Seconda lezione citogenetica PDF

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Lezione Citogenetica magistrale bcm ...

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Org. genoma eucariotico DA FIBRA CROMATINICA A CROMOSOMA METAFASICO Analisi biochimiche: istoni purificati + DNA (ripetizioni in tandem) -> a bassa forza ionica si otteneva la fibra a 10 nm (collana di perle) -> a forza ionica crescente-> popolazione di fibre più eterogenea con fibre sia a 10 che a 30 nm -> ulteriore aumento della forza ionica-> interazioni tra le fibre, ottenendo altre fibre con spessore maggiore di 30 nm Il ruolo di controllo della formazione della fibra è svolto dal DNA linker(DNA tra nucelosomi). Ha lunghezza variabile tra specie, tessuti e singoli nuclei [20 bp a 75 bp (controllo espressione gneica)]. Nonostante ciò, si ottengono avvolgimenti regolari del nucleosoma.

Tra gli istoni, l’H1 è l’unico ad avere una preferenzialità di legame(sequenze AGGA). Quindi, sia il DNA linker che l’istone H1 regolano l’avvolgimento della fibra cromatinica. Le code istoniche, da parte loro, guidano il compattamento della fibra creando delle interazioni tra nucleosomi adiacenti; principalmente, le code dell’istone H4 crano legami con le code del dimero H2A-H2B del nucleosoma seguente. L’evidenza dell’importanza delle code istoniche è stata provata mediante esperimenti di DELEZIONE DELLE CODE ISTONICHE: -la coda N-terminale dell’istone H4 risulta essere altamente basica sui residui dal 14 al 19, i quali creano interazioni specifiche con la regione acida della superficie del dimero H2A-H2B del nucleosoma adiacente. Come la delezione di queste sequenze anche l’acetilazione della regione dal residuo 4 al 23 (K16-Lys) dell’istone H4 impedisce il legame tra nucleosomi adiacenti[non c’è, appunto, interazione tra la regione basica dell’H4 e la superficie acida del dimero H2A-H2B]. Inoltre, varianti dell’estone H2A (come l’H2AZ) hanno delle modifiche (presentano la regione acida è più estesa) che regolano le interazioni tra nucelosomi adiacenti e, conseguentemente, la conformazione della fibra. *inizio riferimento alla slide della lezione precedente: Rilassamento del legame tra la regione acida del dimero H2A(Z)H2B e i residui basici dell’istone H4.

fine riferimento alla slide della lezione precedente*

[lato destro dell’immagine, dopo il -90°]. Dettaglio dell’interazione tra la coda dell’istone H4 (in verde) con l’Arg 23 (in blu) che prende contatto con la regione acida del dimmelo H2A-H2B-> ruolo nella formazione della fibra a 30 nm.

L’istone H1 serra la cromatina in stato condensato avvicinando sempre più i nucleosomi per formare strutture di ordine di compatimento superiore. Esso (H1) è caratterizzato da una struttura a 3 domini: -dominio centrale(regione polare organizzata i alfa eliche): interagisce e lega il DNA che entra ed esce dal nucleosoma (similarità con i fattori di trascrizione) -coda C-terminale(con residui di Lys, Pro, Ser e Ala): lega il DNA linker e facilita la condensazione -coda N-terminale La variabilità dell’istone H1 consente di ottenere diverse varianti di questo che si differenziano per: -lunghezza e carica dell’estremità C-terminale -assenza del dominio centrale (variante Tetrahymena) -presenza di due domini centrali (variante Cerevisiae) Esistono 3 classi di geni: 1-codifica per le varianti di sviluppo (con seq. Introniche) 2-codifica per le varianti somatiche (assenza di seq. Introniche) 3-codifica per le varianti di differenziamento LEGAME ISTONE H1 CON IL NUCLEOSOMA

*Pallino nero: istone *disco piatto:ottamero istonico *nastro: DNA

Le interazioni tra H1 e H1 determinano l’avvicinamento dei nucleosomi, andando a compattare la fibra cromatinica, fino all’ottenimento della struttura di ordine superiore. a)H1 umano lega in maniera asimmetrica (il legame è spostato verso un lato della particella del core nucleosomale) il DNA quando entra ed esce, prendendo contatti con gli istoni del core. b)H5 (analogo di H1 in pesci, anfibi e rettili) lega il core del nucleosoma in maniera simmetrica; questo legame stabilizza la struttura del nucleosoma e determina la traiettoria di entrata ed uscita del DNA (è posizionato dove il DNA entra ed esce dal nucleosoma) e dirige il posizionamento(quindi i patterns di avvicinamento)di nucleosomi adiacenti. [lato sinistro dell’immagine] Interazione tra istoni H1 di nucleoni adiacenti -> interagiscono serrando la fibra cromatinica per la formazione della struttura di compattamento di ordine gerarchico superiore: il SOLENOIDE.

SOLENOIDE-fibra 30 nm Nucleosomi compressi ed avvolti tra loro (6-8 nucleosomi per giro). Visivamente il solenoide si presenta come un cilindro cavo con un foro di 10 nm e due pareti di 10 nm ognuna date dall’avvolgimento della collana di perle. Nel foro si posiziona l’estone H1 che stabilizza la struttura.

Da fibra a 10 nm a fibra a 30 nm(dx) Posizionamento istone H1. Contiamo 6 nucleosomi per giro.

Fibra 10 nm

Fibra 30 nm

Confronto tra fibra 30 nm(sx) e fibra 10 nm(dx).

Il ripiegamento della fibra cromatinica non è del tutto chiaro. Si sa che c’è un orientamento dei cromosomi parallelo all’asse della fibra(vedi immagine 1 del paragrafato del solenoide); tuttavia non è chiaro quali siano le connessioni tra nucleosomi adiaenti né come si allinei il DNA linker all’interno della fibra. Esistono due modelli che descrivono il ripiegamento della fibra: -solenoide o ONE-START HELIX: fibra avvolta a formare spire con andamento destrorso di modo che due nucleosomi adiacenti si ritroveranno uno di seguito all’altro nel solenoide;

il DNA linker viene accomodato nella fibra, probabilmente ripiegandosi, senza mai attraversarne l’asse. -modello a zig-zag o TWO-START HELIX: i nucleosomi adiacenti sono orientati a zig-zag (uno da un lato uno dall’altro della fibra); il DNA linker viene tirato e attraversa sempre l’asse della fibra. a)SOLENOIDE / ONE-START HELIX: i due colori, blu e magenta, sono i due giri dell’elica; due nucleosomi adiacenti si trovano uno di seguito all’altro. DNA linker ripiegato che non attraversa l’asse. b) ZIG-ZAG / TWO-START HELIX: i due colori, blu e magenta, rappresentano le coppie alternate di nucleosomi; due nucleosomi adiacenti si trovano ai due lati opposti della fibra. DNA linker tirato che attraversa l’asse.

Il solenoide è una fibra più compatta che si forma in presenza di H1, legato nel foro del solenoide, ha diametro di 33-34 nm e presenta più nucleosomi per giro; per 11 nm ci sono 11 nucleosomi. Questa struttura potrebbe spiegare il linker, di dimensioni variabili, che può piegarsi nella fibra. La struttura a zig-zag si forma in assenza dell’istone H1; ha un diametro di 25 nm e un rapporto di impaccamento dei nucleosomi di 5-6 nucleosomi/11 nm; il linker può solo attraversare la fibra perché non vincolato dall’H1; aumento della lunghezza del linker aumenta il diametro della fibra e la densità dei nucleosomi; difficile immaginare come variazioni della lunghezza del linker siano accomodate senza compromettere i legami tra i nucleosomi adiacenti o senza che questo si pieghi. QUINDI (slide 14): Esistenza di due differenti livelli di condensazione della fibra cromatinica -struttura altamente compatta contenente l’istone linker= SOLENOIDE -struttura più rilassata con regioni trascrizionalmene attive e conformazione cromatinica aperta che si forma in assenza di H1 e in presenza di code istoni del core iperacetilate= ZIG-ZAG *Rimane da capire SE e COME la struttura più condensata possa passare a quella meno condensata e viceversa*.

Ruolo fondamentale nella formazione della cromatina condensata è svolto non solo da proteine istoniche ma anche da proteine NON istoniche, completamente opposte alle isteriche: -carica neutra o negativa -non presentano residui amminoacidici basici -hanno una variabilità molto elevata

Si dividono, in base alle loro funzioni, in: -proteine che regolano la trascrizione -enizimi/fattori attivi in replicazione, trascrizione, ricombinazione e riparazione del DNA(metabolismo a carico del DNA) -proteine associate all’RNA -proteine coinvolte nel compattamento della cromatina Cromosoma mitotico: il 40% delle sue proteine sono 4000 proteine non istoniche(2010). Esempi: -HMG (high mobility group): legano il DNA in conformazione diversa dalla B e sono coinvolte nel rimodernamento della cromatina; hanno dimensioni ridotte ed elevata mobilità elettroforetica. Sono divise in 3 classi, quai HMGA(1,2), HMGB (1,2,3,4), HMGN (1,2,3,4).

-topoisomerasi II: matrice nucleare o scaffold(impalcatura proteica) localizzata nell’asse centrale dei cromosomi mitotici e nelle regioni del nucleo interfasico.

-SMC family(Stuctural Maintenance of Chromosomes): famiglia di proteine molto conservate con ruoli nei meccanismi di coesione (coesine) dei cromatidi fratelli, nell’ assemblaggio dei cromosomi (condensine), nella ricombinazione e riparazione DNA.

CONDENSINE -assemblaggio cromosomi -segregazione cromosomi -componenti dei cromosomi A)5 subunità: 2 sub SMC ATPasi (struttura V) 3 sub non SMC che legano le terminazioni dell’eterodimero SMC Hanno anche attività ATPasica. B)C)D)interazioni DNA con condensino: le condensine legano il DNA(D); ciò stimola att.tà ATPasica che consente l’inserimento di superavvolgimenti positivi nel DNA che compattano ulteriormente la struttura.

Le condensino SMC2 ed SMC4 sono uguali per le condensine 1 e 2. Cambiano solo le subunità non SMC. Le condensine 1 e 2 si associano alla cromatina con la topoisomerasi II in maniera indipendente; se le rimuovo non ottengo un cromosoma metafaisico coretto.

Nella figura sopra, la regolazione delle condensine 1 e 2 in relazione al ciclo cellulare. A) fasi del ciclo cellulare (G2, profase, prometafase, metafase, anafase, telofase).

B) La condensina II è sempre nel nucleo e riuslta essere associata al cromosoma già in profase; la condensina 1, invece, ha accesso ai cromosomi post rottura dell’involucro nucleare(NEBD). C) L’attività della condensina 2 aumenta già dalla fase G2, si stabilizza momentaneamente in profase per poi ricrescere durante la rottura dell’involucro nucleare e resta costante fino ad anafase e telofase, in cui decresce. L’attività della condensino 1, invece, resta assente fino alla rottura dell’involucro nucleare, momento i cui cresce esponenzialmente, per poi restare stabile fino ad anafase e telofase, in cui anche qui decresce. Prima che si dissolva l’involucro nucleare inizia il compattamento reversibile, in cui è coinvolta solo la condensina 2; poi con la rottura dell’involucro nucleare, si associa anche la condensina 1, si forma l’asse cromosomico e il compattamento diventa irreversibile. La cellula è ora destinata(committment)ad iniziare la divisione mitotica. Per cui, la condensina 2 è cruciale per gli stadi precoci della condensazione dei

cromosomi già nel nucleo profasico. La condensina 1, invece, non fa altro che andare a completare il processo dopo la dissoluzione dell’involucro nucleare in una fase postuma. Associata solo in mitosi. La topoisomerasi II è associata alla matrice nucleare interfasica e allo scaffold cromosomico; è associata alla cromatina durante tutto il ciclo cellulare. Inoltre è regolata trascrizionalmente: livello più basso in G1 e aumento poi in fase M. TI II (alfa-cromosoma metafasico e beta )è un enzima regolatore della topologia della molecola del DNA; rispetto alla TI I, effettua dei tagli comportando una rottura transiente della doppia elica, alla quale resta associata per proteggere le due estremità, consentendo inoltre il passaggio di un’altra doppia elica per poi ricucire i filamenti tagliati. Così introduce o risolve i superavvolgimenti positivi nella doppia elica (esempio dell’elastico attorcigliato, non fatto dalla prof).

Serve, inoltre, per avere la separazione dei cromatidi fratelli a fine divisione cellulare. La TI II non fa parte di uno scaffold stabile in quanto senza di essa (principalmente la alfa) la struttura dell’asse si forma ugualmente. Altre evidenze mostrano che senza la TI II, invece, il cromosoma metafasico che viene a formarsi non è corretto.

Le coesine sono simili alle condensine; hanno nella loro struttura eterodimeri SMC3 e SMC1. Hanno il compito di tenere insieme i cromatici fratelli agganciando i due per la loro forma ad anello. Devono essere poi rimossi da anafase a telofase per la separazione dei cromatidi.

MODELLI DEL CROMOSOMA 1°-Multinema o multifilamento: lungo il cromosoma sono disposte molte molecole di DNA[modello errato] 2°-Uninema o a singolo filamento: una sola molecola di DNA si estende ai due estremi del cromosoma da telomero a telomero[modello corretto] Nonostante lunghi studi effettuati, la struttura della fibra cromatinica condensata è ancora un dilemma. MODELLI CROMOSOMA METAFASICO 1-avvolgimento casuale (cenno storico): DNA avvolto a caso, no ruolo istoni se non come rivestimento (pensare ad un cavo elettrico in cui gli istoni sono la plastica) 2-avvolgimento elicoidale: la cromatina si compatta nel cromosoma metafasico per aumento sequenziale della spiralizzazione con andamento elicoidale Da 10 nm-> 30 nm-> 200 nm-> 400/600 nm= diametro cromatidio metafasico 3-scaffold and radial loops: si formano anse di cromatina formate dalla fibra 30 nm; si dispongono radialmente verso l’esterno e si ancorano ad una base, lo scaffold di proteine non istoniche del cromatidio, che ne costituisce l’asse(insieme di 18 loops=rosette).

4-radial loops con avvolgimento elicoidale: avvolgimento elicoidale + radial loops: cambia che lo scaffaold centrale non è dritto ma avvolto in maniera elicoidale, su cui si ancora l’intera fibra 30 nm a formare i loops. a)fibra 30 nm:avvolgimento casuale b)fibra 100-200 nm:avvolgimento elicoidale (poi si compatta fino a 400-600[questo vale per b,c e d]) c)fibra 200 nm:scaffold and radial loops (anse impilate in rosette da 18 loops) d)fibra 200 nm:radial loops(di fibra 30 nm) con avvolgimento elicoidale DOMINI AD ANSE(loop):sono il ripiegamento della fibra di 30 nm in loops o domini ad anse (50-100 Kb ma la taglia in vivo non è nota) indipendenti sia strutturalmente che funzionalmente. La fibra a 30 nm è ancorata su uno scaffold di proteine non istoniche. Le proteine non istoniche rappresentano la matrice nucleare (durante l’interfase)e lo scaffold(in metafase). In interfase hanno due domini: -ha lamina periferica: è un residuo dell’involucro nucleare -è fibrogranulare: costituita da proteine, RNA e residui del nucleolo La loro struttura è molto dinamica e assolvono diverse funzioni quali la regolazione dei processi di trascrizione e replicazione e l’organizzazione delle strutture dei cromosomi Scaffold metafasico:impalcatura proteica centrale cromosomi privati di istoni. La matrice nucleare non è rigida, anzi dinamica, di modo che garantisca la funzionalità del DNA. Deve, quindi, localizzare i geni che, attivi, si trovano alla base di un loop(motivo per cui la polimerasi trascrive i geni attivi vengono trascritti e quelli non attivi no). Alla base, le anse creano interazioni con proteine non istoniche in due sequenze per un totale di 600-1000 bp, che agiscono in cis, che presentano regioni di AT box consenso per le topoisomerasi II(dal momento che i domini sono indipendenti strutturalmente e funzionalmente): -sequenze MAR: matrix attachement region, il sito di ancoraggio della matrice -sequenze SAR: scaffold attachement region, iI sito di ancoraggio dello scaffold

Inoltre, queste sequenze definiscono i confini dei domini cromosomici.

Esistono due modelli di formazione delle anse: 1-TWO-STEP SCAFFOLDING MODEL(Maeshima and Laemmli): utilizzo di tecniche di immunofluorescenza contro condensine e topoisomerasi.

[le topoisomerasi II e le condensine hanno una localizzazione strutturale simile e si dispongono longitudinalmente e ristrette radialmente nell’asse centrale dei cromosomi da un’estremità telomerica all’altra]. Nell’immagine è rappresentata un’immunofluorescenza(ovvero, fluorescenza dovuta a marcatura con anticorpi per Topoisomerasi II e condensina) di cromosomi isolati arrestati in metafase [arresto in metafase->non c’è la formazione del fuso->la divisione si arresta] (A-F) e cellule in mitosi (G-L); la scelta di lavorare con due tipi di cromosomi risiede nel fatto che l’arresto forzato in metafase può portare ad artefatti sperimentali(x es. per interferenza con i processi di compattazione). I segnali delle proteine, che hanno una simil localizzazione per la posizione longitudinale e radialmente ristretta di entrambe, sono stati colorati in rosso (condensine13S in figura A e TI II in figura F)e i cromosomi in blu(DAPI); è presente una visione 3D (D) del cromosoma (presente nell’imm. C-con segnale per la condensina) che mostra l’andamento elicoidale dell’asse(modello dello scaffold in radial loop). In K ed L abbiamo i segnali per condensina(K) e Topoisomerasi II(L) visti alla terminazione dei due cromatidi; il segnale è ristretto radialmente nell’asse centrale dei due cromatidi per entrambe le proteine. In basso, in entrambi i riquadri, è riportata l’intensità di fluorescenza del DAPI rispetto o alla condensina o alla topoisomersi; questo segnale vede una prima fase in cui aumenta, una successiva in cui rimane costante ed una finale in cui poi diminuisce(sia in K che in L). Il segnale per le due proteine, invece, ha due picchi massimi in corrispondenza dell’asse centrale di ognuno dei due cromatidi(segnale massimo= 1/3 del diametro del cromatidio).

LOCALIZZAZIONE DURANTE IL CICLO CELLULARE La topoisomerasi II, a differenza della condensina 13S, è associata ai cromosomi profasici;il segnale è presente già dall’interfase e cresce fino alla telofase; sono visibili al microscopio dei foci brillanti a livello del centromero, da cui si espandono progressivamente tracce più deboli lungo i bracci dei cromatidi. Le condensine danno un segnale debole in profase e forte solo dalla metafase all’anafase.

Nella microfotografia ad alta risoluzione qui accanto abbiamo conferma del fatto che in profase i cromosomi contengono la topoisomerasi II ma non la condensina. A) segnale per DAPI B) segnale per topoisomerasi II C)assenza segnale per condensina E)F) particolare di B dove si vede chiaramente che la topoisomerasi II produce un segnale brillante a livello del centromero che poi si espande sui bracci dei cromatici H) è visibile la localizzazione del segnale per topoisomerasi II(verde) e per la condensina(rosso) contemporaneamente (gli anticorpi hanno due fluorocromi differenti che mi consentono di localizzare i due segnali contemporaneamente). Lungo l’asse del cromosoma si vede un”palo dipinto a spirali”->Barber pole con alternanza di segnali lungo tutto l’asse del cromosoma E)F) ci sono i due segnali contemporaneamente. Nelle altre immagini sono sempre alternati. I)J) criosezioni delle terminazioni del cromosoma: segnali molto vicini ma MAI sovrapposti. Non c’è colocalizzazione dei segnali. La topoisomerasi II predilige zone ricche in adenina. Questo barber pole è un artefatto? I due anticorpi, somministrati insieme, potrebbero escludersi l’uno con l’altro o potrebbero competere. Prova: gli anticorpi sono stati somministrati prima quello per la topoisomerasi e poi quello per la condensina e poi viceversa. Il risultato è sempre il medesimo, a barber pole; non è

un artefatto. Questo è il modello dello scaffold in due passaggi. Nell’immagine sopra abbiamo due fasi reali (la profase e la metafase) e due fasi ipotetiche. -DNA: blu -Topoisomerasi II: verde -condensina: rosso

1- “Pre-profase” in cui la Topoisomerasi II si associa con le regioni eterocromatiche, preferenzialmente in regioni centromeriche, e costituisce un serbatoio che guida l’assemblaggio della cromatina a formare l’asse ricco in Topoisomerasi II. 2-evidenze sperimentali in cui si vedono i foci brillanti al centromero e meno brillanti lungo le braccia. 3-la condensina lega i cromatidi, partendo dall’esterno, e inizia ad interagire col cromosoma metafasico 4-cromosoma metafasico con aspetto barber pole 2-“HIRICAL FOLDING, AXIAL GLUE(Kireeva et al.):folding gerarchico e colla assiale Immagini di condensazione della cromatina. A)individulizzazione B)condensazione C)risoluzione Fino alla profase i cromosomi sono singole entità, si accorciano pian piano e si associano poi nei cromatidi fratelli. Kireeva e collabora...