Techniki barwienia preparatów PDF

Preview

Summary

przegląd technik barwienia preparatów histologicznych, mikroskopia elektronowa...

Description

WYKŁAD 2 z dr M Dubińska-Magiera

- Mikroskopia elektronowa Do tworzenia obrazu powiększonego służy strumień elektronów wytwarzany w warunkach wysokiej próżni. Uzyskiwane powiększenia mieszczą się w zakresie od 1000 do 500 000 x. TEM – transmisyjny mikroskop elektronowy SEM – skaningowy m. e.

- TEM „barwnikami” w TEM są związki metali ciężkich Rejony niewykontrastowane swobodnie przepuszczają elektrony (jasne), rejony wykontrastowane powodują ich znaczne rozproszenie (ciemne). Przygotowanie materiału do obserwacji w TEM - Utrwalenie (najczęściej w aldehydzie glutarowym i OsO4) - Przepojenie żywicami - Ultracienkie skrawki - Kontrastowanie solami uranu i ołowiu Ultramikrotom – różni się precyzją od zwykłego mikrotomu, nóż jest wyższej jakości (noże szklane, diamentowe, natomiast nie stosuje się tu noży stalowych) Siatki – zamiast tradycyjnych szkiełek podstawowych. Jest to po prostu odpowiednik szkiełka podstawowego, na którym montuje się skrawki. Taka siatka trafia na stolik przedmiotowy (za pomocą precyzyjnej pęsety wkłada się ją do odpowiedniego uchwytu w stoliku przedmiotowym m. elektronowego).

- SEM W SEM oglądamy obraz powierzchni preparatu. Przygotowanie materiału do SEM: Utrwalenie, odwodnienie, wysuszenie, napylenie (węglem, złotem)

BARWIENIE: Ogólne (histologiczne) i specyficzne

- B. histologiczne Ma na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych za pomocą zróżnicowanych barwników. B. ma niski stopień swoistości. - Klasyfikacja barwników: Ze względu na ilość użytych barwników: 1. Barwienie pojedyncze z użycie tylko jednego barwnika np. czerni Sudanu, błękitu metylenowego 2. Złożone: 2 lub więcej barwników np. metoda Massona, H&E W zależności od metody, używa się barwniki równocześnie lub kolejno.

Barwniki Podczas barwienia należy skrawek uwodnić: alkoholu o takim stężeniu, w jakim jest rozpuszczony barwnik lub wodą, gdy używa się wodnych roztworów barwnika. Barwienie zasadowe - Barwnikami są głównie sole zasad - barwią się jądra komórkowe oraz zasadochłonne substancje cytoplazmatyczne np. ergastoplazma (ergastoplazma – obszar zasadochłonnej cytoplazmy, zawierający skupienia cystern szorstkiej siateczki śródplazmatycznej)

- Do barwników zasadowych zaliczamy: błękit toluidynowy, tioninę, a także niektóre barwniki roślinnego takie jak hematoksylina (ale te z kolei wymagają połączenia z bejcą). Hematoksylinę otrzymuje się z rośliny drzewiastej o nazwie Modrzejec kampechiański (łac.Haematoxylum campechianum)

Barwienie kwaśne - Są to niektóre kwasy oraz sole - Barwią przede wszystkim cytoplazmę komórkową - Najczęściej używanymi barwnikami są eozyna, czerwień Kongo, kwaśna fuksyna, oranż G itd.

Barwniki obojętne (amfoteryczne): - związki barwne soli kwasów i zasad - Cechą charakterystyczną b. obojętnych jest jednoznaczna zawartość w mieszaninie składnika zasadowego i kwaśnego.

- azur metylenowy, barwniki rozpuszczalne w tłuszczach Sudan III, sudan czarny

Barwienie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi: Najpopularniejszą metodą barw. jest wykorzystanie barwników kwaśnych (eozyna) i zasadowych (hematoksylina). H&E Jądro komórkowe – niebieskie (H) Cytoplazma komórkowa, włókna kolagenowe, mięśnie, eytrocyty – czerwone (eozyna)

Barwienie – zasady 1) Kontrola przebiegu barwienia (pod małym powiększeniem mikroskopu) 2) Nie wysuszać skrawków 3) Różnicowanie przebarwionych skrawków określonymi dla barwnika płynami (pod mikroskopem) 4) Kolejność wybarwienia skrawków zależy od rodzaju stosowanych barwników; najczęściej najpierw barwi się b. zasadowymi, potem kwaśnymi 5) Staranne płukanie skrawków, pomiędzy stosowaniem różnych barwników i po zakończeniu barwienia Czas barwienia Jest różny dla różnych metod i różnych barwników. Zależy od: 1) 2) 3) 4) 5)

Natury barwionego materiału Rodzaju i długości utrwalania Metody zatopienia Grubości skrawków Innych czynników: składu chemicznego roztworu barwnika, temperatury barwienia

Lepsze wyniki uzyskuje się barwiąc tkanki rozcieńczonymi roztworami barwików przez dłuższy czas Metody barwienia – podział ze względu na rodzaj wykrywanych struktur: 1) B. cytologiczne (ocena stanu komórek, np. aby ocenić ryzyko występowania komórek nowotworowych) Cel: szczegółowe badanie struktur wewnątrzkomórkowych np. mitochondriów, jądra kom.

2) B. topograficzne (aby ocenić całość struktury tkanki) Cel: uwidocznienie wzajemnego stosunku poszczególnych struktur komórkowych oraz tkanek tworzących określony narząd

3) B. struktur zrębowych Cel: dokładne badanie podłoża łącznotkankowego w poszczególnych narządach

4) B. specjalne: dotyczy określonych tkanek i narządów. Np. metody barwienia krwi, barwienia tkanki nerwowej. Cel: dokładniejsze i najwszechstronniejsze badanie tych tkanek zarówno pod względem cytologicznym, jak i topograficznym

5) B. cyto- i histochemiczne. Są to metody uwidoczniania w komórkach i tkankach określonych substancji np. ziaren glikogenu, tłuszczy, cukrów 6) B. progresywne i regresywne 7) Bejcowanie tkanek (proces przepajania tkanek określonymi sub., które ułatwią barwienie pewnych struktur określonymi barwnikami)

8) Metachromazja (barwnik daje efekt nieco inny niż spodziewany np. Azur B zielone DNA)

Wybór metody zależy od: 1) Celu badań, np. cytologiczne, topograficzne, cytochemiczne, „łączone” itp. 2) Rodzaju utrwalającej substancji np. po utrwaleniu preparatów w kwasie osmowym hematoksylina źle barwi jądra kom., a safranina dobrze 3) Sposobu zatopienia skrawków Barwienie Massona - 3 barwniki (hematoksylina, kwaśna fuksyna, b. anilinowy) Wykrywanie i różnicowanie włókien kolagenowych Wynik: Włókna kolagenowe- niebieskie Cytoplazma – czerwona Jądra komórkowe – purpurowe/ granatowe

Badanie histopatologiczne - badanie mikroskopowe materiału cytologicznego (komórkowego) lub histologicznego (tkankowego) Barwienie Papanicolaou - hematoksylina Harrisa, orange G6, EA-50 (alkoholowy roztwór eozyny 4, zieleni świetlnej SF, brunatu Bismarcka, k. fosforo-wolframowego i węglanu litu)

Interpretacja preparatów histologicznych Obrazy widziane na skrawkach zależą od kąta przekroju Mikroskopia wirtualna Sprzężenie komputera i urządzenia magazynującego wraz z odpowiednim oprogramowaniem  Skaner preparatów histologicznych Stolik przedmiotowy (jest kontrolowany elektronicznie), preparaty są zasysane do środka (szkiełko podstawowe jest pobierane z podajnika) i skanowane. Umożliwia zarejestrowanie całego preparatu bez konieczności „sklejania obrazów”. Zamiast oceny preparatu pod mikroskopem oglądamy jego wirtualny, cyfrowy odpowiednik na ekranie komputera. Dzięki temu użytkownik ma wgląd w cały preparat a jego fragmenty mogą być powiększane przy zachowaniu pełnej rozdzielczości optycznej, dodatkowo jeden obraz może być w tym samym czasie udostępniany nieograniczonej liczbie odbiorców w sieci wewnętrznej lub zewnętrznej przez internet.

Preparat wirtualny Cyfrowy zapis zeskanowanego całego preparatu mikroskopowego lub jego istotnej części Może być analizowany: - w każdym dowolnym obszarze skrawka histologicznego - w szerokim zakresie powiększeń - na monitorze komputera (bez mikroskopu) Bazy preparatów: Vmscope.com/virtuelle-mikroskopie-technik.html M. wirtualna – zastosowanie: - edukacja - telekonsutacje - centra onkologiczne (Bank Mikromacierzy Tkankowych Nowotworów Złośliwych) - archiwizacja: kolekcje rzadkich okazów - badania naukowe (TMA, analiza ilościowa) Korzyści: - długoterminowe przechowywanie bez utraty jakości - możliwość wykorzystania wirtualnych preparatów do telekonsultacji - możliwość uzyskania wielu kopii preparatu do wykorzystania w różnych celach Telepatologia - wykorzystanie zautomatyzowanych mikroskopów połączonych do kamery cyfrowej i komputera - transmisja obrazu w czasie rzeczywistym (internet, telefon kom.) - zdalna obsługa mikroskopu (obiektywów, poruszanie się po preparacie, zbliżenie)

M. wirtualna vs telepatologia M. wirtualna: Preparat w formie cyfrowej, dostępny w każdej chwili i w każdym miejscu. Nie jest potrzebny m. świetlny do oglądania preparatu cyf. Telemikroskopia: preparat w formie „tradycyjnej”, jego obraz jest przesyłany w czasie rzeczywistym Przed uzyskaniem dostępu preparat musi znaleźć się w mikroskopie świetlnym ………

Mikromacierze tkankowe (TMA) Pojedynczy blok parafinowy zawierający fragmenty tkanek z wielu nowotworów, które są oceniane jako poj. preparat mikroskopowy Ze schematu, który był na slajdzie: - selekcja i zgromadzenie odpowiednich bloków parafinowych zawierających badane tkanki (tzw. blokdawca) - wykonanie preparatów barwionych (barwienie bloków-dawców) - ocena histopatologiczna preparatów - pobranie cylindrycznych fragmentów badanej tkanki (z bloków-dawców) i umieszczenie ich w odpowiednich co do średnicy otworach w blokach-biorcach - zatopienie pobranych fragmentów w bloku-biorcy, w parafinie, cięcie (do 200-300 skrawków o grubości 4 µm) - analiza uzyskanych skrawków Zastosowania i zalety TMA - narzędzie w histopatologii - ocena biomarkerów w tkankach zmienionych nowotworowo - poszukiwanie nowych markerów - badania naukowe nad biologią nowotworów - duża wydajność analizy ekspresji genów - możliwość równoczesnego porównania wielu tkanek - stosunkowo duża oszczędność materiału wyjściowego - możliwość zastosowania różnych technik analizy - ocena skuteczności leków w badaniach klinicznych

Mikrodysekcja Laserowe pozyskiwanie mikroskładników. Technika precyzyjnego pozyskiwania materiału do badań molekularnych. Badania molekularne przeprowadzane są najczęściej na heterogennym materiale biologicznym – uzyskane wyniki obrazują stan rzeczy istniejący w różnych typach komórek. Mikrodysekcja umożliwia pozyskiwanie pojedynczych komórek z heterogennego materiału (w stanie prawie niezmienionym pod względem zarówno morfologicznym, jak i biochemicznym).

Przygotowanie materiału do mikrodysekcji: 1) Pobieranie materiału badawczego; fragmenty tkanek, żywe bakterie, drożdże, komórki z hodowli, plemniki 2) Utrwalenie materiału (ma zapewnić zabezpieczenie morfologii, składu i budowy interesujących nas cząsteczek oraz umożliwić izolację białek, DNA i RNA) 3) Przygotowanie preparatów histologicznych oraz cytologicznych - przygotowanie odpowiedniej grubości skrawków. Skrawki mrożeniowe lub parafinowe umieszczane są na szkiełku lub membranie. Preparaty cytologiczne wykonuje się na szkiełkach podst. lub membranach przy pomocy Cytospin (wirówka do izolowania m. cytologicznego). Barwienie histologiczne (np. HE, zieleń metylowa) -> w celu uwidocznienia interesujących nas populacji komórek. Identyfikacja pożądanych komórek na podstawie ich budowy. IHC (techniki immunohistochemiczne) lub IF (t. immunofluorescencyjne) -> specyficzna identyfikacja charakterystycznych składników komórek i tkanek poprzez tworzenie kompleksów antygen-przeciwciało sprzężonego z reakcją barwną Odwodnienie (dehydratacja preparatu)

4) Wycinanie komórek Komórki pozyskuje się przy użyciu energii wiązki laserowej promieniowania podczerwonego (IR) lub ultrafioletowego (UV). Przygotowanie preparatów do mikrodysekcji: - Preparaty mrożeniowe: Tkanki muszą być zamrożone szybko po pobraniu w celu ograniczenia ewentualnej degradacji RNA czy białek. Po cięciu na kriostacie na specjalne szkiełka, nie należy wysuszać tkanek. - Preparaty parafinowe Należy używać świeżo przygotowanych rozpuszczalników/barwników w bardzo małej ilości – kilka kropel bezpośrednio na tkankę Preparaty muszą być w pełni odwodnione (sekwencja etanoli i ksylenu)

LMG (mikrodysekcja laserowa metodą opadania grawitacyjnego) - obserwacja preparatu w mikroskopie - preparat na szkiełku pokryty jest membraną z polietylenem naftalenu (PEN) - wiązka lasera UV opada grawitacyjnie na wieczko ependorffki

PRZYDATNE DO TEGO WYKŁADU: http://www.script.home.pl/pbkom/roczniki/pdf2011/pbk%2011-3/s453-466.pdf file:///C:/Users/Agnieszka/Downloads/46191-93067-1-PB.pdf http://bmz.wbbib.uj.edu.pl/documents/2167477/e14a63cb-2247-4c09-93ba-739cccd02d8 http://www.cs.put.poznan.pl/kkrawiec/wiki/uploads/Zajecia/ZIMw9.pdf Książka: S. Zawistowski, Technika histologiczna histologia oraz podstawy histopatologii (1983) Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich...