TD2 Cytométrie en flux - Correction TD 2 Immunologie PDF

Preview

Summary

Correction TD 2 Immunologie...

Description

TD n°2 : Immunologie

Cytométrie en flux Introduction   

Technique permettant de compter et de caractériser des cellules en les faisant défiler à grande vitesse dans un faisceau lumineux La caractérisation est basée sur l’étude de la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) Technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de cellules en suspension dans un liquide

Composition d’un cytomètre

Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes -

-

Système fluidique : flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser Présence d’un liquide entraineur et du laser. Il est très important que les cellules ne passent qu’une à une devant le laser (possibilité d’artéfacts dus aux doublets de cellules) Système optique : rayon laser et différents filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées (jeu de miroirs transmettant la lumière) Système électronique : → PMT qui capte la lumière émise → Digitaliseur qui transforme la lumière en signal électrique puis en signal numérique → Ordinateur qui gère et entrepose les données

Paramètres étudiés     

Compter les cellules en suspension Mesurer la lumière diffusée mais aussi la fluorescence d’une cellule, ou de marqueurs cellulaires Trier des cellules individuelles pour des analyses ultérieures Séparer les cellules vivantes et mortes Analyser 105 à 5x106 particules en moins d’une minute

Principe    



Propulsion des cellules une à une à grande vitesse dans un flux hydrodynamique Passage devant une source lumineuse (laser) Récupération de la fluorescence issue d’un immunomarquage le plus souvent Adaptée aux cellules en suspensions et donc à l’analyse de liquides biologiques : sang, lavage bronchoalvéolaire (cellules des alvéoles pulmonaires), ascite ou épanchement pleural (liquide intra-péritonéal), LCR, aspiration médullaire Possibilité tout de même d’analyser des cellules tissulaires après dissociation

Trajet optique dans un cytomètre -

-

Deux lasers (635 et 488 nm) au travers d’une lentille → miroirs reflétant la lumière selon la longueur d’onde émise → passage dans un canal spécifique de la longueur d’onde Enregistrement d’autres faisceaux (non liés à la fluorescence) donnant des informations sur la taille et la structure de la cellule via les canaux SSC et FSC

Informations recueillies sur la cellule -

-

-

Taille relative → FSC (foward scatter), diffusion aux petits angles → Correspond à la lumière diffractée Sa granularité ou sa complexité interne relative → SSC (Side scatter), diffusion aux grands angles → Correspond à la lumière réfléchie Son intensité relative de fluorescence

Les immunomarquages Marqueurs des macrophages : CD14 Direct Incubation avec des Ac couplés à un fluorochrome → liaison Ac – marqueurs des cellules → émission d’un signal Indirect Incubation avec Ac primaire non fluorescent → reconnaissance du marqueur de surface → incubation avec Ac de surface couplé à un fluorochrome → émission d’un signal

Exemple de figure Monocytes : famille des leucocytes (globules blancs) -

Les plus grandes cellules circulant dans le sang Rondes ou ovales, mesurent de 15 à 40 µm de diamètre

Granulocytes (plusieurs sortes) : taille ≈ 15 µm Lymphocytes : cellules ovoïdes, nucléées

Champs d’utilisation  

On peut utiliser des marqueurs fluorescents pour obtenir des informations supplémentaires Ex : AC fluorescents Très utile pour identifier et quantifier des populations distinctes de cellules, des récepteurs membranaires, mesurer des activités enzymatiques

Recouvrement spectral On utilise deux fluorophores en tandem (FL1 et FL2) avec les spectres d’émission suivants Largeur spectrale d’observation dans les canaux A et B Recouvrement spectral : le spectre d’émission de FL2 est partiellement inclus dans le canal A et celui de FL1 dans le canal B Compensation : ajustement pour éliminer recouvrement → quantification plus juste

les

artefacts

de

Les paramètres FSC/SSC Mesure de phénomènes de diffusion lumineuse -

FSC : la lumière diffractée est collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est relatif à la taille de la cellule (= taille de la cellule) SSC : la lumière est collectée à 90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la cellule (= granulométrie de la cellule)

Identification des cellules sanguines : exemple de l’étude des lymphocytes -

Gating : repérage suivant taille et granulosité → gating Double marquage pour discriminer les LB (CD19) et T (CD3) → CD19 marqué à la phycoerythrine (PE) → LT → CD3 marqué à la fluorescine (FITC) → LB

B3 : n’expriment ni CD19 ni CD3 → lymphocytes NK ? B2 : pratiquement aucun positif → normal car aucun hybride LB-LT

Autre possibilité d’analyse : lymphocytes T Différenciation des LT cytotoxiques (CD3 CD8) et LT auxiliaires (CD3 CD4)

Applications Marquage annexine V-FITC Annexine V = fixation de phosphatidylsérine (mb externe en apoptose, mb interne si cellule vivante) -

Aucune fixation si cellule intacte → spectre de fluorescence quasi nul (vers la gauche) Cellule en apoptose → fixation de l’annexine V sur la phosphatidylsérine → déplacement du spectre vers la droite Cellule en nécrose (mort inflammatoire) → présence de trous dans la mb → fixation sur la phosphatidylsérine toujours dans la mb interne → nécessité d’un second marqueur iodure de propidium (fluorochrome marqueur des noyaux) → marquage des noyaux et des phosphatidylsérine → différenciation entre nécrose et apoptose

Dosage de cytokines inflammatoires (immuno-monitoring) -

Nouvelle application, apparentée à l’ELISA Dosage de molécules en suspension à partir d’un faible volume (< 50 µL) Cocktail de billes recouvertes chacune d’un Ac de capture, dosage simultanée de plusieurs molécules et révélation à l’aide d’un Ac secondaire fluorescents → Kit permettant de déterminer le profil TH1/TH2 des cellules...