Pratica Purificacao Proteinas PDF

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ANTES DA AULA • vai precisar usar um computador ou smartphone na aula! • você tem que decidir qual versão de ProtLab você vai usar na aula (veja abaixo) • você tem que fazer o que é necessário para poder usar a versão escolhida na aula (talvez tenha que baixar os arquivos, talvez tenha que fazer um e-mail da UFPR) NÃO VENHA PARA A AULA SEM ESTA PREPARAÇÃO!!! A IDEIA É DE CHEGAR À AULA E JÁ COMEÇAR A USAR O PROGRAMA!!! TAMBÉM, LEIA O ROTEIRO EM SI ANTES DA AULA!!! Se você tem um computador de 32 bits (o roteiro neste documento é para esta versão) Mande um e-mail para mim ([email protected]) pedindo “Protlab de 32 bits”. Vou mandar 4 arquivos (em anexo à mensagem). Baixe todos os arquivos para a mesma pasta: • Protlab.hlp • PROTLAB.GID • Protlab.ex (depois de baixar, mude o nome para Protlab.exe) • Default.pt1 Depois de mudar o nome “Protlab.ex” para “Protlab.exe”, clique no arquivo para ter certeza que o programa rode!!! Se você tem um computador de 64 bits (algumas coisas são ligeiramente diferentes daquela que é falada no roteiro) Vai ser necessário conectar ao WiFi da UFPR para usar o programa on-line. Para usar o WiFi da UFPR, você precisa ter uma conta de e-mail da UFPR. Para obter uma conta: • http://www.portaldoaluno.ufpr.br/aluno • clique na opção “Solicitação de e-mail ufpr” No dia da aula, você vai fazer o login no WiFi da UFPR e acessar o programa on-line no seguinte endereço • http://www.agbooth.com/pp_ajax/ Também tem um aplicativo para smartphones..... • Na página http://www.agbooth.com/pp_ajax/, debaixo da área do programa em si, é escrito “Free versions of Protein Purification are available for the iPhone and Android phones” (onde você pode clicar ou no “iPhone” ou no “Android phones” para continuar....) ANTES DA AULA – CHEQUE – O PROGRAMA/APLICATIVO RODA???

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Objetivos: • Entender os conceitos de fator de purificação e % de recuperação • Ter uma introdução e visão geral do tópico de purificação de proteínas (vocês vão ter uma disciplina inteira neste assunto no quarto ano) • Entender o princípio de cada técnica de purificação e saber aplicar cada técnica de maneira correta • Ser capaz de planejar, executar (no momento, “in sílico”) e otimizar um esquema de purificação de proteínas TAREFA Tem duas tarefas a ser feitas, descritas nas páginas que seguem: A. Familiarização com o programa e estudos para caracterizar a eficiência dos vários métodos B. Desenvolvimento de um processo de purificação Trabalhe em duplas. A proteína com qual você tem que trabalhar será informada na aula. Como usar o programa (roteiro para o programa instalado no computador – o aplicativo do smartphone funciona de maneira semelhante) Clique em cima de ProtLab.exe (pode ser necessário mudar a extensão “.ex” para “.exe”) • Selecione “Begin”. Do menu, selecione “Start from beginning”. Selecione “Sim” • Selecione o arquivo “default.pt1” • Selecione uma proteína para purificar (cada dupla vai selecionar uma proteína diferente) Qualquer hora que você precise de mais informação sobre uma das etapas de purificação, clique em “help” e depois selecione “index” do menu. Depois clique no tópico de interesse. A. Familiarização com o programa e estudos para caracterizar a eficiência dos vários métodos Explore cada método de purificação disponível no programa (e cada tipo de coluna etc. dentro de cada método), sempre voltando para usar a mistura original. (Na parte B você vai planejar uma sequência de etapas sucessivas – baseado nas observações que você faz sobre a eficiência dos vários métodos nesta primeira etapa) Estudos de precipitação com sulfato de amônia Selecione “Separation”. Do menu selecione “ammonium sulphate fractionation”. Faça estudos de precipitação com sulfato de amônia • adicione sulfato de amônia até 10% de saturação, depois 20%, depois 30% etc até 100%, sempre voltando para a mistura inicial antes de cada nova teste. Tem um truque para fazer isto mais rapidamente no programa – quando você der a %saturação e clique em OK, aparecerá uma janelinha com %atividade e %proteína precipitada – simplesmente anote estes valores e clique em "cancel" – neste caso, quando você especificar uma nova %saturação, será aplicada à mistura original. Note-se que neste estudo preliminar a idéia é adicionar diferentes %saturação para a mistura original! Se você clicar em OK, qualquer etapa posterior será aplicada especificamente ao produto (sobrenadante ou precipitado) que você selecionou. Isto você vai fazer somente quando é hora de usar a precipitação com sulfato de amônia como uma das etapas de um esquema "multi-etapa" de purificação. • faça um gráfico da porcentagem da enzima precipitada (eixo-Y1) e porcentagem da proteína precipitada (eixo-Y2) como função da porcentagem de saturação do sulfato de amônia (eixo-X). Estudos de cromatografia de filtração em gel (sempre partindo da mistura original) Para entender alguma coisa sobre como cromatografia em coluna funciona, consulte a explicação na apostila de “Assunto 02 (aminoacidos e peptideos)” das aulas teóricas. Para começar com a mistura original,

selecione “Quit”, e, do menu que aparece, selecione “Abandon scheme and start again”. Selecione “Separation”. Do menu, selecione “gel filtration”. • Selecione um dos géis. • Quando o gráfico de A280 como função de “fraction number” aparecer, selecione “fractions” e depois “assay enzyme activity”. Faça anotações concisas sobre o sucesso da separação • Note que é possível examinar frações individuais por eletroforese. Para fazer isto, seleciona “electrophoresis” imediatamente depois da cromatografia. Clique nas frações a serem examinadas. • Selecione “fractions” e depois “pool fractions”. Vai abrir uma caixa de texto com instruções. Tem que indicar as primeiras e as últimas frações no intervalo a ser juntadas (por enquanto, tente recuperar o máximo da enzima possível) • Selecione “electrophoresis” e “1D PAGE” ou “2D PAGE” (repare que estão feitos com SDS!). Vai ser mostrado um gel de eletroforese, colorida com “Coomassie Blue” (que é geral para proteínas). Tente o “immunoblot” para identificar qual das proteínas é a sua (mas pode ser que não tenha um anticorpo para sua proteína!). Selecione “Finished” e, do menu, “Done with gel”. Selecione “Quit”. • Do menu "Quit" selecione “Abandon this step and continue” (se você não fez eletroforese) ou “Abandon scheme and start again” (se você fez eletroforese). Selecione “Separation”. Do menu selecione “gel filtration”. Selecione um outro gel e repete a caracterização. • Volte para a mistura original e repete esta sequência para outros géis. Estudos de cromatografia de troca iônica (sempre partindo da mistura original) Selecione “Quit”. Do menu selecione “Abandon scheme and start again”. Selecione “Separation”. Selecione “ion exchange” do menu. Explore este tipo de cromatografia sozinho (agora que você tem familiaridade com o programa). Vai ter que pensar sobre o efeito do pH na carga da proteína! Vai ter que ler as informações sobre as propriedades de cada resina (selecione “Help” e do menu “index”, depois selecione “ion exchange chromatography”) Estudos das outras etapas de purificação (sempre partindo da mistura original) Antes de cada nova etapa, selecione “Quit”. Do menu selecione “Abandon scheme and start again”. Explore cada etapa, em detalhe, procurando entender as propriedades da proteína e as características do método. Se você precisa de informação sobre o método, consulta “Help”, “index” e clique no nome do método. Por enquanto não se preocupa em desenvolver um esquema de purificação. B. Desenvolvimento de um processo de purificação Com base nas informações conseguidas na exploração de sua enzima frente aos vários métodos de purificação, planeja um esquema de purificação, com objetivo de maximizar a atividade específica, mas sempre tentando manter o custo tão baixo quanto possível (e portanto, minimizar o número de etapas). Se você clicar em “help” e depois selecione “progress report” do menu, vai ver os dados (são dados cumulativos, quer dizer, “depois da última etapa realizada” comparada com “a mistura do início”). Note-se: Esta vez, você não vai selecionar “Abandon scheme and start again” – para cada esquema de purificação, você vai fazer várias etapas seqüenciais – a preparação obtida em uma etapa será utilizada na próxima etapa. Você somente vai “Abandon scheme and start again” quando você quer começar um novo esquema. Tente mais do que um esquema e faça comparações. Se for apropriado, planeje novos esquemas e teste-los. IMPORTANTE Cada dupla deve mandar um resumo dos resultados, por e-mail, para “[email protected]”. Na mensagem, informe claramente o número de sua enzima. Anexe os seguintes arquivos (screenshots): • a tabela de purificação (ou seja, a tabela com as colunas “Method...Protein...Enzyme...Yield...Enrichment...Cost”) • As versões finais tanto do “2D SDS-PAGE – Coomassie blue” quanto do “2D SDS-PAGE – Immunoblot” – ou seja, depois de todas as etapas de purificação...