Lez. 19 Patologia Clinica - 25 PDF

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Sbobinature del corso di Patologia clinica dell'anno accademico 2018/2019 tenuto dal professor Trincisi. Si raccomanda lo studio delle sbobinature per poter passare l'esame. Non è necessario un libro....

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LEZIONE DI PATOLOGIA CLINICA 25/01/19 Sbobinatori: Dario Amodeo, Albino Trapuzzano! Argomenti: Quadro siero proteico, esame delle urine

È un esame abbastanza di base, che viene molto richiesto, basato sullo studio delle proteine sieriche. ! Tuttavia l'applicazione principale oggi ce l'ha per lo studio dell'eventuale componente monoclonale.! Le proteine sieriche sono un gruppo di proteine piuttosto eterogeneo, hanno funzioni diverse tra loro, anche se molte di queste funzioni riguardano principalmente il trasporto di ormoni, vitamine

ecc..! Queste proteine possono variare la loro concentrazione sia in condizione fisiologiche sia in condizioni patologiche , alcune di queste proteine variano in gravidanza oppure posso variare in uno stato di anemia sieropenica . Ad esempio la presenza di albumina, importante nella regolazione della pressione osmotica, ci da informazioni sulla capacità di sintesi del fegato , e in caso di riduzione ci da un’idea di sindrome nefrosica. ! La maggior parte delle proteine sieriche possiamo classificare, sulla base dei vecchi metodi separatori che si utilizzavano degli acidi per la precipitazione delle proteine, in albumina e globuline.! Per la caratterizzazione delle proteine sieriche viene utilizzata l'elettroforesi, mentre la cromatografia viene utilizzata con l’emoglobina glicata. ! L'elettroforesi è una tecnica che ci permette di separare le proteine per peso molecolare e per differenza di cariche ioniche. ! ! L'elettroforesi può essere svolta in due modi:!

1) Su un substrato solido! 2) Su un capillare ! Una a volta separate, le proteine si distribuiscono formando più bande, della quali la maggiore rappresenta l'albumina , preceduta spesso dalla per albumina . Tale distribuzione è dovuta al fatto che le proteine hanno diversa grandezza e diversa carica elettrica .!

! Oltre all'albumina e alla ora albumina , abbiamo una seria di bande che ci consentono di vedere la proteine che migrano nella zona alfa1 , Alfa2 , nella zona beta e nella zona gamma . Quindi ci sono delle zone all'interno della quali possiamo evidenziare bande particolari.! Per quel che riguarda l'elettroforesi su corpo solido, la migrazione su acetato di cellulosa o su gel di agarosio consente poi la colorazione delle proteine e poi una visualizzazione densitometrica di queste bande. ! In laboratorio viene eseguita l'elettroforesi dei campioni di siero su capillari di silice.! Si tratta di due tecniche valide, il principio fondamentale e che l'elettroforesi venga eseguita su di un campione di siero e non sul plasma ( facilmente riconoscibile dalla presenza del fibrinogeno tra la banda beta2 e gamma).! Oltre all'albumina , abbiamo un primo picco alfa1 che contiene l'alfa1 antitripsina, importante perché inibisce l'elastasi dei neutrofili, e quindi impedisce la propagazione di un danno flogistico.!

! Poi abbiamo l'alfa1 glicoproteina acida , proteina di fase acuta prodotta dal fegato.! Nella zona alfa2 ritroviamo l'aptoglobina, la cui funzione è quella di legare l’emoglobina libera , e che quindi troveremo ridotta in condizioni emolitiche.! In questa zona è presente anche l'alfa2 macroglobulina, una proteina grossa , che in caso di sindrome nefrosica non diminuisce , in quanto non viene escreta per le sue dimensioni. !

Inoltre è presente anche la ceruloplasmina , importante nel metabolismo del ferro e in tutti gli stati ossido riduttivi.!

! Nella zona beta1 è presente la transferrina , che aumenta nei casi di anemia sieropenica .! Nella zona beta2 è presente il fattore C3 del complemento, che aumenta nei processi infiammatori acuti.! Inoltre c’è anche la beta2 microglobulina, importante non solo perché analizza la selettività renale, ma soprattutto perché fa parte del complesso maggiore di istocompatibilitá ed è associata alla proliferazione cellulare, quindi è un marcatore utile in campo neoplastico soprattutto nel caso dei linfomi. ! Poi abbiamo l’emopessina ,che può essere seguita da residui di fibrinogeno se la separazione del siero non è stata perfetta. !

! Infine nella zone gamma abbiamo le immunoglobuline prodotte dalle plasmacellule, dove però spesso non sono presenti le IgA e le IgM che a volte si ritrovano in beta2 o addirittura in Alfa.!

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Dobbiamo considerare anche la presenza della lipoproteine , che possiamo ritrovare sia nella banda alfa1 con l'alfa1 lipoproteine (HDL) , sia nella banda beta1 con la beta1lipoproteina (LDL).! Le variazione delle proteine possono essere legate ad una condizione fisiologica o ad una condizione patologica.! Una riduzione delle proteine si può verificare in casi di malnutrizione o di un non adeguato assorbimento, in malattie di tipo epatico( in quanto la maggior parte delle proteine sono prodotta dal fegato) .! Inoltre tengono conto delle distribuzione dei liquidi, infatti in una condizione di disidratazione, l'albumina può apparentemente essere più alta perché la distribuzione fra i liquidi intravasali ed extravasali è anomala, ciò si può verificare in caso di ustioni.! Le alterazione possono essere distinte in congenite o acquisite . Le modificazioni possono riguardare una solo proteina o più proteine contemporaneamente. !

In questa slide, si vedono le percentuali della porzione proteica, l’albumina è la maggior parte. La prealbumina precede l’albumina. Molte di queste proteine sono indici di processi infiammatori in corso in fase acuta. Questo esame non può naturalmente essere esaustivo per studiare queste cose, può avere la stessa valenza studiare un quadro siero proteico che è forse ancora inferiore di studiare una “?” perché quest’ultima è specifica e non dirà mai dov’è la sede del processo infiammatorio, però ci sono alcuni di questi analiti che possono essere decisamente studiati per conto loro, per esempio la “?” si può studiare tranquillamente con metodi che utilizzano anticorpi che quantificano quella proteina. Quindi questo è un esame preliminare come può essere preliminare utilizzando urine standard rispetto all’urino coltura. Comunque è un esame che può essere utilizzato anche ai fini di screening, anche nei donatori di sangue che per legge una volta all’anno devono farlo, proprio per evidenziare eventuali condizioni degeneri, come ipergammaglobulinemia o in presenza di componente monoclonale. L’albumina è una proteina di 66kDa, normalmente è sintetizzata dal fegato, non passa il glomerulo, la sua concentrazione si riduce nei processi infiammatori. Ci sono delle varianti genetiche, la cosiddetta disalbuminemia, in cui il picco è sdoppiato e questo può essere sia genetico che acquisito quando si fanno alcuni trattamenti farmacologici, soprattutto con beta lattamine, quindi si può avere un piccolo sdoppiamento del profilo dell’albuminemia. ! Sull’alfa1-antitripsina abbiamo detto che si tratta di una piccola proteina di sintesi epatica, è una proteina che rientra nei processi infiammatori acuti, ma in questo caso serve a confinare e limitare

l’azione dell’elastasi e quindi è un bene avere alfa1-antitripsina e questa aumenterà ogni qualvolta ci sarà un processo infiammatorio. L’alfa1 non aumenta solo nei processi infiammatori a carico del polmone ma anche in altri processi, alfa 1 e alfa 2 comprendono proteine di fase acuta che aumentano indipendentemente dalla sede del processo, pero siccome l’alfa 1 antitripsina si vede, a livello di banderella, nel profilo elettroforetico, se non c’è indica carenza quindi può essere compatibile con una variante genetica che rende conto anche dei quadri di enfisema polmonari precoci. In genere quando c’è un processo infiammatorio la proteina aumenta quindi la banderella diventa più visibile. !

Attenzionare questa slide, in particolare l’alfa1 globulina, proteina dell’infiammazione acuta, l’aptoglobina, anch’essa proteina in fase acuta, che diminuisce nei casi di iperconsumo da ?enzimi a livello vascolare?, si riduce se il ?felv? funziona male, proprietà comune a molte proteine come l’albumina. ! Riguardo l’alfamacroglobulina abbiamo detto infiammazione acuta e valutazione della sindrome nefrosica.!

La ceruloplasmina è un'altra proteina che può modificarsi perché non deve essere vista semplicemente come trasportatrice del rame, ma anche come proteina che partecipa ai processi ossidoriduttivi che devono essere particolarmente attivi in un processo infiammatorio.! Poi abbiamo la proteina legante la vitamina D, anch’essa di produzione epatica. !

Nella sindrome nefrosica il picco indicato della freccia è meno ampio di quello che dovrebbe essere, si vede un selettivo aumento dell’alfa2 e una riduzione contestuale del gamma. Proteine totali 4 anziché 7 come nella normalità. ! !

Aggiungiamo anche la transferrina come proteina di fase acuta, aumenta nei processi infiammatori così come nella banda beta2 C3. Abbiamo ancora l’emopessina che ha importanza soprattutto per il legame dell’eme e la beta2 microglobulina.! Tipico quadro infiammatorio dove le fremette indicano un aumento che in questo caso riguarda alfa1, alfa2 e beta 1, beta 2; la zona gamma nel tempo potrebbe anche aumentare e sulla stessa zona abbiamo le varie classi di immunoglobuline. Quindi, essendo queste eterogenee possono occupare ambiti di altre zone e quando ci sono questi picchi, che possono essere compatibili con una componente monoclonale, bisogna segnalarli e proseguire allo step successivo che è quello dell'immunofissazione, la riprova dell’eventuale presenza di componente “?”. In teoria questi picchi possono essere più frequentemente dovuti a ecg e sono quelli a prognosi migliore, mentre

iga e igm hanno prognosi sicuramente peggiore, uno riguarda la macroglobulinemia di Waldenström (igm). Nel momento in cui il picco è monoclonale noi avremo un solo tipo di immunoglobuline e un solo tipo di catena leggera o K. Le D e le E sono così poco presenti che di solito i vari sistemi di immunofissazione non contengono queste possibilità. !

Esempio di ipergammaglobulinemia policlonale dove si vede un picco gamma tutto sfasato, normalmente è più basso, ma anche tutto intorno c’è un movimento di tutti gli anticorpi mentre invece nella ipogammaglobulinemia cade più in basso, si appiattisce e non abbiamo un aumento dell’alfa 2 come nella sindrome nefrosica o un abbassamento ?dell’allilamina?. Quindi possiamo pensare a un ipogammaglobulinemia, eventualmente dobbiamo sospettare una malattia di tipo ? . Noi in genere segnaliamo sui referti l’ipogammaglobulinemia se la componente della zona gamma è inferiore a 9%, seguendo le linee guida.! Detto quindi che la zona gamma ha condizioni di iper e di ipo, si vede un sospetto, la gamma ha un punto in cima in cui forse si sta sviluppando la monoclonale perché si vede un po più appuntito, fuoriesce dall’andamento normale che è quello in cui non ci sono dei picchi più ristretti,

invece nel caso della punta sembra ci sia una componente, quindi si procede rifacendo l’esame, o si cambia il campione oppure si può chiedere un immunofissazione perché è più forte. Qui è ancora incerto perché di solito i picchi sono un pò più stretti. !

Per quanto riguarda le gammapatie monoclonali sono in generale situazioni abbastanza frequenti, soprattutto negli anziani, addirittura dal 3% al 7%, sono condizioni che possono rimanere così come sono o possono evolvere nel mieloma. Come faccio a sapere l’uno e l’altro? Quando supero 3 g/dl di proteine in un picco monoclonale è certo che si tratti di mieloma. Un andamento a ?corno? con l’albumina è un picco che è quasi quanto l’albumina, anzi in questo referto tutto il picco della gamma è più del 40% e il picco monoclonale è stato modificato come 32% di tutte le proteine, quindi abbastanza importante. Nel caso del mieloma possiamo avere una globulina monoclonale, possiamo avere anche delle catene leggere perché libere e anche queste sono quantificabili in laboratorio. Le eg possono contenere varie classi e ripetiamo che la prognosi è migliore. !

Se ho una situazione che non ho visto mai chiedo l’immunofissazione. Si capisce dall’altezza del picco che potrebbe essere un mieloma, lo devo caratterizzare e allora utilizziamo l’immunofissazione. Quest’ultima consiste nella separazione elettrofretica del siero del paziente e poi nel cimentare con degli anticorpi antiIgG umane, sviluppate in una cavia da esperimento, che siano in grado di evidenziare questa situazione. Una volta evidenziate le proteine con gli anticorpi, il gel viene poi colorato con violetto acido e quindi in questo caso possiamo dire che quel piccolo monoclonale è relativo ad un’immunoglobulina di tipo M,catena leggera K. !

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Modificazioni che possono avvenire in alcune condizioni patologiche.! Nella sintomatologia infiammatoria in particolare zona alfa 1 e alfa 2! Nella carenza ? la beta 1 e la ?! Nelle malattie infettive e multisistemiche aumento di tutto e soprattutto delle poligonali della zona gamma. Poi possiamo avere un deficit acquisito congenito di alfa 1 con globuline ridotte o altre condizioni. Le gammaglobuline ridotte non per forza indicano una neoplasia di tipo linfoma, possono anche essere pazienti che hanno un deficit di monoglobuline. e comunque ci può essere utile per la valutazione di organi come fegato e rene, in particolare nella cirrosi e nella sindrome nefrosica.! Questo per dire che molte di quelle proteine singole, c’è ne sono tante, transferrina, la proteina c reattiva, le immunoglobuline possono anche essere misurate in maniera specifica con metodi diversi.! Mi scuso se qualche parola non è stata riportata ma ho avuto difficolta a capire alcune parti della registrazione.

ESAME DELLE URINE Le urine si possono analizzare tramite: • urine 24h per lo studio della proteinuria che interessa principalmente ai nefrologi per classificare la gravità in un danno renale, si fa buttando la prima urina del mattino raccogliendo le seguenti per 24 compresa la prima del giorno seguente. • urinocoltura che si esegue su campione sterile, in questo esame il paziente deve essere preparato con accurata pulizia dei genitali e raccolta del campione a mitto intermedio. • esame chimico-fisico del sedimento urinario (o esame delle urine standard) è un esame di base con le urine raccolte al mattino perché risultano più concentrate e quindi più informative per il sedimento, il contenitore deve essere mono-uso e non per forza sterile sebbene nella prassi si utilizza anche se non è indispensabile, inoltre in questo esame non è necessario il mitto intermedio.

Diuresi ( normale 1-1,5L circa, da 5 a 9 emissioni) Maggiore di 2L → POLIURIA Tra 100-500 mL → OLIGURIA Inferiore → ANURIA

N.B non rientra nell’esame chimico-fisico sapere qual è la concentrazione delle urine perché stiamo analizzando un campione e su questo avremo informazioni semi-quantitative, la quantità serve in altri scopi come distinguere un diabete insipido da una potomania.

È importante che le urine vengano processate relativamente presto entro 1-2 h senza tenerle vicino a fonti luminose o fonti di calore perché nel campione possiamo avere elementi cellulari, sostanze fotosensibili e batteri i quali possono riprodursi molto rapidamente , se non può essere analizzato in questo tempo deve essere congelato. Un campione che non è il primo mitto sarà troppo diluito e non ci darà le informazioni che servono soprattutto del sedimento Quali sono i maggiori cambiamenti che possiamo ottenere a temperatura ambiente se non viene processato in tempi rapidi? - Distruzione dei globuli rossi e bianchi - Variazione del pH legata alla presenza di batteri ureasi produttori che trasformano urea in ammoniaca che fa virare il pH sul versante basico - Dissoluzione dei cilindri, elementi particolari derivati dalla proteina di Tamm-Horsfall - Infine si possono formare o dissolversi i cristalli Sebbene si tratti di un esame semi-quantitativo possiamo avere la riduzione di alcuni parametri come glucosio, corpi chetonici perché potremo avere elementi cellulari come i batteri che utilizzano queste sostanza. Inoltre le urine cambiano colore nel tempo e si inscuriscono perché sono fotosensibili

Parametri dell’esame chimico-fisico del sedimento urinario: • colore, normalmente si presenta giallo paglierino ma può variare da un aspetto incolore ad un aspetto ambrato per danno epatico, rosso con presenza di emazie,variazioni per farmaci e gialloverdastro con eccesso di bilirubina. • aspetto, normalmente è limpido ma se è torbido sarà per la presenza di elementi cellulari in quanto ci possono essere batteri, cristalli e anche muco. La glicosuria non da torbidità. Colore, aspetto e peso specifico li otteniamo dalla presenza di striscette che sfruttano i principi di chimica secca e quantificano questi parametri. La presenza di schiuma è indice di proteinuria che con l’odore non sono quantificabili, anche se rientrano nelle proprietà fisiche non rientrano nel referto perché sono valutate con striscette che danno parametri semi-quantitativi.

• pH, riscontrabile tra 4.5 e 8 anche se nella maggior parte dei casi è compreso tra 5.5 e 6.5, quindi leggermente acido e può diventare più basico in presenza di batteri ureasi produttori. È importante valutarlo per i cristalli: un pH basico vicino alla neutralità permette la formazione di cristalli da fosfati e non di ossalato.

• peso specifico, nella normalità tra 1005 e 1030 superiore → iperstenuria, soprattutto nell’anziano perché beve poco e ha un peso specifico alto mentre risulta diluito nei pazienti con problemi renali → ipostenuria componenti dell’esame chimico-fisico: proteine glucosio emoglobina pigmenti biliari (in particolare la bilirubina e l’urobilinogeno) corpi chetonici normalmente queste componenti devono essere assenti e se presenti sono riportati con + ++ +++ perché semi-quantitativa. Le proteine sono sempre patologiche ed è rilevabile la loro presenza sopra i 150mg nelle 24h, ad eccezione di un eccessivo sforzo fisico che è una condizione fisiologica. La maggioranza è rappresentata dall’albumina anche se possono essercene altre come la proteina di bence jones. L’esame delle urine standard non può dirci di che proteina si tratta.

La presenza di glucosio non è data esclusivamente dal diabete, può essere data dall’uso di farmaci (es. inibitori del GLST2 o da corticosteroidi).

La presenza di emoglobina è correlata alla presenza di emazie nel sedimento, questo viene studiato tramite chimica secca e risente degli eventuali interferenti che agiscono sui processi ossidoriduttivi. Pigmenti biliari, urobilinogeno e bilirubina sono parametri che possono andare di pari passo oppure no, l’urobilinogeno indica un danno epatico e pre-epatico, anche un anemia emolitica, invece la bilirubina è legata ad un danno epatico o post-epatico ( e quindi abbiamo informazioni anche sul funzionamento del fegato) . I Corpi chetonici possono indicare un digiuno, se presenti con glicosuria sospettiamo diabete di tipo 1, invece se valutiamo un referto di un paziente oncologico in cui sono presenti corpi chetonici sarà dovuto a cachessia. I Nitriti che sono solitamente in concomitanza con batteri o con esterasi (enzima attivato nei leucociti) quando questi due parametri sono presenti sarà indice di infezione da batteri. Sul sedimento dobbiamo contemplare la presenza di cellule: emazie, leucociti e cellule più grosse che sono quelle delle basse vie urinarie ma si possono ritrovare anche quelle delle alte vie urinarie (raramente cellule renali). I Cilindri che sono di vario tipo: ialini, granulocitari, eritrocitari (quelli ialini sono quelli con meno significato patologico e la loro presenza non allarma). I Cristalli sono diversi, alcuni sono rari come quelli di leucina o colesterolo, mentre i più frequenti sono quelli di acido urico, di urati amorfi, a pH acido quelli di ossalato di calcio e sono spesso legati alla dieta e al consumo prevalente di frutti di stagione come pomodoro (quindi i cristalli hanno poco significato clinico) , a pH basico cristalli di fosfato . Se centrifughiamo i cristalli di fosfato saranno biancastri mentre quelli di urato saranno rosa e questo ci aiuta perché al microscopio sono difficilmente distinguibili, il pH ci aiuta ma ci può ingannare nel caso dei cristalli di fosfato che resisto...