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Informe Preparación de medios de cultivos PDA y Mac Conkey 2019 2020...

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DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Asignatura:

Microbiología

Práctica:

N° 2

Grupo:

Nº 5

Fecha de realización: 08 de noviembre del 2019

Tema: Preparación de medios de cultivos PDA y MacConkey

Período Octubre 2019 – febrero 2020

I.

INTRODUCCION La primera utilización de medios de cultivos fue realizado por el micólogo

Brefeld, que cultivo y aisló hongos en medios solidos de gelatina, en el año 1878 Lister popularizo un medio de cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido, Koch introdujo el caldo de carne como medio de cultivo, en 1881 Loeffler añadió gelatina en caldo de carne logrando un medio solido trasparente ideal para observar las poblaciones microbianas, en 1882 el medico alemán Walter Hesse introduce el agaragar(polisacárido de algas rojas) como solidificante, en 1887 Petri el ayudante de Koch empieza a usar cajas Petri, en 1892 Wurtz incorporo el indicador de pH a la composición de ciertos medios[ CITATION Med12 \l 22538 ]. Para identificar a los microorganismos es usual emplear sustancias alimenticias artificiales preparadas en laboratorio llamadas Medios de Cultivo, de los cuales existen 10.000 tipos diferentes, estas sustancias deben tener los nutrientes necesarios y estar libres de organismos contaminantes, en él se observa el crecimiento de los microorganismos, a lo cual se le llama Cultivo,

para que exista un adecuado

crecimiento es necesario que reúna una serie de factores como: Temperatura, grado adecuado de alcalinidad, humedad y presión de oxigeno adecuado, y un pH neutro o ajustado a las necesidades del microorganismo[ CITATION Med12 \l 22538 ]. El agar es un medio solidificante usado para preparar medios de cultivó, el cual es licuado a temperatura de agua hirviendo y se solidifica a los 40 grados, los medios de cultivo deben contener como mínimo carbono, nitrógeno, azufre, fosforo y sales inorgánicas, en determinadas ocasiones requerirá de vitaminas y otras sustancias, los medios de cultivo deben estar estériles para evitar la aparición de formas de vida que alteren el crecimiento microbiano[ CITATION Med12 \l 22538 ]. Este trabajo fue desarrollado con el objetivo de preparar y dispersar medios de cultivo específicamente el Agar- Agar y el MacCouKey reuniendo las condiciones adecuadas para el crecimiento de los microorganismos.

II.

OBJETIVOS

2.1

General

Preparar medios de cultivo de PDA y MacCouKey. 2.2

Especifico  Emplear las técnicas y cantidades adecuadas para la preparación de los medios de cultivo.  Esterilizar los instrumentos que entraran en contacto con el medio de cultivo.  Dispensar los medios de cultivo en cajas Petri esterilizadas.

III.

REVISIÓN LITERARIA

Microorganismos Los microorganismos constituyen un grupo de seres vivos sumamente heterogéneo cuya única característica común es su reducido tamaño: todos son lo suficientemente pequeños como para pasar inadvertidos al ojo humano, siendo preciso el uso de dispositivos de aumento como el microscopio óptico o, en algunos casos, el microscopio electrónico para poder observarlos. La gran mayoría de los microorganismos son unicelulares, aunque una parte significativa de ellos tienen organización subcelular y unos pocos forman agrupaciones de células de tipo colonial sin llegar a constituir verdaderos organismos pluricelulares. [ CITATION Por14 \l 3082 ] Medios de cultivos en microbiología Uno de los sistemas más importantes para

la

identificación

microorganismos

es

observar

de su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas

en

el

laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Fuente: https://www.google.com.ec/search? biw=1366&bih=662&tbm=isch&sa=1&ei=uH 0GWuyPEMLImQGctImICg&q=medios+de+cult ivos

Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones adecuadas como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. [CITATION Med12 \l 3082 ] El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar,

porque

las

necesidades

nutricionales

varían

considerablemente. Hay

microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer. Tipos y funciones de los medios de cultivo a) Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan indispensables

para

el

crecimiento

de

microorganismos

exigentes.

Este

enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate. c) Medios selectivos: son utilizados para favoreces el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste

en

facilitar

nutricionalmente

el

crecimiento

de una población

polimicrobiana específica. Un ejemplo de estos medios es el Caldo Selenito. d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Un ejemplo de este tipo de medios es el Mac-Conkey. e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre otros.

f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad especifica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios deben poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de estos medios es el Agar Kligler y el Simmons. g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a partir

de un microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios. [ CITATION Ram14 \l 3082 ] Medios de cultivo según su estado físico (consistencia) 1) Medios líquidos: Son los que se presentan en estado líquido y se les llama caldo nutritivo, y se compone de extracto de carne, peptona y agua. Se utilizan fundamentalmente para la obtención de una suspensión bacteriana de una concentración. 2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Y tiene un fin como agar bacteriano, agar comercial, agares purificados. 3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a un

agente solidificante en una pequeña proporción. Y se utilizan para la investigación de la movilidad de bacterias. [ CITATION Mar14 \l 3082 ] El agar El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con Fuente: https://www.google.com.ec/search? biw=1366&bih=662&tbm=isch&sa=1&ei=hn4GWqn8 GMfLmwHj1YqoBg&q=agar&oq=agar

mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no

La Gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. [ CITATION San10 \l 3082 ] El agar de papa y dextrosa (APD)

El Agar Papa Dextrosa (Potato Dextrose Agar, PDA, por sus siglas en inglés), es utilizado para el cultivo de hongos. Es un medio de propósito general para levaduras y mohos que puede ser suplementado con ácidos o antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano. Es recomendado para uso con métodos de conteo en placa para alimentos, productos lácteos y pruebas realizadas en cosméticos. La base (infusión de papa) Fuente: https://www.google.com.ec/searc h?q=agar+pda&source=

nutricionalmente rica, estimula la esporulación de los mohos y la producción de pigmentos en algunos

dermatofitos.

Está

compuesto

por

Infusión de Papa deshidratada y Dextrosa que fomentan el crecimiento exuberante de los hongos. [ CITATION Neo15 \l 3082 ] Agar MacConkey Medio selectivo por contener sales biliares y violeta cristal que inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas. También es un medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). Las bacterias capaces de fermentar lactosa producirán Fuente: https://www.google.com.ec/s earch? di d lti

un cambio en el pH del medio por liberación de productos ácidos. Como

consecuencia sus colonias aparecerán de color fucsia/violeta, contrastando con la coloración amarillenta de las colonias incapaces de fermentar la lactosa. [ CITATION Clu09 \l 3082 ] IV.

MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales  Vaso de precipitación  Cajas Petri  Mechero de alcohol Equipos  Cocineta eléctrica  Estufa  Autoclave  Cámara de flujo laminar  Balanza

 Espátula  Papel aluminio  Papel cartón  Recipiente de vidrio con tapa  Guantes resistentes al calor  Mascarilla  Mandil  Cubre zapatos  Guantes  Varilla de vidrio  Carta colorimétrica Reactivos e insumos  Estreptomicina (PDA)  Agar MacConkey  Agar papa dextrosa  Agua destilada  Alcohol V.

PROCEDIMIENTO

MacCoukey 

Envolver las cajas petry en papel kraft de forma tal que no se caigan.



Colocar las cajas en la estufa.



En un vaso se precipitación se colocan 320 ml de A.D.E.



Luego se miden 16 gr de MacCoukey.



Calentar el agua para que no se formen grumos al momento de disolver.



Ubicar los 16 gr de MacCoukey y agitar hasta que se disuelva.



Se coloca la solución en un frasco de vidrio.



Luego se procede a colocarlo en la autoclave durante 20mn.



Mientras se espera que recurra este tiempo se proceden a sacar las cajas petry de la estufa las cuales deben de encontrarse a 40° para poder ser manipuladas, y continuamente se las desenvuelven del papel kraft.



Una vez que la pluma de la autoclave baje a cero se retira el frasco con guantes resistente a altas temperaturas y se deja enfriar.



Finalmente hay que dirigirse a la caja de flujo laminar, desinfectarse las manos y colocar esta solución en la base de las cajas petry usando la técnica de dispersión.

AGAR DE PDA 

Al igual que en el procedimiento para el MacCoukey se realiza lo mismo con la diferencia que varían las dosis, es decir:



En el vaso de precipitación se colocan 640 ml de A.D.E.



Se miden 32 gr de agar de PDA.



Y se coloca la solución en dos frascos de vidrio.



El resto es el mismo procedimiento.

VI.

RESULTADOS

Solución de MacCoukey y AGAR de PDA listos para ser colocados en la caja petry.

Colocación de las soluciones en las cajas petry dentro de la caja de flujo laminar.



Se obtuvo el medio para un cultivo, el cual se lo colocó mediante la técnica de dispersión en una caja petry cubriendo solo la base de esta.



Para que un microorganismo se cultive, en su medio debe tener las mismas características de donde proviene es decir pH, humedad, nutrientes.



Contamos con medios adecuados “P.D.A” para el crecimiento de hongos.



Preparamos MacCoukey para el crecimiento de bacterias.

Esto nos va a servir para el resto de nuestra carrera ya que aprendimos a crear un medio de cultivo para aislar microorganismos. VII.

CONCLUSIONES

 Se preparo los medios de cultivo de PDA y MacCoukey.  Se empleo las técnicas adecuadas respetando los parámetros que se deben seguir para obtener medios de cultivo en óptimas condiciones, cerciorándonos en todo momento que las cantidades de los distintos reactivos sean las correctas.  Mediante el uso de los instrumentos del laboratorio se esterilizo las cajas Petri y los frascos empleados para el medio de cultivo.  Se dispenso dos cajas Petri con Agar- Agar y una con MacCoukey, manteniendo en todo momento a los medios de cultivo estériles.

VIII. RECOMENDACIONES  Colocar la dosis adecuada entre las sustancias (Agar, MacCoukey, entre otros) para obtener el medio favorable para el crecimiento del cultivo deseado.  cuidadosamente la solución que se colocará en la caja Petry para que no se contamine.  Una vez cultivado el microorganismo en su medio, se debe observar a diario los cambios que este sufre ya sea en coloración, tamaño, entre otros.

IX. 

BIBLIOGRAFÍA Club de Informática Médica y Telemedicina (Universidad de Panamá). (2009). Telmeds.org. Obtenido de http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/bacilosgram-negativos-fermentadores-y-no-fermentadores/medio-agar-macconkey/

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X.

Medna, M. (2012). wordpress. Obtenido de https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-unlaboratorio-de-microbiologc3ada.pdf

ANEXOS...