Informe Trabajo Práctico N°2 Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno: KLa PDF

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Informe nro 2 Bioprocesos 1, Profesora Lorena Rojas, Betina Stephan
"Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno: KLa"
Nota: 9...

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Informe Trabajo Práctico N°2 “Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno: KLa” Asignatura: Bioprocesos I Profesora: Rojas, Lorena Instructora: Stephan, Betina

Integrantes: Fecha de entrega:

Resumen

El objetivo principal de este trabajo práctico fue determinar el valor de K La en dos formatos de biorreactores distintos, erlenmeyer y tanque agitado, ya que dicho valor se encuentra directamente relacionado con la eficiencia de un biorreactor para transferir oxígeno y, por lo tanto, con el crecimiento óptimo de microorganismos dentro del biorreactor. Además, se evaluaron distintas condiciones para visualizar cómo afectarían a la transferencia de oxígeno: presencia o no de baffles en los erlenmeyers, distintos volúmenes de solución en los erlenmeyers (75 y 150 ml), velocidades de agitación distintas en el tanque agitado (200, 400 y 600 rpm) y la presencia de detergente o antiespumante. El método utilizado fue el método del sulfito, el cual permitió obtener valores de velocidad de consumo de oxígeno (rO2) que se utilizaron para determinar posteriormente KLa. Los resultados obtenidos fueron: un KLa de 58 h-1 para el erlenmeyer de 75 ml con baffles, 35h-1 para el erlenmeyer de 75 ml sin baffles y 12 h-1 para el erlenmeyer de 150 ml. En el biorreactor de tipo tanque agitado se obtuvieron distintos K La según las rpm utilizadas: para 200 rpm se obtuvo un KLa de 40 h-1, para 400 rpm el valor fue de 249 h-1 y para 600 rpm se obtuvo 895 h-1. Introducción La transferencia de oxígeno es esencial para el crecimiento de los microorganismos aeróbicos dado que el gas actúa como aceptor final de electrones, lo cual es necesario para su metabolismo y producción de ATP. Los microorganismos únicamente utilizan oxígeno disuelto y la concentración de este depende de la tasa de transferencia de oxígeno desde la fase gaseosa a la fase líquida, de la velocidad de transporte hacia las células y de la tasa de consumo por parte de los microorganismos en el cultivo para destinarlo al crecimiento y mantenimiento. Como el oxígeno tiene muy baja solubilidad en el líquido, debe suministrarse constantemente en el cultivo para evitar que este se limite en oxígeno. Por esta misma razón es de importancia determinar la capacidad que presenta un sistema para transferir oxígeno. Para explicar el fenómeno mencionado anteriormente, se aplica lo que se conoce como “Modelo de la Película” [1], el cual modela la transferencia de oxígeno desde la burbuja hasta la célula. La velocidad que define la transferencia está dada por la etapa más lenta del proceso, donde se idealiza la existencia de una película líquida estanca entre la burbuja de aire y el medio de cultivo. La Ley de Fick se aplica para definir el movimiento por difusión en dicha etapa y se da mediante la siguiente fórmula:

N i=−D X

( ddXC ) i

Ecuación 1. Expresión de la Ley de Fick

Donde N es el flujo del componente i, D es el coeficiente de difusión del componente i en el líquido por el cual difunde y dCi/dX es la fuerza impulsora de la difusión. Desglosando la Ley de Fick mediante igualdades y relaciones, podemos llegar a la siguiente expresión: ¿

OTR = KLa×( C −C L) Ecuación 2. Transferencia de oxígeno

Donde OTR es la velocidad de transferencia de oxígeno, C* es la concentración de oxígeno que se haya en equilibrio con la presión parcial de dicho gas en el seno de la fase gaseosa (la cantidad saturante de O2 disuelto), CL es la concentración de O2 disuelto en el medio, kL (coeficiente de transferencia de O2) es el cociente entre -DO2 (constante de difusión a través de la película) y L (ancho de la película estanca entre las fases gaseosa y líquida) y, por último, “a” es el área volumétrica (A/V) donde ocurre el contacto entre la superficie de la burbuja y el medio. KLa es un parámetro tecnológico que depende del recipiente donde esté el cultivo con el microorganismo y sus características (como un biorreactor o un erlenmeyer). Por ejemplo, se mejora el KLa con el agregado de baffles en el recipiente, ya que cuando se agita, el líquido choca contra estos aumentando la turbulencia que fragmenta las burbujas de aire en burbujas más chicas (lo que aumenta el valor de a, dado que aumenta el área total de difusión A), además de mejorar el mezclado del medio de cultivo y aumentar el tiempo de retención de las burbujas en el líquido favoreciendo que ocurra la transferencia de oxígeno. El KLa no sólo depende del recipiente, también puede verse afectado por distintos factores. Estos son: ➔

Velocidad de agitación: a mayor velocidad, mayor turbulencia, por lo que las

burbujas se hacen más chicas y aumenta el área de transferencia. ➔

Tensioactivo (detergente): estabiliza burbujas pequeñas aumentando la

superficie de transferencia de oxígeno y, por ende, provocando un aumento en KLa. A pesar de que genera el aumento de KLa, el uso de detergentes no es ideal ya que puede generar espuma en exceso y rebalsar el biorreactor así como también dañar componentes celulares fundamentales como los lípidos de membrana. De ser necesaria su presencia se utiliza un antiespumante. ➔

Agente antiespumante: disminuye el KLa debido a que cambia la composición

del medio (son siliconas por lo general) y esto hace que altere la tensión superficial, generando burbujas de mayor tamaño ➔

Viscosidad del líquido: a mayor viscosidad, menor KLa debido a que aumenta

la resistencia a la transferencia de oxígeno.

➔

Iones disueltos en el medio de cultivo: al agregar iones aumenta la retención

del oxígeno en el líquido y disminuye el tamaño de las burbujas. También se debe tener en cuenta el gradiente o fuerza impulsora de la transferencia de oxígeno. Esta está dada por el gradiente de concentración que se produce por el consumo de oxígeno en el medio por parte de los microorganismos. En un sistema en el que la biomasa consume oxígeno se pretenderá que C L sea menor que C*; dado que se intentará evitar que el cultivo se limite en oxígeno y por lo tanto se enlentezca el crecimiento del microorganismo. Para ello es necesario que constantemente haya una transferencia de oxígeno dirigida por rO2. Es de gran importancia tecnológica poder determinar KLa. En relación a esto, el método de Cooper, también conocido como método del sulfito, sirve para estimar el K La y consiste en utilizar sulfito de sodio (SO3Na2) en exceso, el cual reacciona con el oxígeno que está siendo transferido, produciendo sulfato de sodio (SO4Na2). Para que esto ocurra es necesario utilizar Cu+2 como catalizador. En presencia de oxígeno, el sulfato de sodio reacciona en presencia de iones Cu +2 según la siguiente reacción:

1 SO 3 Na2+ O 2 +Cu+2 → SO 4 Na2 2 Ecuación 3. Reacción química entre el sulfito de sodio y oxígeno en presencia de Cu+2.

Al alcanzar la concentración de Cu+2 el orden de 0,5 - 2*10-3 M, y manteniéndose el pH neutro o levemente alcalino, la reacción es lo suficientemente rápida para que C L sea prácticamente nulo, pero no tan rápida como para que afecte el valor de L. También se debe cumplir que la velocidad de reacción no dependa de la concentración de SO3 y que el volumen ocupado por la película líquida sea muy pequeño en relación al volumen total de la fase líquida. Esto hace que el oxígeno pueda reaccionar con la solución de Na2SO3 luego de difundir a través de la película, garantizando que CL = 0. La velocidad de oxidación del sulfito es una medida indirecta de la velocidad de transferencia del oxígeno. Se titula el sulfito remanente en la reacción, tomando muestras a distintos intervalos de tiempo, y agregando iodo en exceso. La reacción que ocurre es:

SO 3 Na2+ I 2 + H 2 O → SO 4 Na2+ 2 HI Ecuación 4. Reacción entre sulfito de sodio y iodo.

El agregado de almidón como indicador de color hace que la solución se torne de color violáceo. Al reaccionar con el iodo, se observará un viraje de violáceo a incoloro, que ocurre cuando la titulación con tiosulfato se completa:

Na2 S2 O 3+I 2 → Na2 S 4 O 6 +2 NaI Ecuación 5. Reacción entre tiosulfato de sodio y iodo.

Es posible determinar el KLa de un erlenmeyer utilizando la reacción de Cooper con el fin de conocer la concentración del agente oxidante (sulfito) en cada condición. El volumen de titulante (Na2S2O3) gastado se utiliza para realizar una gráfica mediante la cual se obtiene una recta de regresión y su ecuación correspondiente, en donde la pendiente será utilizada para el cálculo de KLa según la siguiente ecuación:

KLa=

1 m×N ¿ × C 4×Vm

Ecuación 6. Cálculo del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (KLa).

en donde N es la normalidad del titulante (tiosulfato), Vm es el volumen de muestra de sulfito de sodio, 4 es el equivalente por mol de oxígeno y m es la pendiente que se obtiene de la gráfica antes mencionada. La reacción de oxidación ocurrirá en el seno del líquido y su velocidad estará delimitada por la velocidad máxima de difusión de oxígeno. De esta manera, la velocidad de oxidación del sulfito es equivalente a la velocidad de transferencia del oxígeno por lo que KLa puede calcularse como:

KLa=

rO 2 ¿ C

Ecuación 7. Cálculo de KLa cuando CL es cero.

Este método tiene como inconveniente que soluciones salinas concentradas disminuyen la coalescencia de las burbujas. En consecuencia, aumenta el área por unidad de volumen. Así, el KLa que se obtiene suele ser mayor que el que se tendría si el líquido fuera no coalescente (como lo son, generalmente, los medios de cultivo). Conociendo el valor de C* se puede estimar el valor de La a partir de la velocidad de consumo de oxígeno. Para calcular esta última se puede determinar el sulfito residual en el reactor o la velocidad de consumo de oxígeno en la reacción por balance en fase gaseosa. La determinación de las velocidades de consumo de O2 por balance de materia en fase gaseosa conduce a la siguiente expresión:

OTR=r O 2=

[

pO 2 (S) T 0 60 0,21 −F ×0,79 × × × − V 1− pO 2(S ) 1−0,21 T 22,4

]

Ecuación 8. Velocidad volumétrica de consumo de oxígeno por balance de fase gaseosa.

donde F es el flujo del aire de entrada, V es el volumen del reactor, T es la temperatura de trabajo, To es la temperatura estándar (273K), y pO2(s) es la presión parcial del aire de salida. Al aplicar la ecuación 8, es importante corregir el valor de C*, ya que la presión parcial de O2 estará dada por la composición del gas de salida utilizando la siguiente ecuación: ¿

¿

C =C ❑ (21) ×

% O2 21

Ecuación 9. Corrección del valor de C*.

Materiales y Métodos Se siguieron los pasos detallados en el apartado “parte experimental” de la guía de trabajos prácticos de la materia [1] con las siguientes salvedades: ●

El volumen de solución 0.5N de SO 3Na2, utilizado para la determinación de la velocidad de transferencia de O2 por el método de balance gaseoso fue de 3,4 litros y se trabajó a una temperatura de 30°C con un flujo de aire de 1,4 litros.min-1

●

Las velocidades de agitación evaluadas fueron 200, 400 y 600 rpm.

Resultados y Discusión a) Determinación de la velocidad de transferencia de O 2 en biorreactor por el método de balance gaseoso. Con los datos obtenidos de porcentaje de salida de O2 se utilizó la ecuación 8 para determinar la rO2 correspondiente a cada velocidad de agitación evaluada en el biorreactor y con ellas se determinó KLa utilizando la ecuación 7. Los valores obtenidos fueron los siguientes: Velocidad de agitación (rpm)

rO2 (mol O2/lh)

KLa (h-1)

200

8,98E-03

40

400

4,74E-02

249

600

1,11E-01

895

Tabla A-1. Valores de rO2 y KLa obtenidos para las distintas velocidades de agitación.

Gráfico 1. Logaritmo del coeficiente volumétrico de transferencia de O 2 vs. el logaritmo de la velocidad de agitación (rpm) seteadas en el biorreactor. La ecuación de la recta permite intrapolar valores de velocidad de agitación que se encuentren en el rango de 600-200 rpm.

Los resultados obtenidos (tabla A-1) muestran que K La aumenta a medida que se incrementa la velocidad de agitación del biorreactor. El valor de K La se obtiene al despejar KLa de la ecuación 7. Esto significa que, a medida que aumenta la velocidad volumétrica de consumo de oxígeno, aumenta KLa. Asimismo, a medida que aumenta la velocidad de agitación se incrementa el área interfacial gas-líquido, lo que facilita la transferencia del gas desde la fase gaseosa a la fase líquida. También observamos que el porcentaje del oxígeno a la salida disminuye a medida que aumenta la agitación ya que, al haber mayor transferencia, hay más reacción del oxígeno con el sulfito de sodio. Tras determinar las velocidades de transferencia de oxígeno en las tres condiciones (tabla A-1), se agregó un tensioactivo (detergente) y un antiespumante en el biorreactor para corroborar experimentalmente que el agregado del primero genera una disminución en el porcentaje de salida del oxígeno, y que el segundo provoca lo contrario. El agregado de detergente genera la estabilización de burbujas más pequeñas, provocando un aumento en KLa. Al estabilizar burbujas más pequeñas, aumenta las superficie de transferencia de oxígeno y es por esto que disminuye el porcentaje de oxigeno de salida. Por otro lado el agregado de un antiespumante produce la desestabilización de las burbujas pequeñas, disminuyendo la superficie de transferencia de oxígeno y, por lo tanto, el valor de KLa. b) Determinación de la transferencia de O2 en erlenmeyer por método iodométrico. En el gráfico 2 se ilustran los valores de titulante utilizados para determinar el consumo de oxígeno de manera indirecta en los erlenmeyers A y B (Erlenmeyers de 250 mL con baffles con 75 mL de solución de Na2SO3)

Gráfico 2. Variación del volumen de titulante (tiosulfato de sodio) en función del tiempo para los Erlenmeyers con baffles, de 250 ml con 75 ml de solución de Na 2SO3 + 50 μl de Cu2+ . Los valores de titulante utilizados se expresan en la Tabla 2, en la sección “Anexo”.

Análogo al gráfico anterior, el gráfico 3 ilustra los valores de titulante utilizado para las titulaciones hechas sobre los erlenmeyers C y D.

Gráfico 3. Variación del volumen de titulante (tiosulfato de sodio) en función del tiempo para los Erlenmeyers de 250 ml con 75 ml de solución de Na 2SO3 + 50 μl de Cu2+ . Los valores de titulante utilizados se expresan en la Tabla 3, en la sección “Anexo”.

Análogo a los gráficos anteriores, el gráfico 4 ilustra los valores de titulante utilizado para las titulaciones hechas sobre los erlenmeyers E y F.

Gráfico 4. Variación del volumen de titulante (tiosulfato) en función del tiempo para los Erlenmeyers de 250 ml con 150 ml de solución de Na 2SO3 + 100 μl de Cu2+ . Los valores de titulante utilizados se expresan en la Tabla 4, en la sección “Anexo”.

A partir de las regresiones lineales aplicadas sobre los gráficos se logró determinar la pendiente de la recta para cada erlenmeyer. Se eliminaron los puntos en t=0 hs por verse desplazados considerablemente de la regresión lineal, en pos de obtener valores de R2 más cercanos a 1. Se calcularon las pendientes promedio para los tres pares de erlenmeyer y, con estos datos, se calculó el valor de K La para cada par empleando la ecuación 6. Posteriormente, se determinó el valor de OTR para cada par empleando la ecuación 2 con CL = 0. Los resultados obtenidos se ilustran en la siguiente tabla: Condición

Pendientes

KLa (h-1)

OTR (mol O2/hL)

75 ml con bafflers

1,8031

58

1,35E-02

75 ml sin bafflers

1,0865

36

8,34E-03

150 ml 0,4167 13 3,12E-03 Tabla A-2. Se presentan los valores de pendiente, KLa y OTR obtenidos con el promedio de las pendientes obtenidas en los gráficos 2,3 y 4.

A partir de los datos obtenidos los erlenmeyer A y B, que contenían baffles, fueron aquellos donde se observó mayor transferencia de oxígeno. Esto se debe, principalmente, a que la presencia de baffles favorece el mezclado y agitación, lo que se traduce en un incremento en el KLa ya que se producen burbujas más chicas y, en consecuencia, aumenta el área de transferencia de oxígeno de fase gaseosa a fase líquida. En segundo lugar se observó que en los erlenmeyer C y D, conteniendo el mismo volumen que los A y B pero sin baffles, la transferencia de oxígeno se vio desfavorecida en

comparación a los erlenmeyer A y B dada la ausencia de bafles que favorecen la formación de burbujas de aire más pequeñas. En último lugar, los erlenmeyer E y F fueron los que presentaron menor transferencia de oxígeno. Esto se explica, no solo por la ausencia de baffles, sino también por el volumen de la solución que, en estos, fue el doble del volumen usado en A, B, C y D. Un mayor volumen disminuye el parámetro “a”, generando un menor KLa. Debido a que las titulaciones requieren de cierta habilidad práctica por parte del operario, todas las titulaciones fueron realizadas por la misma persona con el fin de minimizar el error, aun así, algunos puntos fueron eliminados debido a que no resultaban del todo coherentes en comparación de los demás datos obtenidos. Bajo este criterio se eliminaron los primeros puntos de los erlenmeyers E y F. El método del sulfito trae consigo una desventaja: la gran cantidad de sales utilizadas alteran la coalescencia, disminuyendola, estabilizando las burbujas pequeñas formadas. Esto genera un aumento en el

K La, por lo que al calcular el mismo, se lo estaría

sobreestimando, teniendo en cuenta que se considera que los medios de cultivos utilizados tienen una coalescencia similar al agua. Para solucionar este problema, se podría calcular con un cultivo de microorganismos limitado en oxígeno, estimándose el

K La de forma

mucho más aproximada. Para esto se debería trabajar en condiciones de esterilidad, lo cual haría más dificultosa la parte experimental. Conclusiones Se logró calcular el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno en dos tipos de biorreactores y en distintas condiciones, utilizando SO 3Na2 que reacciona con el oxígeno disuelto. En cuanto al KLa del fermentador en tanque agitado, se demostró que los valores de KLa estimados aumentan conforme se incrementa la agitación. El aumento de la agitación del sistema genera una mayor turbulencia, que se traduce en burbujas más pequeñas, exponiendo más superficie para la transferencia. Esto se ve reflejado en un aumento de la relación A/V que define al término “a” del coeficiente KLa. Por otro lado, mediante el experimento realizado con los erlenmeyers en distintas condiciones, se pudo demostrar que la presencia de baffles permite la ruptura del vórtice central, generando vórtices más pequeños que aumentan la turbulencia del sistema, y generando un KLa mayor. También se demostró que, con un volumen mayor de líquido, la transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a la líquida disminuye, obteniéndose un menor KLa que en un erlenmeyer con las mismas condiciones pero la mitad de volumen de líquido. Esto último está relacionado con que un mayor volumen implica un mezclado más dificultoso, generando menor tiempo de retención de las burbujas de aire en el seno del

líquido y, además, con que la superficie de líquido expuesta a la fase gaseosa es más pequeña. Los experimentos realizados permitieron evaluar cómo ciertas variables, ya sean relacionadas a la geometría del reactor, a la agitación, al volumen de líquido o al agregado de ciertas sustancias químicas (como detergentes y antiespumantes), afectan al KLa. Se pudo sostener desde lo experimental lo visto en la parte teórica de la materia relacionado a este coeficiente. Cabe a...