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Esterilización de material y medios de cultivo ...

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Universidad Nacional Autónoma de México Departamento de Biología Laboratorio de Microbiología Experimental “Esterilización de material y medios de cultivo” Equipo 4 .Ríos Garcés Daniela. Serrano Ortiz Itzy Natalia

Resumen. En el laboratorio de microbiología experimental es de gran importancia el manejo del material de trabajo que se emplea para llevar a cabo las técnicas de siembra e inoculación de microorganismos. En este artículo se expone la manera correcta de promover la esterilidad y de mantener el material en asepsia; para evitar que crezcan microorganismos ajenos a lo que se requiera para trabajar o estudiar. Esto va encaminado a la preparación de medios de cultivo donde el microorganismo pueda obtener los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo así como el control sobre cualquier otro microorganismo que pudiera generar competencia para la supervivencia del objeto de estudio. Se prepararon tres diferentes medios de cultivo de Agar Triptona Soja , clasificados por el porcentaje de agar que contenían: sólido, semisólido y caldo nutritivo. Todos ellos se sometieron a esterilización para su posterior uso en la siembra de microorganismos. Palabras clave: esterilización, autoclave, medios de cultivo, agar, asepsia, crecimiento.

Resultados. Lavado del material El material de vidrio se lavó con el fin de eliminar la mayor parte de carga microbiana, así como cualquier partícula de tamaño considerable que estuviera contenida en el material. Para ello se utilizó la menor cantidad de agua y jabón posibles, que no dejará residuos difíciles de eliminar. Una vez limpio, se realizó un enjuague con agua corriente para asegurar que no hubiera residuos de jabón, para posteriormente realizar un último enjuague con agua destilada o solución salina isotónica. El material se colocó debajo de una toalla absorbente y se dejó secar al aire. En el lavado de material hay que verificar que:

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Las paredes no se encuentren manchadas ● No haya residuos dentro como espuma o pelusas ● El pH sea neutro Para corroborar que el agua con la que se enjuago el material es neutra, se realizó la primera verificación que consistió en la medición del pH a través de tiras reactivas de dos de los materiales usados siguiendo el concepto de que todos los materiales se lavaron de la misma manera obteniéndose los siguientes resultados: material analizado

pH obtenido

Matraz erlenmeyer de 200 mL

neutro

Tubo de ensayo de 18 x 150 mm

neutro

Empacado del material Se realizó el empaquetamiento del material para enviarlo a esterilización mediante autoclave a 121 ºC por 15 min. Ésta técnica se llevó a cabo en el autoclave del laboratorio 1D, pero también se puede realizar en los autoclaves del departamento de Biología. En la siguiente tabla se resume la manera en que se prepara cada material para su esterilización (figura 5, 7, 10). Es importante recalcar que la esterilización de matraces y tubos de ensaye se llevó a cabo con el medio de cultivo en ellos, pues su función es contenerlo para su posterior uso en las cajas de petri.

Material

matraz erlenmeyer

pipetas serológicas

Preparació n con torunda de algodón

Manera de empaqueta do

Recuadro de algodón de aprox. 5x7 cm que cubra la boca del tubo, dejando a 2 cm dentro de él sin apretarlo demasiado pero, que evite que se humedezca.

Se colocaron todos los tubos dentro de una lata de metal a la que posteriorme nte se le colocó un capuchón en forma de tapa de la lata.

Se esterilizó en el autoclave del salón el cual alcanzó una temperatura de 121°C, 15 lb por 20 min.

No usan algodón.

Se envuelven en paquetes de tres, situándose en el centro y doblando las esquinas.

Se esterilizaron en el autoclave del departament o, el cual esteriliza a 121°C, 15 lb por 15-20 minutos.

Hisopos de algodón y palillos de madera.

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Se colocaron envueltos en paquetes de 3 ó 4 de una manera similar a las pipetas serológicas.

Se esterilizaron en el autoclave del departament o, el cual esteriliza a 121°C, 15 lb por 15-20 minutos.

pipetas pasteur

Pequeña porción de algodón que cubriera el extremo al que se conecta de la propipeta y que permitiera la toma del líquido sin quitarla.

tubos de ensaye

cajas petri

Condicione s de esterilizaci ón.

Recuadro de algodón de aprox. 8x16 cm que cubriera la boca del matraz, sin apretarlo demasiado pero, que evite que se humedezca el interior con el vapor del autoclave.

Con un capuchón de papel estraza en forma de barco que cubriera la torunda de algodón así como ⅓ del cuello del matraz. Asegurar con maskin tape.

Se esterilizó en el autoclave del salón el cual alcanzó una temperatura de121°C, 15 lb por 20 min.

Pequeña porción de algodón que cubriera el extremo al que se conecta de la propipeta y que permitiera la toma del líquido sin quitarla.

Con tiras de papel kraft se envuelven por separado y en forma diagonal comenzand o con la punta. Se depositan en un cilindro metálico o en un papel de mayor tamaño todas juntas.

Se esterilizaron en el autoclave del departament o, el cual esteriliza a 121°C, 15 lb por 15-20 minutos.

Se envuelven de la misma manera que las pipetas serológicas, solo que se comienza por la parte más gruesa para evitar romperlas.

Se esterilizaron en el autoclave del departament o, el cual esteriliza a 121°C, 15 lb por 15-20 minutos.

Para utilizar el esterilizador del departamento es necesario llenar unas papeletas que se colocan en el exterior de lo que se vaya a esterilizar para mantener el control. Se llenan con la siguiente información (figura 12). ● nombre ● materia y grupo ● descripción del material ● fecha de entrada y salida.

Indicadores Se introdujeron dos indicadores diferentes para asegurar que el proceso de esterilización en los autoclaves utilizados es efectivo. (figuras 4 y 6). Indicador

Autoclave

Resultado

Tipo biológico: Ampolleta de Geobacillus stearothermophil us ATCC 7953.

Lab. 1D de microbiología.

No viró el color de la ampolleta tras la incubación.

Tipo químico: Steam-Clox

autoclave del departamento de Biología.

Tres medios círculos superiores de color verde y el círculo del centro de color rosa.

Medios de cultivo Agar Triptona de Soja Peptona de caseína…… 15 g Peptona de soja…………. 5 g Cloruro de Sodio………….5 g Agar……………………... 15 g En la etiqueta del medio de cultivo se especifica que se necesitan 40 g del medio para preparar 1000,0 mL de medio. Con estos datos se pueden calcular los gramos necesarios para preparar 160,0 mL: 40 g de medio 160, 0 mL de dis. ( 1000,0 mL de disolución) = 6, 4 g de medio

Caldo Nutritivo Peptona de caseína…… 17 g Peptona de soja…………. 3 g Cloruro de Sodio………….5 g K2 HPO4 …...…………..... 2.5 g Dextrosa……..…………. 2.5 g Para éste caso se especifica que se necesitan 30,0 g para preparar 1000,0 mL de medio. Por lo tanto: 30 g de medio 10, 0 mL de dis. ( 1000,0 mL de disolución) = 0, 3g de medio

1. Agar sólido Se prepararon 160,0 ml de Agar Triptona de Soja disolviendo 6,4 g del medio granulado en aproximadamente 80,0 mL de solución salina y cuando la mezcla resultó homogénea, se llevó hasta un volumen de 160 mL. Posteriormente se calentó hasta observar una variación de color de un tono ambarino opaco a uno un poco más anaranjado, brillante y translúcido. Después se empaquetó y se llevó a esterilizar bajo las condiciones descritas con anterioridad. Una vez estéril, se calentó a baño maría hasta que no se observaran grumos o coágulos y que estuviera perfectamente líquido. Finalmente se repartió en seis cajas petri y en un tubo de ensayo (estériles) cuidando vaciar el medio cerca del mechero y evitando quitar la tapa de la caja de petri por completo; en resumen, con una apropiada técnica aséptica para evitar el crecimiento de microorganismos antes de la inoculación. Para que el agar quede distribuido de manera homogénea en las placas, es necesario realizar movimientos circulares, hacia la izquierda y hacia la derecha, hacia arriba y hacia abajo y de un lado al otro por lo menos unas seis veces cada uno y dejar solidificar. Para el caso del tubo, se buscó obtener un medio de cultivo con forma de “pico de flauta” donde la superficie de contacto del medio sea mucho mayor, por lo que se inclinó un poco el tubo hasta solidificar. (figura 8). 2. Agar semisólido Para la realización de este medio, se partió de un caldo nutritivo y se añadió 0,5% de agar. Es por ello que se disolvieron 0,3 g del medio granulado (Agar Triptona de Soja ) y 0,05 g de agar en 10,0 mL de solución salina en un matraz Erlenmeyer. Se calentó hasta apreciar nuevamente el cambio de color sin que el medio comenzará a burbujear y se proyectara. Se vertió el medio ya disuelto en

un tubo de ensaye y se tapó con su respectiva torunda de algodón. Finalmente se llevó a esterilizar dentro de una lata de metal junto con los demás medios semisólidos del grupo. 3. Caldo nutritivo Se prepararon 10,0 mL de Caldo Triptona Soja mediante la disolución de 0,3 g de medio granulado en 10,0 mL de solución salina. A éste medio no se le agregó agar, ni tampoco se calentó para homogeneizar.

Porcentaje de eficiencia de preparación de los medios de cultivo De las seis cajas de petri preparadas con cultivo ninguna se reportó con turbidez, pelusa, ni con algún crecimiento de microorganismos o colonia. Se obtuvo el 100% de eficiencia. (Ver figura 9)

Análisis de resultados. Lavado del material La limpieza del material es la primer parte de los procesos de desinfección y esterilización. Normalmente se creería que la limpieza con agua y jabón o alguna otra sustancia detergente no causa gran impacto sobre el alto contenido de microorganismos en el material, sin embargo es muy importante que se realice correctamente ya que al hacerlo se elimina la suciedad contenida en las superficies del material que generan una barrera que impide la acción de los agentes desinfectantes y esterilizantes. (El Crisol Blog, 2017). Al no presentarse restos de jabón en el material, ni polvo o pelusas y al obtener un pH neutro durante el segundo enjuague del mismo, se concluyó que el lavado de material se llevó a cabo de manera eficiente (figura 1).

Empacado del material Es importante que el material se empaque antes de ser enviado a esterilizar para que ningún microorganismo pueda entrar o salir de éste (una vez estéril) y no se contamine. El empacado que se llevó a cabo en el laboratorio se considera eficiente, ya que ninguna torunda de algodón se humedeció y no se apreciaba condensación de agua en ninguno de los materiales de vidrio. Uso de autoclave El autoclave es una herramienta de suma importancia en el laboratorio de microbiología, tanto como el microscopio. Es u  n recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una esterilización con vapor de agua.

Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras que permite alcanzar una temperatura de 121 ºC dentro de la cámara. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización. (Gutiérrez, 2008). Dentro de las ventajas que trae el uso del autoclave se encuentran el rápido calentamiento, la buena penetración, el corto tiempo de esterilización, el bajo deterioro del material expuesto y la economicidad (López, 2006). Es muy importante conocer el correcto uso y manejo de un autoclave, en específico de los que se encuentran en el laboratorio pues con ellos se trabaja. Para ello primero hay que revisar que tenga agua suficiente, prenderlo y esperar a que se caliente. Después se introduce con cuidado

el material a esterilizar cuidando que quede bien acomodado para que no se rompa. Hay que ser muy cuidadosos al colocar la tapa y seguir la guía que conecta al depósito del agua para que el autoclave quede sellado herméticamente. Es importante que al momento de cerrar las llaves se haga de forma contralateral, es decir cerrar dos llaves en posición contraria al mismo tiempo y con la misma fuerza. Las válvulas deben encontrarse abiertas hasta alcanzar una temperatura de 121 ºC. Una vez a estas condiciones, se cierran y se cronometran 15 minutos para asegurar una correcta esterilización. Indicadores Los Indicadores biológicos son dispositivos preparados de esporas no patógenas y altamente resistentes a los procesos de esterilización y por lo tanto son útiles y eficaces para establecer la capacidad del ciclo de esterilización para destruir microorganismos específicos. Este tipo de esporas (Bacillus stearothermophilus) s e utilizan para la esterilización por vapor a presión, plasma de peróxido de hidrógeno y formaldehído. Bacillus stearothermophilus es una bacteria Gram-positiva con forma de bacilo, termófila extensamente distribuida en el suelo y es causa de descomposición de los productos alimenticios. Es usada comúnmente como organismo de validación en los estudios de esterilización. En las autoclaves de vapor se utiliza una ampolleta con esta bacteria. La ampolleta se pone en el centro del autoclave sin ningún tipo de carga, se le da el ciclo normal de 30 a 45 minutos incluyendo el secado y cuando termine se saca del autoclave y se envía al laboratorio para su incubación y observación por 48 hrs. Medios de Cultivo

Un medio se puede dividir de varias maneras, de acuerdo a su composición, a su estado físico o a su aplicación. De acuerdo a su composición: ●

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Naturales o complejos: Son aquellos en los que la composición es químicamente desconocida o no está definida y por lo tanto no puede ser constante. Estos se elaboran con ingredientes de naturaleza como tejidos, sueros, etc. Sintéticos: Estos medios se preparan añadiendo concentraciones precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos o sea se conoce la composición exacta.

Por su estado: ●

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Líquido: Tienen componentes completamente solubles, pero no pueden detectar contaminaciones. Fluido (0.1% de agar): El medio tiene una composición de agar lo que lo hace que disminuya la velocidad de disolución del oxígeno ambiental. Semisólido: Contienen agar entre el 0.2% y el 0.8%, son suaves y permiten observar la movilidad del microorganismo. Sólido: Contienen de 1.5% a 2.0% de agar lo que lo hace tener una consistencia dura que forma un soporte para el crecimiento microbiano.

Por su uso: ●

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Enriquecidos o nutritivos: Contienen componentes ricos nutritivamente y permite el crecimiento de microorganismos no exigentes. De enriquecimiento: Contiene componentes que permiten el desarrollo de un tipo microbiano y disminuyen la velocidad de

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crecimiento de la microbiota acompañante. Selectivos: Contiene componentes que inhiben el crecimiento de demás bacterias, pero permiten el desarrollo de un tipo microbiano. Diferenciales: Contiene componentes que permiten diferenciar las actividades metabólicas de los microorganismos inoculados, la presencia de indicadores o el uso de reveladores ponen de manifiesto la actividad. De mantenimiento o de conservación: Se utilizan para conservar una cepa o como controles de calidad en laboratorios. De transporte: Se emplean para el transporte de muestras sin alterar la viabilidad y proporción de microorganismos. Tienen una consistencia semisólida, amortiguadora de pH y reducidos en nutrientes. Pruebas bioquímicas: Son medios de cultivo que tienen nutrientes para poner en evidencia la actividad metabólica de un microorganismo puro.

El medio utilizado en éste experimento se trata de uno complejo ya que contiene peptonas cuya composición no está definida y se prepararon en los tres estados: sólidos en seis cajas de petri y un tubo de ensaye; semisólido en un tubo de ensaye y líquido en otro tubo de ensaye. Después de dejar los medios incubar por unos días, se percató que la técnica de preparación de éstos, así como la aséptica, son eficientes pues ningún microorganismo creció en ninguno de los medios. Así mismo, las placas de agar quedaron homogéneas, sin ningún rastro de grumos en ellas.

Conclusiones 1. Un objeto se considera estéril cuando no contiene ninguna forma de vida microbiana en él; incluyendo esporas. 2. Es muy importante que el material que será enviado a esterilizar esté bien envuelto en papel kraft o de estraza y debidamente etiquetado para mantener su esterilidad hasta su uso. 3. El uso de indicadores es muy importante ya que gracias a estos se puede saber si las condiciones de esterilidad se están cumpliendo o no. 4. Los medios de cultivo preparados tuvieron un 100% de eficiencia y no presentaron microorganismos durante su incubación, por lo que se concluye que se tuvo una adecuada técnica de asepsia.

Bibliografía 1. El Crisol Blog. (2017). Importancia de la limpieza, desinfección y esterilización del material para laboratorio. [Consultado 7/09/18]. Recuperado de: http://elcrisol.com.mx/importancia-la-li mpieza-desinfeccion-esterilizacion-del -material-de-laboratorio/ 2. Gutierrez Gamboa, S. (2008). Esterilización Por Calor Húmedo. [Consultado 7/09/18]. Recuperado de: http://www.ucv.ve/fileadmin/user_uplo ad/facultad_farmacia/catedraMicro/10 _Esterilización_por_calor_húmedo.pd f 3. López Tévez, L.; Torres, C. (2006). Preparación del material para el trabajo en Microbiología Limpieza y Esterilización. FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS. Universidad Nacional del Nordeste. [ Consultado 6/09/18]. Recuperado de: http://www.biologia.edu.ar/microgener al/tp3.pdf

4. Sterile Service. (2012). Indicadores de esterilidad. [Consultado 8/09/18]. Recuperado de: http://www.sterileservice.com.mx/files/ Indicadores.pdf

5. Ramirez, G., et.al., Manual de Prácticas de Microbiología General, Facultad de Química, UNAM: México, 2011.

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