli eucarioti dove solo una piccola parte lo è. Inoltre all’interno di una stessa specie batterica vi puo essere un grande polimorfismo, ad esempio E. Coli EDL933 è costituito da geni e da sequenze che non esistono in E. Coli K12. Anche le dimensioni del genoma variano notevolmente all’interno della stessa specie. I genomi piu grandi appartengono a specie con elevata adattabilità, mentre genomi piu piccoli sono tipici di micoplasmi o parassiti. Il genoma dei microrganismi è formato da : dei geni essenziali , che dovrebbero essere simili in tutti i batteri , e da geni addizionali utili per l’adattamento dell’organismo nell’ambiente in cui vive (quindi diversi per ogni microrganismo). La distribuzione dei geni lungo il cromosoma non è del tutto casuale, ma dipende dalla direzione in cui si muove l’apparato di replicazione. Nel cromosoma circolare infatti, distinguiamo un punto dove inizia la replicazione e uno dove finisce. Questi si trovano in posizioni diametralmente opposte e dividono il genoma in due metà. L’organizzazione del genoma in E. Coli è caratterizzata anche dalla presenza di macrodomini funzionali che sono ampie regioni di DNA dove ogni gene ha un livello di espressione regolato dalla

posizione e orientamento n cui si trova. Infatti piu un gene è vicino all’origine di replicazione, piu sarà forte il suo livello di espressione. Anche la composizioni delle basi delle due eliche non è casuale. Infatti il rapporto G/C e A/T risulta asimmetrico. (ricordiamo che A/T sono uniti da 2 legami, mentre G/C da tre, quindi i legami A/T si staccheranno piu facilmente rispetto agli altri). Isole genomiche: regioni dei cromosoma che sembrano provenire da altri batteri , spesso caratterizzate dalla presenza di sequenze ripetute. Le isole genomiche che hanno aumentato l’adattabilità dell’organismo ricevente sono state selezionate positivamente e vengono chiamate isole “fitness”. Il dna puo assumere anche forme particolari: •Forcina: all’estremità di una molecola di DNA •Ansa e stelo: Sequenze invertite ripetute •Estremità coesive: Si forma DNA circolare. Queste varie forme hanno funzioni segnale tipo bloccare o procedere con determinati processi. Elementi genetici accessori Nelle cellule batteriche oltre al genoma vero e proprio, sono anche presenti elementi genetici accessori, come plasmidi, genomi virali (batteriofagi), IS (sequenze di inserzione), trasposoni e integroni. I plasmidi e i batteriofagi possono essere presenti sia in forma libera nel citoplasma che integrati nel cromosoma batterico (gli elementi che possono esistere in entrambi i modi vengono detto episomi), mentre gli altri sono sempre presenti all’interno di un altro replicone. Alcune degli elementi integrati posso escidersi dal cromosoma diventando repliconi autonomi. I plasmidi: I plasmidi sono molecole di DNA extracromosomali capaci di replicare autonomamente rispetto al cromosoma. Possono conferire ai batteri portatori varie caratteristiche, come :  Resistenza ai metalli pesanti;  Resistenza ad antibiotici;  Capacità di utilizzare composti organici naturali complessi come fonte di carbonio ed energia;  Capacità di trasformare e metabolizzare composti xenobiotici (prodotti organici non presenti in natura);  Patogenicità. Due plasmidi diversi possono coesistere nella stessa cellula e vengono definiti compatibili se hanno funzioni accessorie uguali ma “noccioli” diversi. Mentre due plasmidi che hanno lo stesso “nocciolo” anche se differiscono per i geni accessori vengono considerati uguali e non coesistono nella stessa cellula (incompatibili) quindi al momento della divisione solo uno ne viene ereditato. I plasmidi li possiamo trovare nei Gram+, nei Gram-, negli Archea e anche nei lieviti. Il numero di plasmidi presenti all’interno della cellula può variare da poche quantità (1 o 2 massimo) e in quel caso vengono definiti plasmidi a basso numero di copie, oppure in grandi quantità (da minimo di 10 fino a un centinaio) plasmidi multicopia. In entrambi i casi i plasmidi vengono sempre ereditati ad ogni divisione cellulare, se pur con meccanismi diversi. Il loro potere codificante è, quindi, molto variabile. Alcuni plasmidi sono costituiti da pochi geni, altri da molti di piu, quindi le loro dimensioni possono variare, inoltre nella maggior parte dei casi il DNA plasmidico è circolare con doppio filamento ma puo presentarsi alle volte anche lineare. A volte quello lineare e circolare possono persistere all’interno della stessa cellula. Nei plasmidi possiamo distinguere due tipi di informazione genetica:  Quella necessaria per la replicazione del plasmidio stesso che deve essere quindi presente in tutti i plasmidi;

Quella accessoria che da al batterio caratteristici tratti fenotipici. Questa parte accessoria puo essere acquisita o persa dal batterio con estrema facilità, infatti è una parte non è essenziale per il plasmide e di conseguenza il batterio. Vi sono plasmidi che possono condividere lo stesso “nocciolo” utile per la replicazione, ma non gli elementi accessori, o viceversa. I plasmidi hanno la capacità di trasferirsi da un batterio all’altro tramite un processo infettivo chiamato coniugazione. Si distinguono batteri coniugativi e non coniugativi. 

Quando indichiamo i plasmidi come elementi replicativi indipendente, intendiamo che essi si possono replicare indipendentemente dalla replicazione del cromosoma ma essi necessitano comunque , per la replicazione, di proteine espresse dal batterio ospite e per la traduzione si appellano all’apparato traduzionale batterico. Elementi genetici trasponibili Gli elementi genetici trasponibili sono entità genetiche dotate della capacità di cambiare localizzazione nel replicone in cui sono inseriti e di “saltare” su altri repliconi presenti nella cellula, continuando comunque a occupare la posizione originaria. Sono presenti in cromosomi, plasmidi e genomi virali di procarioti ed eucarioti. Nei procarioti, gli elementi trasponibili possono essere:   

IS : piccoli segmenti di DNA codificanti per le funzioni che ne promuovono la mobilità. (responsabili di molte mutazioni spontanee); Trasposoni: oltre alle funzioni della mobilità, codificano che per funzioni accessorie che conferiscono un particolare fenotipo all’ospite (molti di questi portano gei resistenti agli antibiotici); Batteriofagi trasponibili: hanno un’esistenza extracellulare come particelle virali.

REPLICAZIONE DEL DNA L’apparato di replicazione del DNA è detto replisoma , simile nei procarioti ed eucarioti, ed ha il compito di copiare fedelmente l’informazione contenuta nel DNA. Tale processo puo essere diviso in tre fasi:   

Un evento che determina l’inizio del processo; Una reazione intermedia che porta all’allungamento della catena del polimero; Una fase conclusiva che la interrompe e permette la terminazione del processo.

Caratteristiche generali della replicazione nei procarioti:  

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La sintesi di DNA, di batteri e virus, inizio da un punto preciso scandito da una sequenza particolare chiamato origine di replicazione, (sito ori); Con l’inizio della replicazione i due filamenti si separano portando alla formazione di una bolla a singolo filamento. Ad ogni estremità della bolla si forma una struttura biforcata, chiamata forca replicativa , su cui possono localizzarsi le proteine che costituiscono il replisoma ( ossia la macchina replicativa) che comprende la dna polimerasi. La replicazione puo procedere dal sito di inizio sia in modo unidirezionale che bidirezionale. Nella replicazione bidirezionale due forche avanzano in senso opposto e i due filamenti sono copiati man mano che la replicazione procede. Nella replicazione unidirezionale il replisoma è associato ad una

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sola delle due biforcazioni (si ha quindi una solo forca replicativa). I cromosomi batterici replicano di solito in modo bidirezionale mentre fagi e plasmidi in modo diverso. La replicazione è semiconservativa ovvero le due nuove molecole di DNA che si sono formate, sono costituite da un filamento vecchio, parentale, e uno nuovo, neo-sintetizzato. La replicazione è semidiscontinua ovvero un filamento è copiato in modo continuo per lunghi tratti, l’altro per brevi tratti discontinui adiacenti. I frammenti del DNA complementare vengono poi saldati tra loro. Il replisoma procede in modo sequenziale (processivo), molte proteine formano complessi che tendono a rimanere associati al filamento del DNA per tutto il processo di replicazione. Questo contribuisce a rendere veloce la replicazione dell’intero cromosoma.

La replicazione delle proteine. Durante la replicazione vi è il coinvolgimento di molte proteine adibite a svolgere varie funzioni: riconoscere il sito di origine, convertire il dna nella forma piu appropriata, separare i filamenti, proteggere il DNA a singolo filamento dall’attacco delle nucleasi, catalizzare la polimerizzazione dei nucleotidi, riportare il DNA replicato nella sua corretta configurazione topologica, decatenare le molecole di DNA al termine del processo ecc. inoltre ce da dire che negli eucarioti la replicazione del DNA avviene solo durante una fase specifica del ciclo cellulare (fase s), mentre nei batteri puo estendersi durante tutto il processo di divisione.

LA RICOMBINAZIONE La ricombinazione è un processo che produce riarrangiamenti tra due molecole di DNA che possono essere omologhe o non omologhe, oppure all’interno della stessa molecola generando perdita, acquisizione o sostituzione di porzioni di DNA. Trasformazione: fenomeno attraverso il quale i batteri posso catturare DNA presente all’esterno della cellula e ricombinarlo con quello del proprio cromosoma. Il processo di ricombinazione può interessare qualsiasi regione del cromosoma batterico ed è importante per molti fenomeno come la mobilità di elementi genetici accessori della cellula batterica (come plasmidi, batteriofagi ecc). questi possono passare dalla forma libera nella cellula ad essere integrati nel cromosoma batterico, o viceversa. La ricombinazione può essere: 

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Ricombinazione omologa: quella che avviene tra due filamenti di DNA i quali devono avere un alta similarità di frequenza nei tratti di DNA interessati. (Questo meccanismo interviene anche in meccanismi di riparazione del DNA). Ricombinazione non omologa: i due filamenti interessati che interagiscono tra loro non necessitano di similarità di frequenze di basi. - ricombinazione sito-specifica: è un tipo di ricombinazione non omologa ma che necessita della presenza di sequenze specifiche tra i due filamenti coinvolti.

Ricombinazione omologa: agisce su una grande varietà di substrati, coinvolge una grande varietà di enzimi e diversi meccanismi molecolari. Caratteristica fondamentale è l’omologia di sequenze tra le molecole di DNA

che vi prendono parte. (In E. Coli la ricombinazione omologa avviene grazie a specifici enzimi appartenenti al sistema Rec ). In generale, in tutti i microrganismi, il processo di ricombinazione omologa richiede : appaiamento tra molecole di DNA che devono interagire e l’intervento di due proteine specifiche RecA e SSB. Sono inoltre richiesti altri enzimi specifici della replicazione come DNA polimerasi Pol I, DNA ligasi, DNA girasi che indicano che ricombinazione e replicazione sono, nei microrganismi, meccanismi strettamente interconnessi. Ricombinazione non omologa: come abbiamo già detto sono noti due meccanismi di ricombinazione non omologa : la ricombinazione sito-specifica e la trasposizione. Questo è un meccanismo attraverso il quale tratti definiti di DNA (detti elementi trasponibili) presenti in un replicone ( che puo essere ad esempio il cromosoma batterico) si duplicano “trasponendo” la nuova copia o in nuovo sito della stessa molecola o in una diversa molecola di DNA. Inoltre nel caso della ricombinazione sito-specifica sono riconosciute sequenze specifiche su entrambi i DNA interagenti, mentre nel caso della trasposizione, l’enzima di ricombinazione è specifico solo per particolari sequenze presenti sul DNA trasponibile. Meccanismi di ricombinazione non omologa chiamati giunzione di estremità non omologhe intervengono nella riparazione diretta di rotture a doppia elica del DNA evitando alla cellula la frammentazione dei cromosomi o alterazioni come traslocazione e delezione. Inversione programmata di sequenze di DNA: Alcuni microrganismi hanno la capacità di invertire brevi regioni del proprio cromosoma. L’inversione promossa da ricombinazione sito-specifica regola l’espressione dei geni che sono portati dalla regione invertibile in modo alternato. Tale gene posto in un orientamento codifica per una specifica proteina, spostato in altro orientamento , codifica per tutt’altra proteina ( o nessuna proteina). La loro posizione quindi caratterizza la loro espressione....