P4-Reacción de Hill - Práctica 4 Fisiología Vegetal PDF

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Práctica 4 Fisiología Vegetal...

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FOTOSÍNTESIS: REACCIÓN DE HILL Y PRODUCCIÓN DE O2. PRÁCTICAS FISIOLOGÍA VEGETAL BIOTECNOLOGÍA

El proceso fotosintético en plantas verdes consiste básicamente en una oxido-reducción, en la que los electrones del agua pasan al carbono del CO2 en una reacción ayudada por la luz y en la que se libera oxígeno. A finales de los años 30, Robin Hill descubrió que, en presencia de luz y de un aceptor de electrones adecuado, no necesariamente el CO2, los cloroplastos aislados producen oxígeno procedente de la hidrólisis de moléculas de H2O. APRENDERÁS…

¿En qué consiste la reacción de Hill? En la hoja intacta, los principales aceptores de electrones de la fotosíntesis son la ferredoxina (Fd) y el NADP+, y en última instancia el ácido 3-fosfoglicérico. Debido a que estos aceptores naturales se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos deben ser sustituidos, en las reacciones in vitro, por otros compuestos con igual efectividad como, por ejemplo, complejos de iones férricos, benzoquinona y colorantes derivados del indolfenol. Un compuesto muy utilizado es el 2,6-diclorofenol indolfenol, más conocido por su abreviatura, DCPIP. El DCPIP, en estado oxidado (forma quinona), es de color azul, y cuando se reduce (forma fenólica), se decolora lentamente. REDOX

2𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃𝑎𝑧𝑢𝑙 + 2𝐻2 𝑂 → 2𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃 − 𝐻2 𝑖𝑛𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑜 + 𝑂2

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FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA La reacción de Hill se fundamenta en que determinadas sustancias (p.e., DCPIP) se comportan como aceptores de electrones de la FS in vitro. Con esta reacción también puede comprobarse que el agua es la fuente del oxígeno que se desprende durante la fotosíntesis

Material Hojas frescas de espinacas o cualquier especie vegetal (muy verde), mortero, probeta, embudo, gasa, matraz Erlenmeyer, tubos de centrifuga, gradilla, sacarosa 0,5 M, propilenglicol al 10%, DCPIP 0,2 mM, tampón fosfato 0,1M pH 6,5 con ClK 0,02M, 7 tubos de ensayo, pipetas de 10 ml y 2 ml, cubeta espectrofotométrica, papel de aluminio, parafilm, lámpara incandescente y tres vasos de precipitado con agua a 30, 60 y 90 cm, centrífuga y espectrofotómetro.

Procedimiento Primera fase: Aislamiento de cloroplastos 1.- Homogenizar el tejido vegetal (≈ 20 g), limpio de nervios y troceado, en un mortero frío con 10 ml de sacarosa 0,5 M fría, completando paulatinamente hasta 50 ml con la misma sacarosa. La extracción debe ser muy suave, aunque la recuperación de cloroplastos sea baja. 2. Filtrar a través de gasa en un embudo y recogerlo en un Erlenmeyer. 3. Centrifugar durante 10 min a 1000 r.p.m. Eliminar el precipitado que contiene células enteras, restos celulares y paredes. 4. Centrifugar el sobrenadante 10 min a 2500 r.p.m. En este caso, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado, que contiene los cloroplastos aislados, en 30 ml de propilenglicol al 10%.

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Segunda fase: reacción de Hill 1. Preparar 7 tubos de ensayo y añadir a cada uno los siguientes reactivos, excepto el DCPIP que se añadirá cuando se indique: Tubo

Tratamiento

Suspensión Cloroplastos 0

DCPIP

DCPIP control*

Tampón fosfato 6,5

1 2

Luz 30 cm

6

0,5

0,3

3

Oscuridad 30 cm

6

0,5

0,3

4

Luz 60 cm

6

0,5

0,3

5

Oscuridad 60 cm

6

0,5

0,3

6

Luz 90 cm

6

0,5

0,3

7

Oscuridad 90 cm

6

0,5

0,3

0,3

Todas las cantidades indicadas en ml

2. Anotar el tiempo cero (la hora en la que se añade el reactivo**), añadir 0,3 ml de la solución de DCPIP al 0,1% al tubo 1 y agitar. Medir la absorbancia a 590 nm y colocar el tubo a unos 30, 60 o 90 cm* del foco luminoso en un vaso de precipitado lleno de agua. Volver a medir la absorbancia a los 10 y 20 minutos. 3. Añadir 0,3 ml de la solución de DCPIP a los tubos 2, 4 y 6(**), de forma secuencial, agitar y medir la absorbancia a 590 nm. Colocar los tubos a 30, 60 o 90 cm del foco, según corresponda, y volver a medir la absorbancia a los 10 y 20 min. 4. Envolver cuidadosamente con papel de aluminio los tubos 3, 5 y 7(**). Añadir 0,3 ml de la solución de DCPIP a cada tubo, de forma secuencial, agitar y medir la absorbancia a 590 nm. Colocar los tubos a 30, 60 o 90 cm del foco, según corresponda, y volver a medir la absorbancia a los 10 y 20 min. Por tanto, de cada tubo habrá tres medidas, a 0 minutos y a los 10 y 20’. (**)Anotar siempre el tiempo cero para cada tubo (la hora en la que se añade el reactivo)

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Tercera fase: Resultados 1. Recoger los resultados de la práctica en las siguientes tablas. Tabla 1. Absorbancia (590 nm) 0’ 10’

20’

T1 (Control) T2 (30 cm/luz) T3 (30 cm/oscuridad) T4 (60 cm/luz) T5 (60 cm/oscuridad) T6 (90 cm /luz) T7 (90 cm/oscuridad)

Tabla 2. Intensidad luminosa Distancia al foco Intensidad luminosa (IL)* D1 (30 cm) D2 (60 cm) D3 (90 cm) *

Calcular, en términos relativos, la intensidad de luz (IL) 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑜𝑐𝑜 aplicando la fórmula: 𝐼𝐿 = , dando el valor 𝑑2 arbitrario de 100 a la intensidad luminosa del foco y los valores 1, 2 y 3 a cada distancia a la que se encuentra el foco

2. Representar gráficamente la reducción del DCPIP y/o la producción de oxígeno que se produce a lo largo del tiempo (la producción de oxígeno es proporcional a la reducción del compuesto), en relación con la distancia de los tubos al foco de luz. 3. Representar gráficamente y explicar el efecto de la intensidad luminosa (IL) sobre la reducción del DCPIP de los tubos colocados a las distintas distancias, a partir de los datos de absorbancia obtenidos.

Cuarta fase: Explicar los resultados Para explicar los resultados puede servir de ayuda responder a las siguientes cuestiones

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1. ¿Por qué se utiliza sacarosa 0,5 M como medio de extracción? Explicar 2. ¿Por qué se requiere la presencia de un aceptor de electrones para el desprendimiento de O2 observado en la reacción de Hill? 3. ¿Qué ha ocurrido en los tubos envueltos en papel de aluminio? ¿Con qué objeto se utilizan? 4. Según los resultados obtenidos ¿qué efecto tiene la intensidad luminosa sobre la actividad de los cloroplastos? Explicar a partir de las gráficas elaboradas.

FUNDAMENTO DEL TEST

Material Dos jeringas, sacabocados, hojas de espinacas, placas Petri, papel de aluminio, solución saturada de bicarbonato

Procedimiento

Las hojas, para realizar la fotosíntesis, tomarán el CO2 de la solución de bicarbonato. La producción de O2 provoca que los discos de hoja sumergidos floten ya que las burbujas quedan adheridas al disco de hoja.

1. Preparar 6 taleolas de hoja, procurando que no tengan nervios. 2. Introducir 3 taleolas dentro de cada jeringa tras quitar el embolo. 3. Volver a poner el émbolo y 4 cm de la solución de bicarbonato. 4. Tapar con el dedo la boquilla de la jeringa y realizar un vacío al tirar del émbolo. Esto provocará que la solución bicarbonatada penetre dentro del tejido. Para ello, repetir la operación hasta que se hundan las taleolas. 5. Cubrir una de las jeringas con papel de aluminio o colocarlas en un lugar oscuro. 6. Colocar la otra jeringa bajo luz intensa, en posición vertical. 7. Registrar el tiempo que tardan las taleolas en subir en cada jeringa. La jeringa situada en oscuridad servirá como control. 8. Explicar las diferencias encontradas entre la jeringa mantenida en luz y la mantenida en oscuridad. Introducir las taleolas en la jeringa

Tras llenar con 4 cc de solución de bicarbonato, hacer el vacío varias veces

Comprobar que las taleolas se hunden

Colocar la jeringa bajo un foco de luz y contar el tiempo que tardan las taleolas en subir...