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Métodos cromatográficos de análisis, clasificación, definición y ejemplos de cada uno...

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Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE Biotecnología Química Analítica

Fecha: 12/09/ 2021

Deber N° 1 Métodos cromotograficos de análisis, clasificación, definición y ejemplos de cada uno

Cromatografía La cromatografía en si es un método de separación de sustancias en mezclas complejas y se utiliza generalmente para separación, pero a los instrumentos se les acopla algún componente para la posterior determinación por algún método analítico instrumental. La mezcla a resolver se introduce en un sistema formado por un fluido (fase móvil), que circula en contacto con la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla que poseen una mayor afinidad por la fase estacionaria, su velocidad de avance se hará más pequeña y se logrará la separación.

Técnicas de Cromatografía Como ya hemos visto, se fundamentan en el transporte de la mezcla problema a través de una fase estacionaria (sólida o líquida) mediante una fase móvil (líquida o gaseosa). La fase móvil fluye sobre, o a través de, la fase estacionaria. Existen diversas formas de llevar a cabo un proceso cromatográfico. Dependerá de cómo se introduce la muestra a separar y cómo se desplaza por la fase estacionaria. Los métodos más comunes son: 

Desarrollo



Elución



Desplazamiento



Análisis frontal

El método más utilizado es el de elución. Consiste en colocar la muestra en una capa delgada, en la parte superior de la columna, lecho cromatográfico o fase estacionaria. La fase móvil fluye a través de la fase estacionaria arrastrando los componentes de la muestra. La velocidad de movimiento diferirá de un componente a otro y permitirá la recogida de los componentes en momentos distintos, tal y como se muestra en el video que hemos visto.

Hay varios tipos de cromatografía. Los más importantes son: Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son: 

Cromatografía en papel



Cromatografía en capa fina

Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: 

Cromatografía de líquidos



Cromatografía de gases



Cromatografía de fluidos supercríticos



Cromatografía de gel-filtración

 Cromatografía en papel Está prácticamente en desuso. Aunque figura en el grupo de técnicas líquido-líquido también se le puede relacionar con la cromatografía de adsorción. El soporte de la fase estacionaria es una tira de papel de celulosa, que tiene los líquidos entre sus fibras.

Dependiendo del grado de retención y la solubilidad de las distintas sustancias, el eluyente los arrastrará a distinta velocidad. El grado de retención o factor de retención se calcula del mismo modo que en la cromatografía de capa fina:

Ejemplo: Este tipo de cromatografía puede utilizarse para separación de aminoácidos, resolución de problemas bioquímicos, resolución de problemas químicos y control de purezas en productos alimenticios y farmacéuticos.  Cromatografía en capa fina La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor.

Ejemplo:

Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

 Cromatografía de líquidos La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar Ejemplo: Este tipo de cromatografía tiene muchas aplicaciones, por ejemplo, para determinar aditivos, colorantes, vitaminas.

 Cromatografía de gases La cromatografía de gases (GC) es una técnica analítica de uso muy extendido. Empleado para determinar la composición de una mezcla de productos químicos (muestra), un cromatógrafo de gases utiliza diversos gases en su operación en función del analizador y del tipo de detector concretos. El uso del gas especial y el equipo correctos cuando realice una cromatografía de gases mejorará considerablemente la precisión de sus resultados analíticos.

Ejemplo:

En función de la técnica, a veces son necesarios otros gases, como un gas auxiliar, que se utiliza a la salida de la columna para aumentar el caudal que entra en el detector. También se utilizan mezclas de calibración para la calibración de muchos analizadores.

 Cromatografía de fluidos supercríticos La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir en la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión de vapor de una sustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido supercrítico. Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido.

Ejemplos:

La SFC se aplica a una gran variedad de compuestos, entre los que podemos citar drogas, alimentos, herbicidas, tensioactivos, polímeros y aditivos para éstos, impelentes, explosivos o combustibles fósiles.

 Cromatografía de gel-filtración La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar moléculas en función de su tamaño molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamaño de sus poros

Ejemplos: Desalación de proteínas o de ácidos nucléicos

Otros tipos de cromatografías  Cromatografía de líquidos de alta resolución La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.

 Cromatografía de exclusión molecular También llamada cromatografía de tamizado molecular, de filtración por gel o de penetrabilidad. Separa los componentes de una muestra en función de su peso molecular. La fase móvil es un disolvente, que puede ser acuoso u orgánico en función de la solubilidad de la muestra. La fase estacionaria es químicamente inerte, pero si la fase móvil es acuosa el gel deberá ser hidrófilo e hincharse en contacto con el agua destilada. En cambio, si la fase móvil es orgánica, la fase estacionaria será un gel hidrófobo que se hinchará absorbiendo el disolvente orgánico. Ejemplo Los usos de este tipo de cromatografía son varios. Determinación de masas moleculares, separación de proteínas marcadas, y la eliminación de sustancias que interfieren en determinadas mezclas, son algunos de ellos.  Cromatografía de afinidad

La fase estacionaria es un adsorbente conocido como ligando. Este adsorbente es capaz de interaccionar de manera bioespecífica con la superficie de las células que se pretenden separar. El eluyente de la fase móvil, por su parte, debe ser un disolvente apropiado para las células que se pretenden separar.En ocasiones es necesario un tratamiento previo en las células que se pretenden separar. Esto es debido a que el nexo de unión de las células con el ligando está ocupado por otro componente químico. Estos componentes se deben retirar mediante el tratamiento. Si un determinado antígeno se encuentra ocupado por un anticuerpo, el ligando específico para interaccionar con células que presenten dicho antígeno no podrá retener las células en el interior de la columna. En ese caso sería necesario el tratamiento mencionado en el párrafo anterior. Ejemplo:

Esta técnica, realizada en columna, se usa para separar subclases celulares y obtenerlas en estado puro. Un claro ejemplo sería obtener linfocitos B o linfocitos T a partir de una muestra de sangre periférica.

Bi Bib bliliogra ogra ografía fía Facultad de Química. (diciembre de 2007). Técnicas Cromatográficas. Obtenido de UNAM: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf Iodakov. (2014). Método cromatográfico. Obtenido de Ecured: https://www.ecured.cu/M%C3%A9todo_cromatogr%C3%A1fico PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFIA DE. (s.f.). Obtenido de Bioted: https://www.bioted.es/protocolos/PRINCIPIOS-CROMATOGRAFIA-FILTRACIONGEL.pdf Repullo, J. L. (s.f.). Cromatografía de filtración en gel . Obtenido de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/13%20FILTRACION%20EN%20GEL.pdf McCABE / SMITH /HARRIOTT. “Operaciones Unitarias en Ingeniería Química” 1991. Cuarta Edición en Español. Editorial McGraw Hill S.A. España ‫ چ‬PERRY, ROBERT H. “Manual del Ingeniero Químico” 1992. Sexta Edición. Tercera Edición en Español. Editorial McGraw Hill. México...