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Profesor: Yolanda y Santiago...

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Modificación lipídica de proteínas Emilio Vacas Martín Daniel Ventosa Villalobos

Modificación lipídica de proteínas

1- Introducción Desde que las proteínas empiezan a ser sintetizadas pueden sufrir diferentes modificaciones co y postraduccionales que juegan un papel crucial en la respuesta de la célula a estímulos externos. Una de estas modificaciones es la lipidación que consiste en la unión covalente de ácidos grasos a las proteínas. Cada ácido graso confiere propiedades bioquímicas distintas a las proteínas y así las modificaciones lipídicas, no sólo alteran la estructura de la proteína, sino también su interacción con membranas lipídicas u otras proteínas. Se han identificado tres clases principales de reacciones de acilación grasa en células de mamífero: Nmiristoilación, S-palmitoilación y acilación grasa de proteínas secretadas.

2- N-miristoilación. 

¿Qué es el miristato? El miristato es la sal o éster del ácido mirístico que es un ácido graso saturado formado por 14 carbonos que se encuentra presente en la mayoría de las Grasas de origen animal y vegetal.

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¿En qué consiste la N-miristoilación? La N-miristoilación es la adición covalente de una molécula de miristato, a un residuo de glicina N-terminal de una proteína mediante un enlace tipo amida. El mecanismo enzimático es bien conocido: primero una enzima metionina aminopeptidasa elimina la metionina inicial y luego el ácido graso es incorporado mediante una enzima especializada. El donante del ácido graso intracelularmente es el miristoil-CoA y la glicina es el único residuo que puede servir como un sustrato aceptor para la enzima que cataliza la reacción. Generalmente esta modificación es co-traduccional e irreversible.

© Wright et al 2010

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¿Qué enzima cataliza la N-miristoilación? La enzima que cataliza la N-miristoilación de proteínas es la N-miristoil transferasa (NMT) una enzima monomérica de 50-60 KDa. En los vertebrados existen 2 proteínas NMT, NMT1 y NMT2, codificadas por dos genes, Nmt1 y Nmt2, que tienen sobre un 75% de identidad en su secuencia.

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¿Cómo se realiza la reacción? 1. El sustrato miristoil-CoA se une primero a la apo-enzima en un bolsillo hidrófobo específico para 14 carbonos, induciendo un cambio conformacional 2. Se une en el bolsillo el péptido y se forma un complejo ternario. 3. Se produce la transformación química y el miristato se transfiere a la glicina N-terminal, seguido por la liberación secuencial de CoA y finalmente la proteína N-miristoilada. © Wright et al 2010

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Tipos de proteínas que son N-miristoiladas Se ha informado de unas 150 proteínas miristoiladas en células de mamíferos, casi todas con la secuencia consenso (Met-Gly-X-X-X-Ser/Thr).

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¿Cómo afecta la N-miristoilación a las funciones de las proteínas? El residuo miristoilo que se añade a la proteína puede realizar varias funciones en la célula, pero la mayoría de las proteínas miristoiladas están unidas a membranas, sin embargo la energía libre de Gibbs para la unión de un péptido miristoilado a una bicapa de fosfolípidos no es suficiente energía para anclar la proteína de forma estable a una bicapa lipídica. Con el fin de lograr la unión de membrana estable, las proteínas N-miristoiladas necesitan una segunda señal. Se han identificado al menos cuatro tipos de segundas señales: regiones polibásicas, que realizan interacciones electrostáticas con los fosfolípidos negativos de la membrana; residuos hidrofóbicos, que aumentan la energía; otro enlace de unión unido a la membrana, por ejemplo un receptor de unión a membrana; o una segunda modificación lipídica, como por ejemplo la palmitoilación que añade hidrofobicidad adicional.

MECANISMOS PARA LA DISOCIACIÓN DE LA PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA No se conocen de-miristoilasas que escindan el miristato de la miristoil-glicina N-terminal, sin embargo existen varios mecanismos para que la proteína miristoilada se disocie de la membrana. El mecanismo más generalizado es a través de los llamados interruptores miristoil. Uno de ellos es el interruptor miristoil electrostático (B) que regula la unión de las proteínas miristoiladas que tienen como segunda señal regiones poli básicas reduciendo la carga positiva de esta región y así se produce la disociación, y otro tipo de interruptor cambia la conformación de la proteína haciendo que el miristoilo N-terminal quede oculto en un bolsillo interior de

la proteína y no pueda unirse a la membrana (A).

© Wright et al 2010

Miristoilación y demiristoilación de residuos de lisina. El miristato también se puede unir a residuos internos de lisina, y aunque todavía no se han descubierto las enzimas que producen la acilación grasa de la lisina, sí se ha descubierto experimentalmente que algunas enzimas de la familia de las sirtuinas eliminan los grupos acilo grasos de las lisinas modificadas en las histonas, mientras que otras enzimas de la misma familia se encargan de la desacetilación de las histonas. Página 2

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3- Palmitoilación. 

¿Qué es el palmitato? Se refiere a la sal obtenida de la esterificación del ácido palmítico.

El ácido palmítico es un ácido graso saturado de cadena larga formado por 16 átomos de carbono. Su fórmula química es CH3(CH2)14COOH. Es el ácido graso más abundante en los depósitos de grasas del ser humano y un componente muy importante de la leche materna.

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¿En qué consiste la S-palmitoilación? Consiste en la fijación de una molécula de palmitato a una o más cisteínas a través de un enlace de tipo tioéster. El donante del ácido graso intracelularmente es el palmitoil-CoA. Las cisteínas modificadas pueden encontrarse tanto en el extremo C- terminal como en el N- terminal, así como también en el interior de la secuencia. No existe una secuencia consenso que caracterice a todas las proteínas palmitoiladas, aunque sí que se han llevado a cabo algoritmos para tratar de identificar sitios potenciales que sufran este tipo de modificaciones.

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¿Qué enzima cataliza la S-palmitoilación? La S-palmitoilación de proteínas esta catalizada por la enzima DHHC palmitoil aciltransferasa. Las siglas DHHC hace referencia a un motivo común de todas las enzimas de esta familia en el que se encuentra la secuencia consenso Aspartato-Histidina-Histidina-Cisteína. Cada miembro de esta familia de proteínas posee una secuencia de aminoácidos conservada dentro de una región rica en cisteínas. Estas enzimas se sitúan en membranas intracelulares (RE, Golgi…) o en la membrana plasmática. Muchas proteínas palmitoiladas pueden ser modificadas por más de un tipo de enzima de la familia DHHC y una sola enzima de dicha familia puede tener como sustrato a varios tipos de proteínas diferentes.

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¿Cómo se realiza la reacción? La reacción catalizada por la enzima DHHC palmitoil aciltransferasa sigue un mecanismo enzimático de tipo ping-pong en dos pasos: el palmitato se une al motivo DHHC de la enzima, dando lugar a un intermediario acilo-enzima que va a ser el que transfiera el palmitato a una cisteína de la proteína

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diana. La integridad estructural de la enzima se va a mantener por la coordinación de dos iones Zinc para conservar las cisteínas de la región rica en estos aminoácidos que posee la enzima.

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Tipos de proteínas que son S-palmitoiladas. Existen una multitud de proteínas diferentes que pueden ser palmitoiladas abarcando funciones tan dispares como receptores, canales iónicos, canales de señalización etc. Proteínas que ya hayan sufrido otros tipos de modificaciones lipídicas también pueden ser susceptibles de palmitoilación, aunque en algunos casos es necesario que esta primera modificación lipídica (miristoilación, prenilación) se haya producido para que ocurra la adición del palmitato.

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¿Cómo afecta la S-palmitoilación a las funciones de las proteínas? Para aquellas que carecen de un dominio transmembrana, la palmitoilación promueve la unión de dicha proteína a la membrana, gracias a la gran hidrofobicidad del palmitato, que favorece su interacción con la membrana lipídica. Debido a lo lábil del enlace tioéster, los ciclos palmitoilacióndepalmitoilación permiten un constante ir y venir de la proteína entre la membrana y el citosol. Como ejemplo más característico de esto podemos citar las proteínas Ras donde estos ciclos de acilacióndesacilación ayudan a que la proteína se mantenga tanto en la membrana plasmática como en el citosol, donde interaccionan con diferentes vías de señalización. Por otro lado, la naturaleza saturada del ácido graso impulsa de forma preferente a las proteínas palmitoiladas a la fase líquida que se encuentra en las balsas lipídicas, que son subdominios de membrana que se encuentran altamente enriquecidos en colesterol. De igual forma, la palmitoilación de una proteína puede proporcionarle un punto de anclaje adicional a la membrana, así como servir de impedimento a otro tipo de modificaciones post-traduccionales como pueden ser la fosforilación o la ubiquitinación.

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S-acilación heterogénea (otros ácidos grasos que pueden hacer S-acilación) Además del palmitato, se ha descubierto que otros ácidos grasos más o menos largos pueden unirse a lo que llamaríamos proteínas S-aciladas. Ejemplos de estos ácidos grasos serían el ácido mirístico o el esteárico. Muchas veces un mismo residuo de cisteína puede ser S-acilado con diferentes ácidos grasos. La presencia de distintos ácidos grasos en una proteína puede tener consecuencias funcionales importantes. Un ejemplo de esto sería el hecho de que la unión de ácidos grasos saturados promueve la asociación de balsas lipídicas mientras que la unión de ácidos grasos insaturados tiene el efecto contrario. Esto nos puede dar una pista acerca de la importancia de una terapia dietética con ácidos grasos específicos.

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Depalmitoilación. El enlace tioéster en el caso de la palmitoilación es reversible. Se han identificado dos acilproteinas tioesteresas: APT1 y APT2. Ambas pueden depalmitoilarse a sí mismas, transportándose de la membrana al citosol. Una teoría propone que las formas solubles (no palmitoiladas) de APT son responsables de la depalmitoilación de sustratos ligados a membrana como por ejemplo la proteína Ras, despegándolas de las membranas y concentrándolas en el citoplasma. Posteriormente se ha descubierto que existen más enzimas responsables de depalmitoilación, como, por ejemplo, las enzimas ABDH17, miembros de la familia de las serina hidrolasa palmitoiladas.

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4- Acilación grasa de proteínas secretadas por las enzimas MBOAT 

¿Qué son las enzimas MBOAT? Aunque la gran mayoría de las proteínas aciladas grasas son proteínas intracelulares o transmembrana, los ácidos grasos también pueden unirse a proteínas secretadas. La familia de proteínas de membrana MBOAT (membrane bound O-acyltransferase) es una familia de varias enzimas aciltransferasa. Todos los miembros de la familia contienen múltiples dominios transmembrana y catalizan la transferencia de un grupo acilo de acil-coenzima a varios sustratos diferentes. Así, la familia de MBOAT cataliza la unión de palmitato a proteínas Hedgehog, palmitoleoilato a proteínas Wnt y de octanoato a Grelina. Cada uno de estos sustratos proteicos emplea una secuencia señal para entrar en el lumen del Retículo Endoplasmático (RE), donde son acilados por ácidos grasos.

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N-palmitoilación de proteínas Hedgehog Un pequeño subconjunto de proteínas palmitoiladas, incluyendo la familia Hedgehog (Hh), que son muy importantes en el desarrollo embrionario, son N-palmitoiladas, mediante un enlace amida, sobre un residuo de cisteína N-terminal. La N-palmitoilación, en contraste con la S-palmitoilación, es una modificación estable. La N-palmitoilación comprende varios pasos: 1. Síntesis de un precursor que tiene un péptido señal que le hace entrar directamente en el RE. 2. La secuencia señal es cortada por peptidasas y posteriormente el dominio de autoprocesamiento que tiene la proteína realiza una reacción de autoproteólisis y de unión de colesterol al extremo C-terminal. 3. La enzima Hhat cataliza la unión del palmitato a través de enlace amida al extremo N-terminal. 4. El mecanismo mediante el cual una molécula tan hidrofóba sale de la célula no está claro aunque lo más probable que salga mediante vesículas.

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© Resh 2016

Palmitoleatoiación de proteínas Wnt Las proteínas wnt son una familia de glucoproteínas segregadas que desempeñan funciones esenciales en el desarrollo embrionario y en el mantenimiento de tejidos. Las proteínas Wnt son modificadas por una forma monoinsaturada de palmitato, cis-Δ9-palmitoleato, que se une a través de un enlace oxiéster a un residuo de serina conservado. La palmitoleatoiación de las proteínas Wnt en el RE la cataliza la enzima Porcupine (PORCN), una proteína de membrana multipaso de la familia MBOAT, es un proceso con varios pasos. © Resh 2016

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1. Síntesis de un precursor que tiene un péptido señal que le hace entrar directamente en el RE y que es cortado tras la entrada. 2. La enzima estearoil-coA desaturasa 1 (SCD1) cataliza la formación de palmitoleiolo-CoA a partir de palmitoil-CoA. 3. La enzima porcupine transfiere el ácido graso a la cisteína de Wnt. 4. Wnt palmitoleatoiada interacciona con la enzima Wntless. 5. Wnt+Wntless salen mediante vesículas. La palmitoleatoiación de Wnt ha demostrado recientemente ser reversible. El ácido graso puede escindirse del Wnt por Notum, un antagonista de Wnt.

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Acilación grasa de la proteína Grelina. La grelina es una hormona ácido peptídica sintetizada principalmente en el estómago. El octanoato, ácido graso de ocho carbonos, se une covalentemente a la grelina y se obtiene la grelina acilada que es la única forma en la que puede unirse al receptor de secretagogo de la hormona de crecimiento, un receptor acoplado a la proteína G. La Octanoilación de la grelina es catalizada por la enzima GOAT (Grelina O-acil transferasa), una proteína de membrana multipaso localizada principalmente en el tracto gastrointestinal.

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¿Cómo se entregan los sustratos de acil CoA graso? Las 3 enzimas de la familia MBOAT que hemos estudiado, Hhat, PORCN y GOAT, tienen como sustratos proteínas secretadas, que entran en el lumen del ER a través de una secuencia señal. Por lo tanto, los donantes de acilo graso, los acil CoA grasos que se esterifican en el citosol, deben entrar en el RE y al ser de cadena larga no pueden entrar a través de las membranas ¿cómo entran? Se plantea la hipótesis de que utilicen el mismo sistema de transporte que utilizan para entrar en la mitocondria, el sistema de unión a carnitina; también es posible que las propias proteínas MBOAT faciliten el transporte de los acil CoA grasos a través de la membrana del RE.

5- Las acil transferasas grasas como dianas en enfermedades humanas Las proteínas aciladas grasas son muy importantes en estados de enfermedad. Es por ello que las enzimas acil-transferasas grasas específicas tienen un gran interés terapéutico. La clave está en poder bloquear la proteína que está provocando la enfermedad sin afectar a aquellas que son necesarias para mantener la homeostasis del organismo. Un ejemplo de esto son las proteínas NMT y MBOAT. La Nmiristoilación es necesaria para que muchos patógenos humanos sobrevivan. Sin embargo, a pesar de que el sitio de unión del miristoil-CoA está altamente conservado entre humanos y patógenos, no ocurre lo mismo con el sitio de unión del péptido. Teniendo esto en cuenta se ha podido dirigir estrategias hacia NMT en especies que causan infecciones fúngicas como Trypanosoma brucei o Candida albicans. También se ha estudiado la relación existente entre los cánceres dirigidos por la vía de señalización Wnt y su relación con los inhibidores Porcn. Desde entonces se han podido desarrollar fármacos basados en estos inhibidores oralmente disponibles. Por otro lado, la ganancia de peso se encuentra estimulada por la acil-grelina, lo que convierte a GOAT en un objeto clave en el control potencial de la obesidad y sus trastornos asociados. Las interacciones complejas con otras vías de señalización que regulan el apetito pueden complicar el uso de inhibidores de GOAT como control de la obesidad. Página 6

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6- Conclusiones y perspectivas. A lo largo de este trabajo hemos podido aprender que la acilación grasa de proteínas no se reduce tan solo a que se pueda añadir un miristato o un palmitato a nuestra molécula, si no que existen una gran variedad de ácidos grasos que pueden ser usados para modificar las proteínas. Algo que aún no hemos sabido explicar es el cómo se seleccionan los sitios de palmitoilación y el hecho de que existan tantas enzimas DHHC que realicen esta modificación cuando en otros tipos de acilación es una sola enzima específica la que realiza todo el trabajo. Como concepto de tipo más aplicado, podríamos preguntarnos si es posible usar la intervención y planificación de la dieta como forma de alterar los ácidos grasos existentes en nuestro organismo y con ello poder modificar la señalización de proteínas y a su vez con esto, la señalización celular. Los avances en métodos de detección de proteínas con modificaciones lipídicas y en el campo de las imágenes en vivo, prometen un mayor conocimiento en este campo y la posible respuesta a muchas de estas preguntas.

7- Bibliografía. Buglino, J. A., & Resh, M. D. (2012). Palmitoylation of Hedgehog proteins. Vitamins and hormones, 88, 229. González Polo, Virginia (2011). Estudio del papel de las palmitoil-proteínas en la regeneración del sistema nervioso, la importancia de la palmitoilación y la ubicación en dominios lipídicos de la membrana en su función. (Universidad de Buenos Aires) Lars E.P. Dietrich & Christian Ungermann (2004) On the mechanism of protein palmitoylation. EMBO reports VOL 5.NO 11 Resh, M. D. (2016). Fatty acylation of proteins: The long and the short of it. Progress in lipid research, 63, 120-131. Wright, M. H., Heal, W. P., Mann, D. J., & Tate, E. W. (2010). Protein myristoylation in health and disease. Journal of chemical biology, 3(1), 19-35.

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