Practica 05b. Determinación DE Calcio Y Hierro Sérico PDF

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas

PRACTICA DE PRACTICA N° 8 - DETERMINACION DE CALCIO Y HIERRO SÉRICO -DETERMINACIÓN DE CALCIO SÉRICO INTRODUCCION: El calcio es el catión más abundante del organismo: 1 a 2 Kg en un adulto. En su regulación intervienen las hormonas calcitriol, paratohormona (PTH) y la calcitonina. El calcitriol derivado de la vitamina D aumenta la absorción intestinal y la reabsorción renal del calcio. La PTH aumenta la resorción ósea y la liberación del calcio del hueso, y la reabsorción renal del calcio. El calcio plasmático constituye tan solo el 2 % del calcio total, mientras que el 98 % se encuentra en el esqueleto óseo. En el plasma el calcio se encuentra en tres formas: libre o iónico en un 46 % (Ca++), unido a las proteínas en un 40 % y el resto formando complejos solubles con el bicarbonato, citrato, fosfato y sulfato. Cerca del 80 % del calcio proteico plasmático está unido a la albúmina y el restante a la globulina. Las funciones del calcio son múltiples: constituyente fundamental de la estructura ósea, es un segundo mensajero de varias hormonas, interviene en la coagulación sanguínea, en la excitabilidad neuromuscular y la transmisión nerviosa. El calcio sérico puede disminuir (hipocalcemia) por hipoparatiroidismo hereditario o adquirido, pancreatitis aguda, etc. Puede aumentar (hipercalcemia) en el hiperparatiroidismo primario, la insuficiencia renal crónica, en neoplasia maligna, etc. FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA: La técnica empleada en la determinación de calcio en sangre, es una técnica en donde el calcio reacciona con la o-cresolftalein complexona (o-CPC) en pH alcalino dado por el aminometil propanol (AMP), generando un complejo de color magenta que se mide a 570 nm. AMP (8-Hq) o-CPC + 2 Ca++ ——————> o-CPC(Ca)2 (color magenta) FINALIDAD:  Determinar la concentración sérica de calcio, empleando el método de colorimetría directa. MATERIAL Y EQUIPOS  Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.  Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.  Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.  Muestra: Suero sanguíneo.  S. Estándar: solución de calcio 10 mg/dl.  A. Reactivo A: solución de o-cresolftalein complexona y 8-hidroxiquinolina (agente quelante).  B. Reactivo B: solución de aminometil propanol (buffer)  Reactivo Único: Mezclar partes iguales de reactivo A y reactivo B PROCEDIMIENTO: 1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un paciente en ayunas. 2) Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos. 3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. 5

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4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. 5) Para la determinación de calcio: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S (estándar) y D (Desconocido), colocar: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES B S D Muestra (suero / ul) --50.0 Estándar (ul) -50.0 -Reactivo único (ml) 2.0 2.0 2.0 Agua destilada (ul) 50.0 --Mezclar suavemente e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 570 nm.

RESULTADOS: 1)

Luego de la incubación de los sistemas, se observa lo siguiente:

B

2)

D

Lecturas en el espectrofotómetro:

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO: 1) Cálculos de los resultados:  Cálculo del factor: 

Cálculo de la concentración de Calcio. Calcio (mg/dl) = (D – B) x F



Interpretación de los resultados. Valores Referenciales: Suero: 8.5 a 10.5 mg/dl.

2)  3)

Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN: 1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. 2) ¿Cuáles son las hormonas que regulan a la concentración de calcio? 3) Elabore una lista de 10 enfermedades que producen hipocalcemia e hipercalcemia. 4) Esquematice y explique el metabolismo del calcio. 5) Elabore un mapa conceptual explicando la relación entre calcio y osteoporosis. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.

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2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011 3) Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018

DETERMINACIÓN DE HIERRO SÉRICO INTRODUCCION: El hierro es un metal muy importante en el organismo porque es componente esencial del núcleo heme de la hemoglobina que se encarga del transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos. También interviene como componente de otras hemoproteínas como los citocromos y los complejo Fe-S de la cadena respiratoria y la mioglobina. El hierro de la dieta puede ser ligado al hemo o en forma inorgánica. El primero es más fácilmente absorbido y el segundo requiere estar como ión ferroso. La absorción de hierro ocurre principalmente en el duodeno como Fe 2+ y es trasferido a la transferrina para su transporte sérico llegando a los tejidos para su uso y a los lugares de depósito donde se acumula como ferritina. Uno de los lugares de depósito es en la médula ósea donde es utilizado para la síntesis de hemoglobina. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado, que se encuentra dentro de las células; el hierro en uso, que se encuentra en la hemoglobina, enzimas y varios tipos de proteínas; y el circulante. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína, dado que no sólo es relativamente insoluble, sino que además es tóxico. La deficiencia de hierro produce anemia ferropénica de tipo microcítica hipocrómica, es la causa más frecuente de anemia nutricional, en niños, mujeres y adultos mayores. Se reconocen diversos estadios de la deficiencia de hierro, donde: 0: normal I: deficiencia de los depósitos de hierro lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica. II: se añade disminución de hierro sérico, aumento de la transferrina y la capacidad total de fijación del hierro y disminución de la saturación de la transferrina y III; anemia microcítica hipocrómica; siendo el III el de la anemia ferropénica propiamente dicha. La determinación del hierro sérico es parte del estudio de la anemia y disminuye en la fase II. El 90 % de anemia en las mujeres es por deficiencia de hierro. La evaluación de la concentración de hierro sérico, por tanto, es de gran utilidad, dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos, defectos en el mecanismo de almacenaje, etc. De la misma manera, su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje, etc. FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA: El método se basa en liberar el ión férrico unido a la transferrina por acción del cloruro de guanidinio, que es un buffer ácido y es reducido a ferroso por acción de la hidroxilamina. El ión ferroso producto de esta etapa reacciona con el agente cromogénico ferrozina generando un complejo coloreado que se mide a 600 nm. FINALIDAD:  Determinar la concentración sérica de hierro, empleando el método de colorimetría directa. MATERIAL Y EQUIPOS  Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.  Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.  Equipos: centrífuga, micropipetas x 10 ul, baño maría, espectrofotómetro.  Muestra: Suero sanguíneo.  S. Estándar: solución de hierro en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl.  A. Reactivo A: buffer acetato pH 4.0, hidroxilamina clorhidrato.  B. Reactivo B (color): solución de ferrozina, clorhidrato de hidroxilamina.

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PROCEDIMIENTO: 1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de un paciente en ayunas. 2) Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos. 3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos. 4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación. 5) Para la determinación de hierro: En 2 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), y D (Desconocido), colocar: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES B D Muestra (suero / ul) -100.0 Reactivo A (ml) 0.5 0.5 Agua destilada (ul) 100.0 -Mezclar e incubar a 37 °C por 3 minutos. Leer la absorbancia del Tubo D (BD) en espectrofotómetro a 600 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada. Luego se agrega:

Reactivo B (ul)

100.0

100.0

Mezclar inmediatamente, incubar 3 minutos a 37°C y volver a leer cada tubo a los 5 minutos, llevando el aparato a cero con agua destilada.

RESULTADOS: 1) Luego de la incubación de los sistemas, se observa lo siguiente:

B

D

2) Lecturas en el espectrofotómetro: 600 nm, el promedio puede ser dos lecturas de cada uno. LECTURA PROMEDIO DEL ESTÁNDAR (S) = 0.250 LECTURA PROMEDIO DEL BLANCO (B) = 0.055 LECTURA PROMEDIO DEL DESCONOCIDO (D) =0.270 (del paciente)

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO: 1) Cálculos de los resultados: Corregir las lecturas de S y D, restándole los blancos correspondientes: S Corregido = S – B   D Corregido = D – (B + BD) Cálculo del factor:  

Cálculo de la concentración de Hierro. Hierro (ug/dl) = D corregido x F

2) Interpretación de los resultados.  Valores Referenciales:  Varones: 130 a 330 ug/dl.  Mujeres: 140 a 346 ug/dl. 3) Explique bioquímicamente lo encontrado. PREGUNTAS DE APLICACIÓN: 1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. 2) Defina que es la transferrina, ferritina y hemosiderosis. 3) ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? 4) Elabore una lista de 10 causas de deficiencia e incremento de hierro. 5) Esquematice y explique el mecanismo de absorción del hierro hémico y no hémico.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019. 2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta Edición, Editorial Omega, España, 2011 3) Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018

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