SAV1 - Cours 4 ( Denys) PDF

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Summary

cours magistral...

Description

Le promoteur T7 : 3 niveaux de régulation

Le promoteur T7 : induction par l'IPTG

Le promoteur araPBAD issu de l'opéron arabinose -

Issu de l’opéron ara La protéine AraC joue à la fois un rôle positif et négatif selon la présence en arabinose

-

AraC possède 3 sites de fixation à l’ADN : - En dimère sur les sites opérateurs araI1 et araO2 - En monomère sur araI1 et araI2

-

Contrôle positif par CAP-AMPc en absence de glucose qui stimule la transcription

Le promoteur araPBAD dans un vecteur d'expression

- Promoteur araBAD pour une régulation dépendante de la concentration en arabinose - Le gène codant pour AraC, nécessaire au contrôle du promoteur - Un site RBS optimisé pour augmenter l’efficacité de la traduction - Des sites de terminaison de la transcription pour des transcrits efficaces

Les autres promoteurs Exemple : promoteur PR et PL du phage λ et son répresseur λcI

Système λPL/PR-cI857 sensible à la T° qui peut exprimer le gène cible inséré dans le MCS à 42°C.

rrnB :site terminateur de la transcription du gène codant pour l'ARNr 16S bactérien

Les marqueurs de sélection

- Via résistance à des antibiotiques

Ampicilline Inhibe la biosynthèse de la paroi

Gène bla présent dans certains plasmides code pour la β-lactamase = gène de résistance à l'ampicilline.

Les marqueurs de sélection

Kanamycin A interagit avec la sous-unité 30S du ribosome bactérien

Inhibition par l’enzyme chloramphenicol acetyltransférase

Inhibition par efflux actif de l’antibiotique

Inhibition par l’enzyme aminoglycoside phosphotransférase

Les marqueurs de sélection Système de sélection sans antibiotique = Système d’addiction par le plasmide

Les marqueurs de sélection Système de sélection sans antibiotique = Système d’addiction par le plasmide Exemple basé sur le couple toxine / antitoxine

Un gène pour une toxine est inseré dans le génome bactérien, Un gène de l’anti-toxine est présent sur le plasmide, ce système permet la selection et la maintenance du plasmide en absence d’antibiotique Exemple avec le gène ccdB (toxine) et ccdA (anti-toxine) Control cell death B inhibé naturellement par ccdA ccdB inhibe l'ADN gyrase, alors l'ADN casse et la bactérie meurt. Mais en présence de ccdA, la toxine est inhibée et la bactérie survie.

Expression des protéines recombinantes dans E. coli

Différentes souches d’E. coli pour la production de protéines

D'autres bactéries … Bacillus : - Adaptées à des grandes cultures avec des grands volumes - Souvent dépourvues de protéases membranaires - Plus enclins à la sécrétion par rapport à E. coli - Large variétés de vecteurs d'expression avec des promoteurs forts

-

Mais plus difficiles à faire pousser avec moins de risque de formation de corps d'inclusion

Caulobacter crescentus gram (-) : - Système d'expression disponible commercialement - Les protéines ou peptides hétérologues sont fusionnés à RsaA, une protéines abondante impliquée dans la couche de surface paracrystalline de la bactérie - Cette protéine est exprimée à la surface de la bactérie ou sécrétée -

Limitation : taille de la protéine étrangère (problème quand > 150 AA)

Streptomyces Lividans (gram (+) : - Excellente capacité de sécrétion - Jusqu'à plus de 200 protéines produites et approuvées en biopharmacie - Selon les conditions de fermentation, des quantités significatives des protéines recombinantes peuvent être retrouvées dans le surnageant de culture. - Exemple de production du TNF trimérique à grande échelle.

Problèmes rencontrés lors de la production de protéine recombinante chez E. coli Problème Peu ou pas d’expression

Explication possible Expression basale trop élevée

Solutions Auto-contrôle : - Ajouter du glucose quand le vecteur d’expression est sous contrôle du Plac - Utiliser un milieu avec du Glc comme source de carbone - Utiliser pLysS/pLysE pour des souches basées sur le système T7 - Utiliser des promoteurs à régulation étroite Prendre des plasmides à nombre de copies faible

Toxicité après induction

Contrôler le taux d’induction : - Promoteur réglable en fonction de la concentration en inducteur (tunable promoter) - Utiliser des souches permettant le contrôle de l’induction comme la souche TUNER(DE3) Prendre des plasmides à nombre de copies faible Choisir des souches adaptées à l’expression de protéines toxiques ( C41 ou C43) Diriger la sécrétion de la protéine dans le périplasme

Biais des codons

-

Optimiser la fréquence des codons dans la séquence de l’ADNc à exprimer Utiliser des souches modifiées pour des gènes d’ARNt rares

Biais des codons

Recherche des codons rares présents dans l’ADNc à exprimer - molbiol.ru/eng/scripts/01_11.html - genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis - nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ - …

Biais des codons

Dsb : Disulfide Bond formation protein DsbA et DsbC

Problèmes rencontrés lors de la production de protéine recombinante chez E. coli Formation de corps d’inclusion

Problème Formation de corps d’inclusion

Explication possible

Solutions

Formation incorrecte de ponts disulfures

-

Diriger la protéine vers le périplasme Utiliser des souches E. coli avec un environnement cytoplasmique oxydatif

Repliement protéique incorrect

-

Co-exprimer avec des chaperones Ajouter des osmolytes, des co-facteurs dans le milieu Stopper la production en retirant l’inducteur Ralentir le taux de production en incubant à basse température

Problèmes rencontrés lors de la production de protéine recombinante chez E. coli Formation de corps d’inclusion

Mise en conformation in vitro -

-

Purification des corps d’inclusion par centrifugation Solubilisation par dénaturation chimique : - Urée 8M - Guanidine 6M - Avec ou sans agents réducteurs Renaturation lente par dialyse

www.ncbi.nlm.nih.gov

Exercice de clonage de la HS3ST3B dans le vecteur pET15b

Homo sapiens heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 3B1 (HS3ST3B1), transcript variant 1, mRNA NCBI Reference Sequence: NM_006041.3 FASTA Graphics Go to: LOCUS NM_006041 5369 bp mRNA linear PRI 12-DEC-2020 DEFINITION Homo sapiens heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 3B1 (HS3ST3B1), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM_006041 VERSION NM_006041.3 KEYWORDS RefSeq; MANE Select. SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens . . . source

gene

exon

1..5369 /organism="Homo sapiens" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="17" /map="17p12" 1..5369 /gene="HS3ST3B1" /gene_synonym="3-OST-3B; 3OST3B1; h3-OST-3B" /note="heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 3B1" /db_xref="GeneID:9953" /db_xref="HGNC:HGNC:5198" /db_xref="MIM:604058" 1..992 /gene="HS3ST3B1" /gene_synonym="3-OST-3B; 3OST3B1; h3-OST-3B"

CDS

439..1611 /gene="HS3ST3B1" /gene_synonym="3-OST-3B; 3OST3B1; h3-OST-3B" /EC_number="2.8.2.30" /codon_start=1 /protein_id="NP_006032.1" /db_xref="CCDS:CCDS11167.1" /db_xref="GeneID:9953" /translation="MGQRLSGGRSCLDVPGRLLPQPPPPPPPVRRKLALLFAMLCVWL YMFLYSCAGSCAAAPGLLLLGSGSRAAHDPPALATAPDGTPPRLPFRAPPATPLASGK EMAEGAASPEEQSPEVPDSPSPISSFFSGSGSKQLPQAIIIGVKKGGTRALLEFLRVH PDVRAVGAEPHFFDRSYDKGLAWYRDLMPRTLDGQITMEKTPSYFVTREAPARISA MSKDTKLIVVVRDPVTRAISDYTQTLSKRPDIPTFESLTFKNRTAGLIDTSWSAIQIGIY AKHLEHWLRHFPIRQMLFVSGERLISDPAGELGRVQDFLGLKRIITDKHFYFNKTKGF PCLKKAEGSSRPHCLGKTKGRTHPEIDREVVRRLREFYRPFNLKFYQMTGHDFGWD"

exon 993..5369 regulatory 5350..5355 /regulatory_class="polyA_signal_sequence" /note="hexamer: AATAAA" polyA_site 5369 /note="major polyA site"

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701

gcagttcgcc ggactgcaag cgagagtgca cccagcagtt tcaagagccg gcggccgcgg accctctctg cgcgcccgcg cccggccggc ctgctcttcg tgcgccgccg ccagccctgg gccaccccac agtcccgagg aagcagctgc gagtttctgc cgcagctacg cagatcacca tcggccatgt atctcggact acgttcaaaa atctacgcca gtgagcggcg ctgggcctca ccctgcctga aggacccatc ttcaacctca ggctatgtac acagaaatct cctagccaca tctagtattt ctgttatatt ccttcagtca ttccagcttc agggctgtat tccaatgatg atggggaaat tttttttttt gatatatgct caagtatctg agacggggtt ctgccttggc tccttctaga cctgtgtcct gttgccccgt gatgatctcc

tctgcagcct gaggcagccc acgtcctcct accgccgtcc ccgccgctac gcacacgggg cgctcactgc ggcagcgcat tcctaccgca ccatgctctg cgccggggct ccacagctcc tggcttcagg tgccggactc cgcaggccat gcgtgcaccc acaagggcct tggagaagac ccaaggacac acacgcagac acaggacagc agcacctgga agcggctcat agaggatcat agaaggcgga ctgagatcga agttctacca cttacccacg attttataat ctctttagag cgttctcttc taaaacaaag ccgtctgagt cctgtctctt tctgaagggc tagcctgaaa ttctcactcc ttttgagatg taccacaacc ggattacagg tcttcatgtt ctccaaagtg gtcagaatgg cctctgcccc ctttcccagg tttaatttgc

ctgcggggaa cggcgtgcgg ggccccgagc cgactttccg agctgccgcc gcaataaacc ccggcgggac ggggcagcgc gccgccgccg cgtctggctc gctgctcctg ggacgggacg caaggagatg cccaagcccc catcatcggc cgacgtgcgc cgcttggtac gcccagttac caagctcatc gctgtccaag gggcctcatc gcactggctg cagcgacccg cacggacaag gggcagcagc ccgcgaggtg gatgaccggg tggcttatct aatttatttt agttagcttc ttcacaattg aaaagcacaa tctccagttg cctgcctgtg aggcctcatg gccacagccc ctttacaggg gagtcttgct tctggctccc catgcaccac ggtcaggctg ttgggattat tagggtctgt attccctggt tcacatgtgt atgaaactac

gtgccggggc cggtgcgcac gcgtcgtcgc ttccagttgc gccacctggg gagccacccg ccacgccatg ctgagtggcg cccccgccgc tatatgttcc ggctctgggt ccccccaggc gccgagggcg atctccagct gtgaagaagg gccgtgggcg cgggacctga ttcgtcacgc gtggtggtgc cggcccgaca gacacgtcgt cgccacttcc gccggggagc cacttctact cggccccatt gtgcgcaggc cacgactttg attgacagag taattcataa ataatctgtt atggtgcttc cttgagattt ctgcctcctt tacctcgtag cagcagcctc tagggttctg acatccacat cttgttgccc ggttcaagcg catgcctggc gtatcaaact aggcgtgagc tgacttcagc tcattaacca gagatgcctg accatgctgc

tgctcgaggc agtctagagt gccccgggag agctcctgcc gaagagcagc ggcgtccagc tgctgagcca gcagatcttg cggtgaggag tgtactcgtg cccgcgccgc tgccgttccg ctgcgagccc ttttcagtgg gcggcacgcg ccgagcccca tgcccagaac gggaggcccc gggacccggt tccccacctt ggagcgccat ccatccgcca tgggccgcgt tcaacaagac gcctgggcaa tgcgcgagtt gctgggattg attatatgta gcaattaatt aacattccaa tattttttct ttgttgttac gtcttgtctt gaacgctgag cttgcagatg tccctccctc cctttttttt aggctggggc attctcctgt taattttgta cccgacctca cactgcgccc ttttgatttt gtttgaagtg ggtgctgctt gttccccagg

tcagttctta ggccagggcg cagaccctcg gggcaacatg agcagcagcg gtgccgggga tgtccctggc cctcgatgtc gaagctcgcg cgccggctcc acacgacccg ggcgccgcca ggaggagcag gtctgggagc ggcgctgctg tttcttcgat cctggacggg tgcgcgcatc gaccagggcc cgagagcttg ccagatcggc gatgctcttc gcaagacttc caagggcttc gaccaagggc ctaccggcct agcagacccg tgtaaaatgt cactaagctg agtgtttaac tctcccctac gggtattcag gggtctccca ctgcctcaac tggtgtcccg cattcagcac tctttttttt gtaatggtgt ctcagcctcc tttttagtag ggtgatccgc gctatccaca gcaggatggc tatgtagatt cagaaatcaa cagacagttc

2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3001 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341

tgctttgaca ctgggtgtcg ctgctaggta agacaaaggc gatgcgtctt ggtagccagt gctgggccca tagccaggtc gtgcctctct tagccatata gtttaattta cagttatact tgggatagtt ggaacattgt ctggtcttta atctagctag gctcatgggg tcgtagcttt aatcatagcg ctaattggtt ttacagcata ctgtctactt agttcagaga ttcaggtccc cttaaaactg agtgggtcaa tactgatgga ctcctcataa catctgccgg aacataagac ttagctgcca ggacttcctc ctcagttttg ggtttttctt aacttagtag aattggatga tgtgtgacag ttgtaaaaaa gacacagaag tgtggttaga agtaatctaa tagccaatat tttacacaga gtatgaacaa

START 439 STOP 1611

caccaaagaa agactcagag cagagccagc ctcaaaatga tggaattcct ggccaaacag tattgcctgt ttgacagaag gttgatttat gtaatacagg acctcagttt tccatcaagg acaaaggaca atgaaaagat agtgatgtct cttacactta gatctgtgta tttactgtct tggttctgcc gtgtattttt acatggcttg tctgatcatt agagtatgca cgccctcttt aaacaggaaa aattctattc atagagcaag gggtctgcaa agcttgcacc ttagatttct gaagacaaac cgatttacac tttcttttct gtttctatct gtggtacctg tggaggagga atatatttta ggaaaatgga ctaatgtgac tgttttctca aatactgtgc gtacaaaaaa gaaagatgtt ataaaatata

tcccgtaggc gggtcagctg cagtgttggg caggcagcct agctcatctc caagaactaa aaacccttga ggttaccagc aacagttggg ggcagttggt tttaaaccag aatatgtggg cttttgtatg gaaaagatac tgaaaatcca gcagccaaac tttcttaggt ccagaaagta ttcttgatga tcatttattt aagtaaaagg ctgatggtct acaaagccat ccaagctgga ttttctggta tgggtcaaat tttttctatg gggtctgatg ccatcatcgg tcctgttcta ccccttttct gaaaagctct catgtaaaaa agttcatgct gaaaggtatt gaaattgttt gacatttgga agattccaat ttttcagctt cttttgtgac aaattctagc ttaaatcaag tctaggcaag ttttgccaa

tagcagagcc tgtccctcgg cagcaggctc gacagaggaa agaattatat gagtggccct gcctgatgct actgtcactg taaccagata taaacatata aatgcttcta aagatataca ttgtatggga ttcattttta gtatgtattt catcattgtg ttctccctgt gtgtgggacc gtgattgtga gaaatcaaac cagtatccaa gatgtggctg aggaaaacac caatttttta gaaggagggt ccttgaattc taagacaaat gtttaaagtt acggtcatct gcaatctgca gtttcggcaa gatattcatt caaacaaaaa ttctttgcgg ttaagtatag tcttcccagg gaaacagttt aaactagaaa atcaagagga attaatttat agtatgtctt tattttgtcc tgaaattctg

accagcacaa catcagcgtc acagcctcaa ggagtctgac cttagagtga tgcaaaaaaa catacagctg ctctacagaa gcaatatagt gcaatatcac ccataaaaga tattgtcaaa tcacttgcct gaaactgatc gcccaaaagt taggttctgt tctccaatgt tgcacttagg aaaacacctg tgagaacacc gtccttcacc ttgatgtgga acaggagctt ttaagttgtt catttagtca aaacagatgt aaatcaaaca cctaacagat tcctgctgca agaccaccag tttgtcctgg ggagtacttt ggtcaacaaa tgtttgaaca tgactgttta attctctttg cagatcctgc cagtacgtat tggccaataa cactgagtct cgataacttg tatgtataac gtaattcata

accaagggcg taccaaggtg tagggagaaa acctcagctt taatatgggt ggttgggaaa tcccttgttt tgctctcccc ggcaattgag ataatgatat attgtgattt atggttggga gatagtataa agagatgtca tttagcctac tttggaggaa tttatccatt ggaataccag cataagggtg tcttttcggt tggtcttgcc actgcagaag ttccctcccc tattccctgc cgaacactga ccataatcag tcatgtgcat ctggttgcag gaagttaggt gcttaacttt cacgtgtttt attttttttc aaaaaattga gtagtctgtt ataaatactt ggggtcattt caggatattt ctaagatgct aacttaaagg cattcaacca gatgttagga acaaattaat ctatttcttt

NP_006032.1 source

Protein

Site

Region

Region

Region

Site

Region

Site

1..390 /organism="Homo sapiens" /db_xref="taxon:9606" /chromosome="17" /map="17p12" 1..390 /product="heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 3B1" /EC_number="2.8.2.30" /note="heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 3B1; heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 3B1; heparan sulfate D-glucosaminyl 3-O-sulfotransferase 3B1" /calculated_mol_wt=43193 33..53 /site_type="transmembrane region" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)" 137..374 /region_name="Sulfotransfer_1" /note="Sulfotransferase domain; pfam00685" /db_xref="CDD:307022" 169..175 /region_name="Substrate binding. /evidence=ECO:0000250" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)" 200..203 /region_name="Substrate binding. /evidence=ECO:0000250" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)" 258 /site_type="glycosylation" /note="N-linked (GlcNAc...) asparagine. /evidence=ECO:0000255; propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)" 268..269 /region_name="Substrate binding. /evidence=ECO:0000250" /note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)" 329 /site_type="glycosylation" /note="N-linked (GlcNAc...) asparagine. /evidence=ECO:0000255; propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q9Y662.1)"

CDS

1..390 /gene="HS3ST3B1" /gene_synonym="3-OST-3B; 3OST3B1; h3-OST-3B" /coded_by="NM_006041.3:439..1611" /db_xref="CCDS:CCDS11167.1" /db_xref="GeneID:9953" /db_xref="HGNC:HGNC:5198" /db_xref="MIM:604058"

ORIGIN 1 mgqrlsggrs cldvpgrllp qpppppppvr rklallfaml cvwlymflys cagscaaapg 61 llllgsgsra ahdppalata pdgtpprlpf rappatplas gkemaegaas peeqspevpd 121 spspissffs gsgskqlpqa iiigvkkggt ralleflrvh pdvravgaep hffdrsydkg 181 lawyrdlmpr tldgqitmek tpsyfvtrea parisamskd tklivvvrdp vtraisdytq 241 tlskrpdipt fesltfknrt aglidtswsa iqigiyakhl ehwlrhfpir qmlfvsgerl 301 isdpagelgr vqdflglkri itdkhfyfnk tkgfpclkka egssrphclg ktkgrthpei 361 drevvrrlre fyrpfnlkfy qmtghdfgwd

Nt cyto

TM 1 – 32 33 – 65 54 – 390

dom. enzymatique

Ct

Cytoplasmic Sequence Helical; Signal-anchor for type II membrane protein Sequence Lumenal Sequence = domaine enzymatique

Produire chez E. coli la forme soluble sans domaine transmembranaire à partir de l'AA Ser66

Produire chez E. coli la forme soluble sans domaine transmembranaire à partir de l'AA Ser66, soit le codon 195 439 at ggggcagcgc ctgagtggcg gcagatcttg cctcgatgtc 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561

cccggccggc ctgctcttcg tgcgccgccg ccagccctgg gccaccccac agtcccgagg aagcagctgc gagtttctgc cgcagctacg cagatcacca tcggccatgt atctcggact acgttcaaaa atctacgcca gtgagcggcg ctgggcctca ccctgcctga aggacccatc ttcaacctca

tcctaccgca ccatgctctg cgccggggct ccacagctcc tggcttcagg tgccggactc cgcaggccat gcgtgcaccc acaagggcct tggagaagac ccaaggacac acacgcagac acaggacagc agcacctgga agcggctcat agaggatcat agaaggcgga ctgagatcga agttctacca

gccgccgccg cgtctggctc gctgctcctg ggacgggacg caaggagatg cccaagcccc catcatcggc cgacgtgcgc cgcttggtac gcccagttac caagctcatc gctgtccaag gggcctcatc gcactggctg cagcgacccg cacggacaag gggcagcagc ccgcgaggtg gatgaccggg

cccccgccgc tatatgttcc ggctctgggt ccccccaggc gccgagggcg atctccagct gtgaagaagg gccgtgggcg cgggacctga ttcgtcacgc gtggtggtgc cggcccgaca gacacgtcgt cgccacttcc gccggggagc cacttctact cggccccatt gtgcgcaggc cacgactttg

cggtgaggag tgtactcgtg cccgcgccgc tgccgttccg ctgcgagccc ttttcagtgg gcggcacgcg ccgagcccca tgcccagaac gggaggcccc gggacccggt tccccacctt ggagcgccat ccatccgcca tgggccgcgt tcaacaagac gcctgggcaa tgcgcgagtt gctgggattg

gaagctcgcg cgccggctcc acacgacccg ggcgccgcca ggaggagcag gtctgggagc ggcgctgctg tttcttcgat cctggacggg tgcgcgcatc gaccagggcc cgagagcttg ccagatcggc gatgctcttc gcaagacttc caagggcttc gaccaagggc ctaccggcct a 1611

Vérification du cadre de lecture à partir du codon 334tct336 Via transeq sur le site : www.ebi.ac.uk › Tools › EMBOSS Transeq < Sequence Translation Sites >EMBOSS_001_1 SGSRAAHDPPALATAPDGTPPRLPFRAPPATPLASGKEMAEGAASPEEQSPE VPDSPSPISSFFSGSGSKQLPQAIIIGVKKGGTRALLEFLRVHPDVRAVGAEPH FFDRSYDKGLAWYRDLMPRTLDGQITMEKTPSYFVTREAPARISAMSKDTKLIV VVRDPVTRAISDYTQTLSKRPDIPTFESLTFKNRTAGLIDTSWSAIQIGIYAKHLE HWLRHFPIRQMLFVSGERLISDPAGELGRVQDFLGLKRIITDKHFYFNKTKGFP CLKKAEGSSRPHCLGKTKGRTHPEIDREVV RRLREFYRPFNLKFYQMTGHDFGWD*

Recherche des sites de clonage pour insérer dans le pET15b le produit de PCR correspondant à la séquence codant la HS3ST3B soluble

Sites du mcs = NdeI, XhoI et BamHI

Recherche des sites de clonage pour insérer dans le pET15b le produit de PCR correspondant à la séquence codant la HS3ST3B soluble

Sur NEB Cutter de New England BioLabs

Recherche des sites de clonage pour insérer dans le pET15b le produit de PCR correspondant à la séquence codant la HS3ST3B soluble

Zéro coupures dans l'ADNc

Les 3 enzymes pour cloner dans le pET15b ne coupent pas l'insert …

Est-ce que ces enzymes travaillent dans les mêmes conditions ?

Possibilité d'utiliser - NdeI / XhoI MAIS XhoI a un site chevauchant avec NdeI et BamHI !!! - NdeI / BamHI DONC obligation de faire via NdeI / BamHI - XhoI / BamHI  Pourquoi faire l'insertion de l'ADNc avec 2 enzymes de restriction et non 1 seule ? - Si coupure par une seule enzyme : Possibilité que le plasmide se referme sur lui-même et donc ne pas oublier de traiter à la phosphatase alkaline qui déphosp...