Organelli e traffico vescicolare (lo smistamento proteico) PDF

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organelli coinvolti nel traffico vescicolare, lo smistamento proteico....

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! La cellula eucariotica è una cellula altamente compartimentalizzata. ! ! ! Il contenuto degli organelli, così come la composizione molecolare delle membrane che li delimitano deve essere mantenuto costante per preservare l’identità degli organelli e l’organizzazione funzionale della cellula.! ! In una cellula eucariotica la membrana plasmatica rappresenta solo una piccola porzione del sistema di membrane che delimita i compartimenti cellulari : gli organelli intercellulari hanno solitamente una superficie membranosa totale che supera di gran lunga quella della membrana plasmatica.! ,! Ogni compartimento ha il suo corredo caratteristico di proteine, lipidi e altre molecole che determinano la sua funzione. ! ! La maggior parte delle molecole che formano gli organelli non vengono sintetizzate dagli stessi, ma in altre parti della cellula, e quindi devono essere trasportate. ! ! Lo smistamento delle proteine è quindi di importanza fondamentale per la creazione e il mantenimento dell’identità del compartimento. ! ! • La sintesi proteica comincia sempre nel citoplasma. Essa però continua in luoghi differenti a seconda del destino della proteina tradotta ! ! • lo smistamento a livello dei distretti cellulari può essere di 2 tipi: ! -smistamento co-traduzionale -smistamento post-traduzionale ! Entrambi i tipi di smistamento sono però mediati dallo stesso tipo di ribosomi. ! ! Le Proteine sintetizzate dai ribosomi liberi nel citoplasma sono: ! -le proteine del citosol ! -le proteine periferiche di membrana ! -le proteine nucleari! -le proteine di mitocondri e cloroplasti! -le proteine dei perossisomi! ! Le proteine sintetizzate dai ribosomi del RER (reticolo endoplasmatico rugoso) sono: ! -proteine che devono essere secrete ! -proteine integrali di membrana! -proteine solubili che risiedono nei compartimenti del sistema delle endomembrane ! ! Come si spostano le proteine all’interno della cellula?! ! • utilizzano il trasporto attivo attraverso i pori se devono arrivare nel NUCLEO!

• Utilizzano un trasporto di tipo transmembrana se devono arrivare dal citoplasma ai mitocondri, cloroplasti o perossisomi! ! • Utilizzano un trasporto vescicolare se devono muoversi dal RE nel distretti del golgi o della membrana plasmatica ! ! ! SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE ! ! Il movimento delle proteine attraverso il RE, il Golgi, i lisosomi, gli endosomi e le vescicole di trasporto definisce il sistema delle endomembrane. Il sistema delle endomembrane è una associazione di organelli che comunicano attraverso vescicole.! ! È un sistema dinamico, in cui le vescicole trasportano materiali da un compartimento all’altro attraverso diverse vie di trasporto: ! ! -vie di biosintesi e secrezione dal RE al golgi alla membrana ! ! -via endocitica : i materiali dalla superficie cellulare si muovono verso i compartimenti cellulari (endosomi e lisosomi)! ! ! Il movimento di queste vescicole può essere ! -anterogrado : movimento di secrezione verso l’esterno ! -retrogrado: se c’è un movimento di endocitosi verso l’interno ! ! VIA SECRETORIA (ANTEROGRADA)! ! • La via anterograda è necessaria per tutti i processi di crescita cellulare, per la formazione degli organelli e per i processi di comunicazione cellula-cellula che richiedono la produzione di un segnale chimico da riversare all’esterno della cellula. ! ! Questo processo secretorio parte dal RETICOLO ENDOPLASMATICO, e si muove attraverso il sistema di membrana. ! ! Il reticolo endoplasmatico comprende una regione liscia e una regione rugosa ! È costituito da sottili tubuli e cisterne che definiscono uno spazio, il lume, separato dal citosol.! ! Il RER è sempre più vicino al nucleo rispetto al REL. ! Il lume del RER è in continuità con il doppio strato fosfolipidico della membrana nucleare.! ! -IL RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO è ! ! • la sede della sintesi dei fosfolipidi di membrana ! ! I fosfolipidi sono sintetizzati sulla faccia citoplasmatica del reticolo endoplasmatico liscio a partire da precursori idrofilici (glicerolo e acidi grassi).! ! Dopodiché è necessaria una Filippasi che determini il passaggio nello strato sottostante della membrana (in quanto l’accrescimento deve essere omogeneo.!

• tutti i fosfolipidi di membrana vengono prodotti dal REL, sia quelli destinati al sistema di endomembrane sia quelli destinati ad altri organelli. ! ! • Tutti gli organelli del sistema delle endomembrane vengono riforniti di lipidi attraverso il movimento delle vescicole, mentre gli altri organelli utilizzano dei trasportatori proteici che prendono dal Reticolo endoplasmatico i fosfolipidi prodotti e li inseriscono nell’organello bersaglio.! ! ! • Sede di sintesi degli ormoni steroidei (gonadici e corteccia surrenale) ! • Catabolismo di molti composti organici (nel fegato: detossificazione dai farmaci) ! • Sequestro del calcio citoplasmatico (Ca2+) quando non è necessario alla cellula. ! • Ha un ruolo molto importante nel catabolismo del glicogeno epatico:! ! Le cellule epatiche contengono a livello della membrana plasmatica una proteina, la GLUT2, che ha, a differenza di altre GLUT, la funzione di trasportare glucosio all’interno e all’esterno della cellula. ! ! Questo perché, a livello del reticolo endoplasmatico liscio, sono presenti degli enzimi che contribuiscono a “smontare” la molecola di glicogeno presente nella cellula: il glucosio viene staccato dalla molecola di glicogeno aggiungendo un gruppo fosfato, formando così un glucosio-6fosfato, che ha bisogno di essere defosforilato per uscire dalla cellula.! Perciò a livello del REL trova una fosfatasi che opera questa modifica. ! ! A questo punto diventa substrato del GLU-T2 che permette il passaggio all’esterno. ! ! ! IL RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO ! Il RER è coinvolto nella biosintesi di proteine destinate ad altri compartimenti cellulari, alla membrana plasmatica e ad essere secrete, ! ! Il RER è abbondante in cellule con attività di sintesi proteica (ad esempio, un linfocita B ATTIVO o un fibroblasto).! ! • Per dimostrare che il percorso delle proteine di secrezione muovesse dal GOLGI verso l’esterno della cellula, G. Palade effettuò un esperimento su dei porcellini d’india. ! ! • iniettò nell’animale un amminoacido radioattivo, la leucina. Dopo una prima iniezione veniva somministrata al porcellino una nuova iniezione di leucina fredda (non marchiata). ! ! • Prelevò poi il fegato dell’animale (una delle regioni a maggiore produzione di vescicole secretorie) e osservò dove era collocata la radioattività a tempi differenti dall’iniezione.! ! • Quello che osservò è che la radioattività in tempi brevi dalla somministrazione era localizzata nel RER, dopodiché si spostava nelle vescicole di secrezione per poi riversarsi all’esterno delle cellule. ! ! Le proteine devono raggiungere i diversi compartimenti cellulari per svolgere la loro specifica funzione ! !

! 2 meccanismi : ! ! 1) la presenza di sequenze segnale (di destinazione) nella catena polipeptidica ! ! 2) modificazioni post-traduzionali (come la glicosilazione) che aggiungono segnali di destinazione ! ! ! Come mai una proteina sintetizzata dal ribosoma si va a collocare a livello del RE?! ! Il sistema utilizzato è quello della sequenza segnale: sono delle sequenze segnale che portano le proteine, in fase di sintesi, a livello del RE. ! ! La sintesi proteica può essere effettuata in vitro, facendo interagire RNA e ribosomi che svolgono la traduzione. ! ! Parallelamente si estraggono da un tessuto delle proteine di secrezione che esprimano lo stesso gene fatto trascrivere in vitro, così da avere la stessa proteina in entrambi i casi. ! ! Si osserva che la proteina prodotta in vitro è sempre più grande (più lunga) della proteina prodotta in vivo. ! ! ! • Un altro esperimento consiste nel rompere le cellule: in seguito alla rottura della cellula anche il RER si rompe e forma delle vescicole chiamate microsomi che possono sintetizzare proteine.! ! Questi microsomi vengono purificati attraverso un gradiente di sedimentazione e si osserva cosa questi microsomi siano in grado di produrre nel corso della traduzione sia in presenza che non di una proteasi (enzima che taglia le proteine): ! i microsomi producono una proteina che è della stessa dimensione di quella delle cellule intatte, che rimane la stessa anche se aggiungo le proteasi. ! ! Questo avviene perché la proteina prodotta dai microsomi deve essere contenuta all’interno della loro vescicola, e non portata fuori, in questo modo non può essere degradata dalla proteasi. ! ! Questa è la prova che le proteine di secrezione sintetizzate a livello del RER entrano a far parte del lume dell’organello, per questo deve esserci un ribosoma che consente il passaggio della proteina neo sintetizzata all’interno del doppio strato fosfolipidico.! ! Perché questo ribosoma è associato al RER? ! Perché il segnale di dove deve avvenire la sintesi è un segnale amminoacidico che è contenuto nella proteina stessa: c’è un peptide segnale, un piccolo tratto della proteina nascente, che dirige il ribosoma che sta sintetizzando quella proteina sul RE. ! ! ! Quindi: ! ! 1. Tutte le proteine cominciano la loro sintesi nel citoplasma, ! ! 2. a un certo punto della traduzione viene sintetizzato un peptide segnale che blocca t t l t d i f t il ib l RE

! 3.Il peptide segnale viene riconosciuto da una particella chiamata SRP (particella di riconoscimento del segnale) che si lega al peptide segnale e blocca la traduzione fino a quando non raggiunge la membrana del RE dove trova un recettore, il recettore della SRP, che le permette di ancorare il ribosoma sulla membrana. ! ! 4.A questo punto l’SRP viene rilasciata e la traduzione continua normalmente, grazie al recettore dell’SRP che colloca il ribosoma a livello di un complesso multi proteico che definisce un canale attraverso il quale la proteina viene integrata.! ! 5. Quando la traduzione termina, un enzima che si trova all’interno del lume, la peptidasi del segnale, taglia la sequenza segnale e rilascia la proteina all’interno del lume. ! ! La SRP è una particella che ha una doppia composizione: è costituita sia da RNA che da proteine; la componente a RNA è quella che prende contatto con il ribosoma e blocca la sintesi proteica in fase di allungamento perché compete con i fattori di allungamento proteici.! ! ! ! • A livello del RE vengono prodotte anche le PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA, che sono collocate in membrana perché, oltre alla sequenza segnale, possiedono un’altra sequenza detta sequenza di arresto del trasferimento e di ancoraggio alla membrana.! ! ! Questa è una sequenza idrofobica che, nel momento in cui viene sintetizzata, prende contatto con il complesso multi proteico che forma il traslocone (cioè il canale che permette il passaggio delle proteine all’interno del lume) e viene circondata dai fosfolipidi di membrana, ancorando la proteina alla membrana. ! ! Nel momento in cui la proteina viene ancorata una delle due estremità rimane all’interno del lume, ma cosa determina l’orientamento carbossi-terminale della proteina da un lato piuttosto che dall’altro?! ! 1. Nelle proteine monopasso a definire quale estremità affaccia nel lume e quale nel citoplasma è la composizione amminoacidica che precede la sequenza di arresto: ! -se è preceduta da uno stretch di amminoacidi con carica positiva, e seguita da uno stretch di amminoacidi prevalentemente a carica negativa =avremo l’orientamento di N-terminale all’interno del citoplasma; ! -al contrario, se la sequenza di arresto è preceduta da uno stretch di amminoacidi negativi e seguita da uno stretch di amminoacidi positivi la proteina avrà l’N- terminale all’interno del RE.! ! 2. Le proteine multipasso, invece, alternano due sequenze differenti: una sequenza di inizio di traslocazione che blocca il passaggio del polipeptide nascente a livello della membrana, e una sequenza di stop della traslocazione che, di nuovo, ancora il polipeptide alla membrana.! ! ! ! MODIFICHE POST TRADUZIONALI ! Oltre alle sequenze segnale, a determinare lo smistamento delle proteine sono anche le modificazioni post-traduzionali. ! ! Queste avvengono sia all’interno della via di secrezione, sia nel citoplasma. ! A i f i difi i i d i li h i li di d i i

-all’interno della via secretoria ! -nel citoplasma-! ! ! Nel RE le proteine che sono nel lume: ! ! • subiscono una serie di tagli proteolitici, non solo quello a carico della peptidasi del segnale che le rimuove dal traslocone, ma anche altri che saranno funzionali alla loro operatività. ! ! • le proteine vengono glicosilate, cioè vengono aggiunti loro zuccheri, questa glicosilazione non avviene monosaccaride per monosaccaride, ma si ha la formazione di polisaccaridi che vengono trasferiti, dall’oligosaccariltransferasi, sulle proteine che li devono ricevere. ! ! • Inoltre, si formano una grande quantità di ponti disolfuro, a causa dell’abbondanza di un enzima, la disulfide isomerasi, e si ha un ripiegamento corretto delle proteine grazie anche al sostegno degli chaperones molecolari. In particolare la proteina BiP, che una chaperonina (un HSP70), è coinvolta nella traslocazione delle proteine attraverso il doppio strato fosfolipidico. ! ! ! LE TAPPE DELLA GLICOSILAZIONE NEL RER ! Le tappe della glicosilazione delle proteine prevedono che un complesso costituito da diversi zuccheri in particolare:! ! 2 N- acetilglucosammina, 9 mannosi e 3 glucosi,! ! venga, nel suo complesso, trasferito alle proteine: questa è la prima fase della glicosilazione delle proteine. ! ! 1. Questo polisaccaride viene assemblato in parte nel citosol e poi, utilizzando enzimi simili alle flippasi, viene traslocato nel RE dove viene completata la sua formazione. ! ! 2. Questa struttura viene aggiunta ad un amminoacido asparagina, legandola ad un suo azoto, oppure a residui di serina e treonina utilizzando l’ossigeno come punto di legame.! ! L’aggiunta di zuccheri aumenta la solubilità delle proteine e partecipa al controllo del folding delle proteine: una volta che la proteina è entrata nel lume del RE ed è stata modulata dalle chaperones molecolari, dopo la glicosilazione entra in contatto con un'altra chaperonina, la calnexina. ! ! • La proteina glicosilata subisce la rimozione di due glucosi e lega la calnexina che controlla il ripiegamento: ! ! 1. se questo è corretto viene rimosso l’ultimo glucosio e la proteina prosegue il suo viaggio, ! 2. se invece il ripiegamento risulta scorretto l’ultimo glucosio eliminato viene poi nuovamente aggiunto, e la proteina così marcata torna ad associarsi con la calnexina tentando un nuovo ripiegamento! 3. nel caso in cui il ripiegamento risulti ancora scorretto la proteina, privata nuovamente dell’ultimo glucosio, intraprende una via degradativa che la vede trasportata al di fuori del RE da una serie di proteine e rilasciata nel citosol dove viene degradata da un proteasoma! ! ! Anche le proteine ancorate alla membrana plasmatica subiscono modifiche post-traduzionali: il l h l i di i l b d i d ll’ i t di d t i t l

polipeptide.! ! Caratteristico target di questa modalità di modificazione post tradizionale è la proteina Ras, che è coinvolta nella trasduzione del segnale e nell’insorgenza di patologie tumorali, infatti una mutazione della proteina induce la divisione incontrollata della cellula. ! ! Un target molecolare di tumori in cui Ras è mutata, è andare ad interferire con il suo ancoraggio alla membrana, in quanto il mancato ancoraggio ne impedisce il funzionamento.! ! ! • Una volta che le proteine sono state modificate all’interno del RE, attraverso una serie di vescicole, raggiungono l’apparato del Golgi, il quale è formato da una serie di cisterne sovrapposte non omogenee le une con le altre, ma sono individuabili al suo interno delle regioni: ! • una regione cis Golgi (vicina al RE), ! • una regione trans Golgi (lontana dal RE),! • e una regione mediana (intermedia).! ! • Una definizione più precisa determina anche delle cisterne peculiari tra la regione cis e quella mediana e tra quest’ultima e la regione trans.! ! All’interno di ciascuna cisterna avvengono delle reazioni specifiche: l’apparato di Golgi modifica le proteine introducendo gruppi fosfato, inducendo tagli proteolitici e alterando la ramificazione glicosidica delle proteine, ricevuta a livello del RE. ! La modifica della glicosilazione delle proteine all’interno del Golgi ne definisce anche il destino finale.! ! ! Come si differenziano tra loro le varie cisterne membranose del Golgi? ! ! 1. MODELLO DI TRASPORTO VESCICOLARE: Secondo uno dei modelli più accreditati il trasporto di vescicole tra le varie regioni del Golgi (cis, mediana e trans) distingue il contenuto vescicolare:! ! le cisterne cis ricevono le vescicole dal RE e questo le caratterizza come tali, all’interno di esse avvengono poi delle modificazione (FOSFORILAZIONE DI OLIGOSACCARIDI SU PROTEINE LISOSOMIALI) e, attraverso ulteriori vescicole, le sostanze modificate andranno nella regione intermedia, definendola e infine nella regione trans, definendo anche questa. ! ! Perciò sono le sostanze trasportate che definiscono la caratteristica delle cisterne del Golgi. ! ! ! 2. MODELLO DI MATURAZIONE DELLE CISTERNE : Un'altra teoria, invece, ipotizza che le cisterne del cis-Golgi ricevano del materiale, con un movimento retrogrado, dalle cisterne mediane. Ed è questo movimento che converte la cisterna cis alla cisterna mediana. ! ! Quindi sono gli enzimi presenti nelle cisterne mediane che riversati nelle cisterne cis, ne modificano la composizione trasformandole in cisterne mediane.! ! Le cisterne mediane a loro volta ricevono dalle cisterne trans del materiale, che opera delle modificazioni e definisce la tipologia della cisterna.! ! Perciò nel modello di trasporto vescicolare è un movimento anterogrado di vescicole che definisce le caratteristiche delle singole cisterne. ! ! Vi l d ll di t i d ll i t è i t t d di t i l h

definisce la composizione delle cisterne.! ! ! Qual è lo scopo del trasporto vescicolare? Recapitare molecole specifiche in compartimenti precisamente definiti senza che passino per il citoplasma. ! -Ciò riguarda in primo luogo le proteine di secrezione che posso muoversi secondo un meccanismo che può essere:! ! • una secrezione costitutiva, come quella dei fibroblasti, che producono costantemente collagene, o negli epatociti che continuamente producono proteine plasmatiche! ! • una secrezione regolata, come nelle cellule del pancreas che producono enzimi digestivi! solo in presenza di nutrienti, o nelle cellule beta e alfa delle isole del langherans, sempre nel pancreas! ! ! • altre proteine che si muovono lungo la via secretoria sono:! ! -proteine che costituiscono il glicocalice (glicoproteine della membrana plasmatica)! -proteine lisosomiali ! -proteine del reticolo endoplasmatico ! -proteine del golgi ! ! Quindi esiste sia un traffico vescicolare regolato che uno costitutivo e sia un traffico vescicolare indirizzato verso l’esterno che uno indirizzato verso gli organelli cellulari. ! ! • Le vescicole che trasportano proteine solubili e proteine di membrana si muovono in 2 direzioni:! ! -traffico anterogrado: dal RER all’apparato di golgi ! -traffico retrogrado: dal golgi al RER ! ! • Le vescicole sono rivestite da proteine, e queste proteine di rivestimento hanno due funzioni: ! ! -funzione regolativa: aiutano a selezionare le molecole che devono essere trasportate dalla vescicola, e indirizzano la vescicola al compartimento appropriato.! ! -funzione strutturale: aiutano la formazione delle vescicole (che aiutano effettivamente nella produzione della vescicola).! ! Per formare una vescicola serve:! la proteina cargo, che è la proteina all’interno del lume dell’organello! un recettore per la proteina di carico in grado di legare questa proteina solubile! delle proteine di carico della membrana, che assemblano le proteine di rivestimento! cioè le proteine strutturali che costringono la membrana plasmatica a legarsi! proteine che idrolizzano GTP, in quanto la formazione delle vescicole è un processo che! richiede energia ! ! proteine SNARE, necessarie per la fusione della vescicola con il suo target specifico.!

• L’energia per la formazione delle vescicole è fornita dall’idrolisi del GTP attraverso l’utilizzo di proteine G che trovano il loro scambiatore GTP a livello della membrana dell’organulo in cui devono veicolare la vescicola. ! • Nel mom...