Informe 1 de microbio - Observación de bacterias utilizando el método de tinción simple PDF

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Observación de bacterias utilizando el método de tinción simple...

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FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA TEMA: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS Día 1: Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción. Tinción simple con colorantes básicos. INFORME DE PRACTICA N° 1

INTEGRANTES: o 20171106 - Jala Quecara, Maria Gracia Alice. o 20171116 - Quispe Ccoyllo, Monica Doris. o 20171118 - Rodriguez Bonifacio, Martha Verónica Karina. o 20171123 - Valverde Villanueva, Elias Oligario. MESA: N° 3

2019-I

I. INTRODUCCIÓN La microbiología es el estudio de los microorganismos, un grupo amplio y diverso de organismo microscópicos que existen como células aisladas o asociadas; también incluye el estudio de los virus, que son microscópicos, pero no celulares. El dominio Bacteria , un tipo de microorganismos, contiene una enorme variedad de procariotas. Todos los procariotas conocidos causantes de enfermedades (patógenos) pertenecen a Bacteria, así como miles de especies no patógenas, y en este dominio se presenta gran variedad de morfologías y fisiologías. (Madigan et al.,  2004, p.1,29) En la división Proteobacteria , la más amplia, se encuentran muchas bacterias, como Escherichia coli , el organismo modelo por excelencia en fisiología microbiana, bioquímica y biología molecular. La línea de Bacteria Gram positivas contiene especies unidas por una filogenia común y una estructura similar de la pared celular. Aquí encontramos a Bacillus formadores de endosporas (son muy resistentes al calor, compuestos químicos y radiación). Tiene forma de bacilo (forma de barra o vara). También están en este grupo las bacterias del ácido láctico, habitantes comunes de materias vegetales en descomposición y de productos lácteos, en los que se incluyen organismos tales como Streptocuccus . Estos tienen una forma esférica que se presenta en cadenas. Con frecuencia se presentan en productos lácteos y algunos son patógenos muy potentes. (Madigan et al., 2004, p.29-31) En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. Para esta presente práctica se usó la fijación por calor, que preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. (Vázquez, C. et al. 2010) La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán. Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas. (Vázquez, C. et al. 2010) El objetivo de esta primera práctica de laboratorio de Microbiología es: “observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos aplicando un método simple de tinción”. Este método se caracteriza porque solo se usa un reactivo en la fijación de la muestra. II.MARCO TEÓRICO 2.1 Observación al microscopio El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético (Santambrosio, 2009).

Figura 1. Partes principales de un microscopio óptico.

Fuente: Santambrosio, 2009. 2.1.1 Microscopio óptico Los microscopios ópticos generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces. Las lentes de un microscopio óptico son el colector, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final (Santambrosio, 2009). Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador. La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. En general, los aumentos del objetivo son 10x, 40x y 100x (objetivo de inmersión) y los del ocular 5x, 10x y 15x. Por lo tanto, si se trabaja con un ocular de 10x y un objetivo de 100x, el aumento total será 10 x 100 = 1000 veces el tamaño original (Santambrosio, 2009). El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento. Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es, la distancia mínima a la que se pueden ver dos objetos separados. Viene definido por una fórmula en la que las principales variables son la longitud de onda de la luz y la apertura numérica del objetivo, pero en la práctica, y asumiendo la máxima calidad de las lentes, es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz con la que se observa (Santambrosio, 2009).

Figura 2. Lentes de un microscopio óptico.

Fuente: Santambrosio, 2009. 2.1.2 Apertura numérica. Es la capacidad de recoger luz de una lente. Para lentes secas su valor máximo es de 1, pero por las limitaciones físicas de la calidad de las lentes, raras veces sobrepasan el valor de 0,95. Cuanto mayor sea la apertura podremos conseguir mayor resolución y brillo en la imagen. Si queremos usar lentes con una apertura mayor de 1 (máximo 1,6) estas deben ser de inmersión en aceite con el mismo índice de refracción que la lente (Santambrosio, 2009). Figura 3. Apertura numérica de un microscopio compuesto.

Fuente: Santambrosio, 2009. 2.2 Tinción La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno, por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste , lo que depende de la carga de la célula y del

colorante. En otras palabras, el uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. Además, en la Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas (Vázquez, et al.  , 2010). De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes articiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la región ultravioleta o visible y un auxócromo que son grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensicar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados (López, et al.  ,2014). 2.2.1 Fijación de muestra La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares (Vázquez, et al . , 2010). Figura 4. Preparación de un extendido o frotis y tinción simple.

Fuente: Reynoso, et al . , 2015. 2.2.2 Tipos de colorantes Según Vázquez, et al. (2010), los colorantes pueden ser de tres tipos: el primero, es el catión, que son sustancias que tienen carga positiva. Es decir, se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción

coloreada) de la molécula está cargada positivamente, pues cuando penetre en el interior de la célula, las tiñera, como por ejemplo, cristal violeta, safranina y azul de metileno son colorantes básicos. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces. El segundo, son los aniones, tienen carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Podrían ser la eosina y nigrosina. El tercero, son liposolubles que se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen, como por ejemplo el negro sudán (Atlas de histología vegetal y animal, s.f). 2.2.2.1 Fucsina Las micobacterias presentan una elevada proporción de cera y lípidos en la pared celular, por lo que absorben los colorantes sólo de forma muy lenta. Normalmente, la solución de carbolfucsina (fucsina fenicada) aplicada al preparado es calentada hasta que se forma vapor para acelerar de esta manera la absorción del colorante de fucsina y, por consiguiente, la formación del complejo micolato-fucsina en la pared celular. Si se utiliza la solución carbolfucsina de Kinyoun se hace superfluo realizar un proceso de calentamiento. De esta manera se evita la liberación de los perjudiciales vapores fenólicos. Una vez absorbido el colorante de fucsina por las micobacterias, será prácticamente imposible conseguir la decoloración (Hewitt y Vincent, 1989). 2.2.2.2 Azul de metileno El azul de metileno es un colorante simple, donde químicamente constituye la sal cloruro de azul de metileno que se disocia. Además, este colorante reside en el ion cargado positivamente (Horobin y Kiernan, 2002). Cloruro de azul de metileno = azul de metileno + + Cloruro-

2.2.2.3 Cristal de violeta El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram (Horobin y Kiernan, 2002). Figura 5. Estructura química del cristal violeta.

Fuente: Vázquez, et al. , 2010. 2.2.3

 Clasificación de tinciones

2.2.3.1 S  imples. Utilizan un solo colorante que sirve solo para denotar la morfología celular. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). 2.2.3.2 D  iferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante. 2.2.3.3 S  electivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Por ejemplo, la tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares y de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes. Figura 6. Visualización de la morfología de las bacterias, después de haberse agregado colorantes.

Fuente: Vázquez, et al. , 2010. 2.3 Esterilización Los microorganismos se encuentran bajo la influencia de factores físicos y químicos, los cuales ejercen en su crecimiento y desarrollo un efecto decisivo, favorable o desfavorable. Los principios que rigen los mecanismos de acción (físicos, químicos y mecánicos) son herramientas utilizadas en el control del crecimiento microbiano y sirven de base a las prácticas de esterilización, desinfección, antisepsia y sanitización (Reynoso, et al.  , 2015).

La esterilización es un método que logra separar a los microorganismos contaminantes indeseables mediante agentes químicos, físicos o mecánicos. El término destrucción, en este caso, significa la pérdida de viabilidad del microorganismos. La destrucción de microorganismos se puede llevar a cabo por varios métodos: 1. Agentes físicos. 2. Agentes químicos. 3.Agentes Mecánicos. El método más utilizado comúnmente es del calor, ya que es simple, confiable y económico (Vázquez, et al.  , 2007). Figura 7. Tipos de métodos de la esterilización de microbios.

Fuente: Reynoso, et al . , 2015. 2.3.1 Temperatura Los microorganismos viven dentro de rangos amplios de temperatura, variable para cada especie microbiana, distinguiéndose dos límites (superior e inferior) denominados temperatura máxima, y temperatura mínima, respectivamente. La actividad máxima de los sistemas enzimáticos de los seres vivos se alcanza a una temperatura óptima que determina la velocidad de crecimiento. La velocidad de crecimiento desciende bruscamente después del límite superior de temperatura. El descenso rápido a temperatura elevada es debido a la desnaturalización térmica de las proteínas enzimáticas y de las estructuras celulares con constituyentes proteicos (membrana). Por ello, el calor es el agente letal más ampliamente utilizado en la esterilización. Su acción esterilizante depende de su naturaleza, intensidad y tiempo de aplicación; del grado de humedad y del pH del medio y de la susceptibilidad diferencial a la temperatura, de cada microorganismo en particular (Vázquez, et al . , 2007). 2.3.2 Calor seco El calor seco requiere mayor duración e intensidad, con respecto al calor húmedo, cuando es empleado como agente esterilizante, porque la conducción del calor es menor en el aire que en el vapor. Además, en ausencia de agua, la estructura nativa de una proteína está estabilizada por puentes hidrógeno y enlaces disulfuro. En este estado, la resistencia al calor de las células bacterianas y de las endosporas en estado de desecación es mayor. El calor seco destruye los microorganismos por oxidación de sus constituyentes intracelulares. Se puede utilizar al flameado o calor directo, donde los materiales se calientan a la llama de un mechero Bunsen. El procedimiento se realiza a temperaturas mayores de 200 ºC durante minutos o segundos (Vázquez, et al . , 2007).

2.4 Medio de cultivo La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Cuando el medio de cultivo está debidamente preparado se procede a inocular la muestra deseada. Dependiendo del estado físico del medio de cultivo (líquido, sólido o semisólido) la siembra se puede realizar con: ansa en anillo, ansa en punta, varilla de vidrio (espátula de Drigalsky), hisopo o pipeta estéril. El ansa de siembra consta de un filamento de platino, que puede ser recto o en anillo. Para facilitar el manejo, este filamento está sujeto a un mango aislante (Torres, 2016). Figura 8. Tipos de ansa de siembra.

Fuente: Reynoso, et al . , 2015. El cultivo en medios sólidos, donde se siembra en estrías, por lo que se debe tomar en cuenta que antes de poner en contacto el ansa de siembra con los microorganismo debe ser esterilizada para evitar contaminaciones. Al pasar ese paso, se toma el material con ansa en anillo y se siembra en estrías en un tubo que contiene agar pico de flauta o agar inclinado. Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y aerobios facultativos (Torres, 2016). Figura 9. Siembra en estrías (medio sólido).

Fuente: Reynoso, et al . , 2015. 2.5 Bacterias que pueden ser teñidas con colorantes básicos

2.5.1 Bacillus sp. El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, es un género que hoy en día incluye más de 60 especies de bacilos. Este género está formado por microorganismos bacilares Gram positivos, formadores de endosporas, quimioheterótrofos que normalmente son móviles y rodeados de flagelos peritricos. Son anaerobios o aerobios facultativos son catalasa positivos. Las células bacterianas de este género tienen un amplio tamaño que varía 0,5 a 2,5 µm x 1,2-10 µm. Este género se encuentra comúnmente en suelos y plantas donde tienen un papel importante en ciclo del carbono y el nitrógeno. Son habitantes comunes de aguas frescas y estancadas, son particularmente activos en sedimentos (Koneman, 2001). Figura 10. Bacillus thurringiensis. Observación de esporas elipsoidales y centrales que no deforman el bacilo.

Fuente: Realpe, 2002. 2.5.2 Escherichia Coli E. coli se caracteriza por poseer bacilos Gram negativos, no esporulante, producción de indol a partir de triptófano, no utilización de citrato como fuente de carbono y no producción de acetoína. Además, fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas. Además, la cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico constituido por péptido-glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas (Realpe, 2002). E. coli es una bacteria mesófila, su óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35-43 ºC). La temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica que un control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial para evitar el crecimiento de E. coli en los alimentos. La congelación tiene pocos efectos sobre la población de E. coli en el alimento, y no garantiza la destrucción de un número suficiente de bacterias viables para asegurar su inocuidad. Sin embargo, E. coli es sensible a temperaturas superiores a 70 ºC, a partir de la cual son fácilmente eliminadas (Realpe, 2002). Figura 11. Escherichia Coli: características morfológicas.

Fuente: google imágenes 2.5.3 Staphylococcus sp. Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios bacteriológicos, en cultivos pueden aparecer rápidamente generando así ser tratadas con antibióticos por el cual sería eliminada su crecimiento es mejor en el medio sal manitol y agar sangre. Es un coco anaerobio facultativo, esto significa que puede crecer tanto en condiciones con oxígeno como carente de éste. Su mayor...