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DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE MONOSACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS UTILIZANDO CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 1

Mario Alejandro Bonilla Bonilla: Universidad Distrital Francisco José de Caldas Proyecto curricular de Licenciatura en Química 1 Estudiantes Bioquímica, 2Profesora Bogotá D. C., 20 de abril de 2016. RESUMEN: Este informe presenta los resultados obtenidos en la determinación cualitativa de monosacáridos y disacáridos usando la técnica de cromatografía en capa fina. En placas de silica gel se sembró una serie de azucares patrones, una muestra problema de orina, de yacon, fruta natural, Kiwi y edulcorante estevia, la placa fue sometida en una fase móvil con el solvente mezcla de butanol, ácido acético y agua. Luego de producido el arrastre de los azucares se revelo la placa con ácido sulfúrico y naftalendiol. Posterior se determinó el Rf de los azucares patrón y se comparó con su equivalente en la literatura. De igual modo se identificó los azucares en las muestras problemas y se elucidaron por comparación con los patrones. Se encontró que la muestra problema de orina presentaba el monosacárido galactosa. 1, 2

PALABRAS CLAVES: Cromatografía en capa fina, Análisis cualitativo de carbohidratos, Factor de retención, Azúcares en orina, Polaridad de azucares INTRODUCCIÓN Los carbohidratos son uno de los componentes más importantes en muchos alimentos. Los hidratos de carbono pueden estar presentes como moléculas aisladas o pueden estar físicamente o químicamente asociados a otras moléculas. Algunos carbohidratos son digeribles por los seres humanos y por lo tanto proporcionan una importante fuente de energía, mientras que otros son indigestible y por lo tanto no proporcionan energía. Además de ser una fuente importante de energía y fibra dietética, los hidratos de carbono también contribuyen a la dulzura, apariencia y características de textura de muchos alimentos. Un gran número de técnicas de análisis han sido desarrollados para medir la

concentración total y el tipo de azucares presentes en los alimentos y en muestra biológicas. Los métodos cromatográficos son las técnicas analíticas más poderosas para el análisis cualitativo y cuantitativo de monosacáridos y oligosacáridos. La cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se usan comúnmente para separar e identificar los carbohidratos. Los glúcidos se separan por sus características diferenciales de adsorción haciendo pasar la solución a analizar a través de una columna. Los hidratos de carbono se pueden separar e identificar con base en sus coeficientes de reparto, polaridades o tamaños, dependiendo del tipo de técnica cromatografica.

Tabla 1. Tipos de cromatografía [1] [2] TIPO DE CROMATOGRAFÍA

FUNDAMENTO

UTILIDAD Y APLICACIONES

La fase móvil se desplaza por la fase Cromatografía en papel estacionaria, llevando las muestras con Fase móvil: Líquido ella. Los componentes de la muestra se Fase Estacionaria: separarán de acuerdo con la fuerza con Papel de celulosa. que se adsorben en la fase estacionaria El proceso es similar a la Cromatografía en capa cromatografía en papel con la ventaja fina de separar más rápido, dar mejores Fase móvil: Líquido separaciones, y la posibilidad de Fase Estacionaria: Gel elección entre diferentes fases de sílice o alúmina. estacionarias. El proceso de separación se lleva a Cromatografía de gases cabo entre una fase estacionaria líquida Fase móvil: Gas y una fase móvil de gas, la columna a Fase Estacionaria: través del cual pasa la fase de gas se Columnas capilares de encuentra en un horno donde la sílice fundida, con temperatura puede ser controlada, recubrimientos internos similar a la destilación fraccionada se de varios tipos de separan los componentes de la mezcla siloxanos enlazados. basados en el punto de ebullición. Consiste en el uso de una fase Cromatografía líquida estacionaria hidrofóbica empleando en fase reversa una fase móvil polar. Como resultado, Fase móvil: Líquido las moléculas hidrófobas en la fase (polar) móvil polar tienden a retenerse en la Fase Estacionaria: fase estacionaria hidrófoba, y las Relleno de siloxano de octilo o siloxano de moléculas hidrofílicas en la fase móvil pasarán a través de la columna sin octadecilo. retenerse. Cromatografía de Las moléculas en solución se separan por su tamaño, y en algunos casos el exclusión Fase móvil: Líquido peso molecular. Las moléculas más (menos polar) grandes simplemente pasan por los Fase Estacionaria: poros porque esas moléculas son Relleno de pequeñas demasiado grandes para entrar en los poros. partículas de Cromatografía líquida Esta cromatografía retiene analitos de naturaleza iónica en la columna en de intercambio iónico Fase móvil: Líquido función de interacciones eléctricas. Este tipo de cromatografía (polar) Fase Estacionaria: se subdivide en cromatografía de Resinas de intercambio intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico. iónico. Tipo de separación bioquímica de mezclas a base de una interacción Cromatografía de altamente específica, como la que existe entre antígeno y anticuerpo, afinidad Fase móvil: Liquido enzima y sustrato o receptor y ligando. Fase Estacionaria: Gel: El proceso es un atrapamiento, de la agarosa molécula objetivo en una fase sólida o estacionaria con la cual comparte alguna afinidad.

Es útil para la separación de mezclas complejas de compuestos que tienen polaridad similar como los aminoácidos. Sirve para determinar la pureza. Se puede utilizar para controlar el progreso de una reacción, identificar los compuestos presentes en una mezcla y determinar la pureza de una sustancia. Se usa en análisis de caramidas y ácidos grasos. Es usada para separar y analizar compuestos que pueden ser vaporizados sin descomposición. Los usos típicos de incluyen pruebas de la pureza de una sustancia, o la separación de los diferentes componentes de una mezcla, se utiliza ampliamente en la ciencia forense

No se utiliza típicamente para la separación de proteínas, debido a que los disolventes orgánicos utilizados pueden desnaturalizar muchas proteínas.

Se aplica generalmente a las moléculas grandes o complejos macromoleculares, tales como proteínas y polímeros industriales. La principal es el fraccionamiento de proteínas y otros polímeros solubles en agua. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. Permite el ensayo cuantitativo de electrolitos y aditivos patentados de galvanoplastia. Sirve para purificar y concentrar una sustancia de una mezcla en una solución de amortiguación o enzimática. Permite discernir los compuestos biológicos en una sustancia particular

Factores que influyen en la separación por cromatografía Los resultados de la ejecución de un método de cromatografía, como lo son el factor de retención, y el número de sustancias aisladas pueden verse afectadas por muchos factores: Temperatura: La temperatura del disolvente y la placa influyen en la velocidad de elución y retención, en general a temperaturas muy bajas el solvente no arrastra las sustancias ya que no las solubiliza, contrario a mayores temperaturas se produce un mayor arrastre. Técnica de siembra: La forma en la que se hace el sembrado de la muestra sobre la placa influye en la separación, si se aplica en exceso o es insuficiente la cantidad de muestra, o si se siembra de manera dispersa o de manera aglomerad influye en el factor de retención. Solvente: el solvente también tiene un impacto sustancial sobre el valor de retención de la sustancia a analizar. Los solventes que se utilizan a pesar que comparten una naturaleza química similar siendo generalmente apolares (o apolares en la cromatografía reversa) sin embargo difieren en su momento dipolar por lo que algunos arrastran con más facilidad la sustancia que otros. Inclusive se suele utilizar mezclas de solventes puros lo que cambian sus propiedades de polaridad generando unas nuevas. Placa de cromatografía: Las placas de cromatografía se pueden recubrir con una variedad de absorbentes sólidos; los más frecuentemente de silicio o de aluminio. El absorbente puede cambiar en gran medida el factor de retención, dependiendo de su naturaleza. Por otra parte, el espesor y la uniformidad de la

capa absorbente pueden variar de una placa a otra, particularmente si se hace a mano. [3] Fuerzas intermoleculares cromatografía [1]

en

Los procesos de cromatografía involucran diferentes tipos de fuerzas intermoleculares entre las sustancias participantes como lo son: interacciones iónicas, ion-dipolo, enlaces de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas: Interacciones ion-ion: Ocurre cuando existe dos tipos de partículas iónicas de cargas opuestas interaccionando entre sí, es decir, tanto el analizo y el eluyente o la fase estacionaria se encuentran cargados y por atracción de cargas producen la interacción. Es característica en cromatografía iónica. Interacción ion- dipolo permanente: Ocurre cuando una de las moléculas es un ion mientras otra es un dipolo, si bien el dipolo no presenta carga si posee la propiedad de ser atraído a un campo magnético por la presencia de fuerzas polares. Esta interacción es común en cromatografía liquida de adsorción donde el analito es una sustancia iónica y la fase móvil es una sustancia polar. Interacción ion-dipolo inducido: Esta es la interacción menos común en cromatografía ya que implica la presencia de un ion con la suficiente fuerza para inducir un momento dipolar en una sustancia neutra. Interacciones de Van der Waals: Estas interacciones generalmente se subdividen en tres tipos: fuerzas dipolo-dipolo, que ocurren entre dos sustancias polares; dipolo-dipolo inducido, cuando la interacción se da entre moléculas polares y no polares; e interacciones dipolo

inducido-dipolo inducido o de London que ocurre entre sustancias apolares. Puentes de hidrogeno: Ocurre cuando el hidrogeno se localiza entre dos átomos muy electronegativos tal como oxígeno, nitrógeno o flúor. Esta interacción es común en cromatografía cuando se establece una interacción entre analitos polares y soportes o eluyentes adsorbentes hidrofílicos. Factor de retención (Rf y Rx) El valor de Rf se define como la relación de la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida por el solvente (conocido como el frente del solvente) a lo largo del papel, ambas distancias se miden desde el origen que es el punto de aplicación o de siembra de la muestra, generalmente en centímetros: Rf =

Distancia recorrida analito Distanca recorrida solvente

Debido al hecho de que el frente del solvente es siempre mayor que la distancia recorrida por el soluto, los valores de Rf es ubica entre 0 - un extremo donde el soluto permanece fijo en su origen y 1 - el otro extremo en el que el soluto es tan soluble que se mueve igual que el solvente. Los valores Rf no tienen unidades, ya que son una relación de distancias. El valor de Rf a menudo sirve para la identificación de sustancias, si bien varias sustancias pueden presentar un mismo valor en un determinado solvente, el conjunto de valores de Rf de un mismo compuesto en variados solventes lo pueden distinguir y particularizar. Aplicación de la CCF en el análisis cuantitativo

La técnica de cromatografía en capa fina que es esencialmente una técnica de análisis cualitativo puede usarse como una técnica cuantitativa no muy exacta pero que puede permitir una elucidación superficial de la concentración de los compuestos a analizar. El método se basa en la observación y comparación del tamaño e intensidad de color de las manchas en relación con una serie de patrones que son diluciones de concentración conocida del analito al cual se le ejecuta el mismo procedimiento cromatográfico. Se suele utilizar diferentes conjuntos de patrones de calibración, uno inicial con concentraciones con intervalos muy grandes, que permiten detectar un rango de concentración en este rango se construye otro conjunto de patrones de menor intervalo de concentraciones que permitirán acercarse cada vez más a la concentración real. Este procedimiento comparativo visual puede dar resultados cuantitativos con una precisión de aproximadamente +/10%. Cromatografía de capa fina como cromatografía preparativa La cromatografía preparativa en capa fina es una técnica útil para la purificación de pequeñas cantidades de muestra. Debido a que permite una rápida separación de componentes en una mezcla de reacción, es especialmente útil para obtener un perfil de los productos de una reacción o los componentes de extractos naturales. Generalmente sigue el mismo proceso de la CCF normal sin embargo se hace uso de componentes de mayor precisión y de carácter más analítico, como el gel de sílice o la fase estacionaria, posee una porosidad más fina. El revelado generalmente se hace por radiación UV o

por fluorescencia que han resultado muy efectivos para este fin. Métodos de revelado en CCF Existen diversos métodos de revelación de placas cromatograficas que se aplican principalmente cuando la sustancia de análisis es incolora y no presenta ningún rastro en la placa al cual se recurre a métodos químicos como el revelado con yodo, ácido sulfúrico y vainillina; y métodos físicos como el uso de un indicador fluorescente y luz UV. Luz UV: Consiste en rociar la placa con una sustancia fluorescente que tornara fluorescente toda la placa excepto en el lugar de la mancha y podrán ser observadas bajo luz UV. Vapores de yodo: consiste en colocar la placa en una cámara saturada de vapores de yodo, estos reacciona con el compuesto generando una tonalidad amarillo-marrón. Revelado con difenilamina/anilina: Cuando se utiliza el revelador de anilina, los azúcares aparecen como manchas café oscuras. El reactivo de difenilaminaanilina se ha utilizado para la detección de diferentes monosacáridos y sus derivados. En condiciones definidas, el reactivo da reacciones de color específicos y se puede utilizar para distinguir entre los azúcares de diferente estructura y para detectar diversos derivados de azúcares no reductores. [5] Análisis de oligosacáridos Para determinar la composición de carbohidratos en polímeros más complejos como los oligosacáridos, los polisacáridos y glicoproteínas uno de los métodos mas utilizados es la

cromatografía liquida de alta resolución. El análisis cuantitativo de azúcares neutros y amino se puede lograr utilizando una hidrólisis ácida y un conjunto de estándares molares de monosacáridos iguales. En este método, un oligosacárido o glicoproteína se hidroliza primero para dar los monosacáridos constituyentes, que posteriormente se separan mediante HPLC de fase inversa usando una columna desarrollado especialmente para este propósito. Este método ha demostrado ser muy sensible, que requiere sólo 1 pmol para la detección fiable. [6] (Articulo de revision: D.T. Fu, R.A. Oneill Monosaccharide Composition Analysis of Oligosaccharides and Glycoproteins by High-Performance Liquid Chromatography) Moléculas complejas de carbohidratos Debido a la estructura típica de los carbohidratos que poseen varios grupos hidroxilos, estos son propensos a ser sustituidos por otros grupos funcionales y obtener azucares modificados o moléculas más complejas. Algunas de estas pueden ser: Polisacáridos de reserva o almacenamiento, como el almidón, el glucógeno y el dextrano. Es posible que se una un grupo amino formado los glucosiaminoglucanos, que tienen gran importancia estructural en los animales vertebrados, y están muy relacionados con los proteoglicanos que resultan de la unión de la proteína con un glúcido. Son posibles también las. Glucoproteínas, que tiene un mayor porcentaje de carbohidratos, se sitúan en la superficie externa de las células animales, funcionando como enzimas, y moléculas de transporte. [5]

Tabla 2. Función y localización de carbohidratos y edulcorante CARBOHIDRATO

FUNCIÓN

LOCALIZACIÓN

6 desoxi D-glucosa

Actúa para inhibir la producción de glucosa-6-PO4 partir de la glucosa a nivel fosfoglucoisomerasa

Se ubica principalmente en hígado y páncreas inhibiendo la fosfoglucoisomerasa

L-fucosa

Tiene aplicaciones en cosmética, productos farmacéuticos y suplementos dietéticos.

Se puede encontrar en los N-glicanos de las células de mamíferos, insectos y plantas como, subunidad de fucoidina.

Ramnosa

Trabaja en la dermis para mantener las fibras de sostén y evitar el envejecimiento en la piel.

Es producida por micro algas y es también un componente de la membrana celular externa de las bacterias Mycobacterium

Manitol

Actúa como endulzante (edulcorante) común y sustituto en alimentos dietéticos; funciona como diurético

Se encuentra en una amplia variedad de productos naturales, incluyendo casi todas las plantas,

Sorbitol

Se utiliza como edulcorante en diversos productos alimentarios. Y cosméticos El sorbitol se utiliza a menudo en enjuague bucal y pasta de dientes.

Es encuentra en jarabe de maíz, pero también se encuentra en manzanas, peras, melocotones y ciruelas pasas.

Ribitol

Actúa como el grupo prostético de las coenzimas flavin-nucleótidos (FMNH2 Y FADH2).

Se puede encontrar de forma natural en algunas plantas como laAdonis vernalis, y en las paredes celulares de las bacterias Gram positivas

Meso inositol

Sirve de base para una serie de moléculas de señalización y de mensajero en procesos biológicos

Está presente naturalmente en una variedad de alimentos, como frutas, legumbres, cereales y frutos secos

Xilitol

Utilizado principalmente en la industria alimentaria como sustituto del azúcar

Se encuentra naturalmente en las fibras de muchas frutas y verduras, se encuentren hongos y bayas.

L-sorbosa

Se utiliza en la producción comercial de vitamina C (ácido ascórbico)

Se haya generalmente en frutos cítricos

Trealosa

Es un reductor natural del estrés celular que protege a organismos de estrés osmótico.

Es producida por gorgojos. Está presente en la naturaleza en los champiñones, setas, y en insectos.

Tiene la capacidad para reducir el riesgo de infección por patógenos, también tiene efectos positivos sobre

Es el oligosacárido más abundante en la leche humana en concentración de 2 g/L

L-fucosil lactosa

el sistema nervioso y la cognición.

D-manoheptulosa

Es un inhibidor de la hexoquinasa con lo cual evita la fosforilación de la glucosa lo cual inhibe su descomposición.

JUSTIFICACIÓN Los carbohidratos al ser biomoléculas necesarias para la producción de energía que el organismo requieren para la realización de las diversas actividades metabólicas y mecánicas que le permitan su supervivencia. Se hace necesario su estudio analítico en diversas sustancias que los contenga como la orina, donde se espera que su presencia sea casi nula o edulcorantes naturales y artificiales donde se presenten azucares que no causen diabetes u otras enfermedades relacionadas a los carbohidratos.

Presente en aguacates

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

METODOLOGÍA Tomada de la GUÍA Nº 6 DETERMINACIÓN DE MONOSACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS UTILIZANDO CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (Profesora: Adís Ayala) [5].

Figu ra 1.Cromatografia en capa fina ;orden de izquierda a derecha: 1.sacarosa, 2.fructosa, 3.kiwi, 4.glucosa, 5.arabinosa, 6.xilosa, 7. Yacon, 8.lactosa

Tabla 3. Concentración de azucares en muestras y estándares analizados. GRUPO

3

%CH EN mg/mL DE CH 100mL O 100g EN EXTRACTO DE FRUTA

MUESTRA

NOMBRE

fruta

kiwi

9

edulcorante

stevia

1,5

Porcentajes de carbohidratos en el kiwi Carbohidratos: 15% : fibra :6% azucares: 9% Glucosa 4,32%, fructosa: 4...