P2 Sangre II. Hemolisis PDF

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Practica 8

PARÁMETROS SANGUÍNEOS: fragilidad eritrocitaria 1.- Resistencia globular La membrana del eritrocito es fundamental para su función en el organismo, ya que los procesos relacionados con la difusión (intercambio de gases) y deformabilidad de estas células dependen directamente de las condiciones en las que se encuentre dicha membrana. La presión osmótica absoluta depende del número total de partículas en solución considerándose, que la presión osmótica selectiva depende del número de partículas que no pueden difundir a través de una membrana determinada. Esta presión osmótica selectiva recibe el nombre de tonicidad. La tonicidad esta en relación con la permeabilidad de la membrana y sólo puede ser evaluada observando el efecto osmótico que una determinada solución ejerce sobre un sistema biológico específico. Podemos considerar que una disolución es isotónica con el contenido de una determinada célula, cuando a través de la membrana celular, ejerce el mismo efecto osmótico que los constituyentes celulares y no determina por tanto cambios en el volumen celular. Es hipotónica en relación con el contenido intracelular, cuando provoca un aumento del volumen celular y por el contrario decimos que es hipertónica con respecto al medio intracelular si provoca una reducción del mismo. Cuando un determinado tipo celular se coloca en un medio hipótonico, el agua pasa del medio extracelular al interior de la célula. Si la disolución que baña la célula es lo suficientemente hipotónica, el agua va pasando al espacio intracelular hasta que se alcanza un volumen crítico, en el cual la cubierta celular está sometida a una distensión excesiva y se produce la rotura de la membrana celular. Decimos entonces que se ha producido la lisis de la célula. En el caso particular del eritrocito, recibe el nombre de hemólisis el proceso mediante el cual se produce la rotura de la membrana celular con la liberación de hemoglobina al exterior. La hemólisis puede ser producida por un gran número de agentes y circunstancias. Desde el punto de vista de su mecanismo de acción podemos distinguir: Hemólisis de tipo osmótico, debida a un aumento del tamaño celular producido por el flujo osmótico, el cual está a su vez, determinado por la diferencia en la concentración de solutos entre el medio intra y extracelular. El ejemplo más simple en este caso es el producido por el agua destilada o las disoluciones salinas muy hipotónicas. Hemólisis de tipo no osmótico, caso en el que la lisis o rotura no es debida al hinchamiento o aumento del volumen intracelular, sino a una perturbación en la integridad de la membrana celular. Este tipo de hemólisis se produce cuando se agita una suspensión de hematíes con éter dietílico u otros disolventes de los lípidos. Los test de fragilidad eritrocitaria se usan como medida de la resistencia de la membrana a su ruptura y resultan eficaces para la detección de anemias hemolíticas. Normalmente estos test se realizan en muestras con sangre entera con un rango de diferentes presiones osmóticas usando soluciones con concentraciones de NaCl variables. Las curvas de hemólisis, por tanto, se construyen representando el % de hemólisis frente a la concentración de NaCl y representan la frecuencia de distribución de las fragilidades individuales de los eritrocitos presentes en la muestra. La [NaCl] en la que el 50% de la población celular se encuentra hemolizada (H50) se toma generalmente como medida de la fragilidad eritrocitaria. Objetivos Determinar la resistencia globular de hematíes de sangre normal . Material Preparación de las soluciones de hemólisis Solución de NaCl al 1% Pipetas Micropipetas Tubos de ensayo

Preparación de las soluciones de hemólisis de sangre de OVEJA Tubo

ml NaCl 1%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4,5 3,8 3,6 3,4 3,2 3 2.9 2,8 2,6 0

ml H20

0,5 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2.1 2,2 2,4 5

(NaCl) M

0,154 0,130 0,123 0,116 0,109 0,103 0,099 0,096 0,089 0

(NaCl) %

0,9 0,76 0,72 0,68 0,64 0,60 0,58 0,56 0,52 0

Preparación de las soluciones de hemólisis de sangre de RATA Tubo

ml NaCl 1%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4,5 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,4 0

ml H20

(NaCl) M

0,5 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 3,1 3,6 5

0,154 0,085 0,082 0,079 0,075 0,072 0,068 0,065 0,048 0

(NaCl) % 0,9 0,5 0,48 0,46 0,44 0,42 0,40 0,38 0,28 0

PROCEDIMIENTO Añadir 50 μl de sangre a cada tubo, incubar 15 minutos a 37º C, transferir el contenido a otro tubo y centrifugar 10 minutos a 3000 RPM. Leer la absorbancia a 450 nm frente al blanco (solución salina al 0,9%). Calcular los porcentajes de hemólisis siendo 100% la hemólisis total (tubo 10) Las curvas de hemólisis se pueden construir de los datos experimentales a partir de la ecuación:

H=

1 e

β ( X − X 50 )

+1

Donde H es la fracción de células hemolizadas, X la concentración molar de cloruro sódico, X50 la fragilidad eritrocitoria media y β la amplitud de la distribución. En forma lineal:

ln

1− H = βX − βX 50 H

y si representamos ln

1− H vs. [NaCl] obtendremos una línea recta cuya intersección con el H

eje de abscisas será X50. Ambos parámetros, β y X50, se pueden calcular a partir de la ecuación según:

β=

n∑ xy − ∑ x∑ y n∑ x 2 −

(∑ x ) 2

⎡ x 2 y − x xy ⎤ ∑ ∑ ∑ ∑ ⎥− 1 X 50 = ⎢ 2 ⎥ β ⎢ x2 − ∑x ∑ ⎦ ⎣

(

)

Otra representación muy interesante es -dH/dX vs. [Cl-Na+] que corresponde a la distribución de las diferentes poblaciones de eritrocitos. Cuanto mas ancha es la distribución, mayor número de poblaciones eritrocitorias existen en relación a la resistencia osmótica. Numéricamente, esta distribución es interpretada por la β de tal forma que cuanto más amplia (más ancha) es la distribución el valor de β es menor. Se representará el porcentaje de hemólisis frente a las concentraciones de NaCl. El cálculo de X50 y β se realizará con una hoja de cálculo. 2.- VALOR HEMATÓCRITO Introducción El hematocrito puede definirse como el porcentaje en volumen ocupado por lo eritrocitos en una determinada muestra de sangre. Su valor varía en relación al número y tamaño de los hematíes, así como con el volumen del plasma. Es una prueba hematológica de rutina y bastante más segura que el recuento de células sanguíneas. Junto con este último y la cantidad de hemoglobina constituyen las tres pruebas hematológicas básicas que nos permitirán determinar índices muy útiles en hematología. Existen muchos procedimientos para la determinación del volumen celular, siendo los más asequibles los llamados directos o de sedimentación rápida. Se emplean tubos especiales para la centrifugación de sangre incoagulable, llamados tubos de Wintrobe, en los cuales se coloca la sangre y se somete a una enérgica centrifugación hasta que permanezca a una altura constante la columna de glóbulo. La graduación del tubo permite obtener cómodamente la relación entre el volumen de plasma y de glóbulos. Para pequeñas muestras de sangre, se utilizan los capilares de microhematocrito. Material Capilares de microhematocrito o tubos de Wintrobe Centrifuga Regla graduada Pipetas Pasteur

Método El tubo de Wintrobe es un tubo de 10 cm con un diámetro interno de 3 mm. Está graduado en mm desde 10 cm, y generalmente lleva dos escalas, la izquierda con el cero abajo y el 100 arriba, que sirve para la determinación del valor hematocrito, y la derecha, con el 100 abajo y el cero arriba, para el cálculo de la velocidad de sedimentación. Se llenan los tubos de hematocrito con sangre hasta la última división con ayuda de una pipeta Pasteur, cuidando de no introducir burbujas que impedirían llenar por completo el tubo. A continuación se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 15 minutos, leyendo el porcentaje alcanzado por el sedimento, que vendrá dado por la relación entre la altura alcanzada por la columna de plasma respecto a la de la masa globular. En el caso de tratarse de una pequeña muestra de sangre, se utiliza un capilar para ello se introduce uno de los extremos en la sangre y se inclina hacia abajo el otro extremo. Retirar el tubo capilar y eliminar cualquier resto de sangre de su superficie externa. Se cierra seguidamente un extremo del tubo taponándolo con plastilina. Situar el capilar sobre la platina de la centrifuga para microhematócrito con el borde cerrado orientado hacia la parte periférica. Centrifugar el capilar durante 5 minutos a 10.000 r.p.m. Con la regla medir la longitud que ocupa en el capilar la columna de los eritrocitos sedimentados y referirla en el tanto por ciento a la longitud total de la columna de sangre que llena el capilar....