Techniki Przygotowywania Preparatów Mikoskopowych PDF

Preview

Summary

Download Techniki Przygotowywania Preparatów Mikoskopowych PDF

Description

 

TECHNIKI PRZYGOTOWYWANIA PREPARATÓW MIKOSKOPOWYCH

- zwykle niebarwione - sporządzane do obserwacji morfologii komórek, - ruchu komórek, żywotności, sposobu rozmnażania (u mikroorganizmów) - ruchu składników komórek - określenia ilości komórek żywych - struktury, charakterystyki chemicznej i zawartości suchej masy poszczególnych składników komórki.

W trakcie obserwacji przyżyciowych komórka żywa powinna:

  

wykazywać ruch cytoplazmy ulegać plazmolizie (ewentualnie również deplazmolizie) barwić się wybiórczo barwnikami przyżyciowymi

 Etapy przygotowania preparatów przyżyciowych (kropla spłaszczona):  

odtłuścić szkiełko mikroskopowe (etanol lub chloroform) hodowle bakteryjne rozprowadzić we wcześniej naniesionej na szkiełko kropli wody lub płynu fizjologicznego Hodowle tkankowe – pocięcie tkanki na skrawki za pomocą żyletki, skalpela lub mikrotomu. Skrawki przenieść na szkiełko podstawowe i dodać kroplę wody. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym





Barwienie przyżyciowe - cel

 w celu odróżnienia komórek żywych od martwych,  stwierdzenia obecności substancji zapasowych  w badaniu przepuszczalności błony cytoplazmatycznej  barwnik nietoksyczny, b. duże rozcieńczenie  badanie procesów wnikania, nagromadzania się i wydzielania substancji w komórkach żywych. Mechanizm barwienia przyżyciowego





chemiczne wiązanie ze składnikami komórki (np. barwienie garbników w wakuolach) elektroadsorbcję barwnych anionów lub kationów

 

wskutek rozpuszczenia się barwnika w określonych składnikach chemicznych komórki (np. barwniki hydrofilne i lipofilne)

   

Barwienie przyżyciowe ułatwia obserwacje struktur barwiących się wybiórczo barwniki wprowadza się do środowiska (pożywki)

barwniki - mała toksyczność dla komórki (błękit metylenowy, czerwień obojętna); duża kontrastowość w małych stężeniach



barwniki - związki aromatyczne – barwniki zasadowe – najczęściej stosowane - grupa chromatoforowa jest kationem (błękit metylenowy, czerwień obojętna, zieleń Janusa) - barwniki kwaśne – grupa chromotoforowa jest anionem - obojętne – nieliczne ze względu na: dużą toksyczność barwników i odczynników

 

potrzebę trwałego połączenia badanego związku z zawierającą go strukturą komórkową niebezpieczeństwo zniekształceń powstałych w trakcie niekontrolowanego zamierania Etapy przygotowania preparatu trwałego

  • •

odtłuścić szkiełko przedmiotowe przygotowanie badanego materiału bakterie

-

nanieść kroplę płynnej hodowli bakteryjnej lub badanego materiału,

-

zawiesinę rozprowadzić ezą,

pozostawić do wyschnięcia na powietrzu hodowla tkankowa

-

materiał pociąć na skrawki za pomocą żyletki, skalpela lub mikrotomu.

•

utrwalenie –szybki dostęp utrwalacza do komórek -materiał powinien być bloczkiem o wymiarach nie większych niż 5mm.



utrwalanie



Utrwalanie - szybkie zabicie komórki, przerywanie procesów biologicznych w komórce; pozwala zachować strukturę komórek, zapobiega zmianom pośmiertnym



Cel utrwalania:

◦ zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, ◦ precypitacja niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych,

◦ wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności, 

Utrwalacze stabilizują składniki komórek na drodze zmiany ich właściwości chemicznych.



W przypadku preparatu bakteryjnego utrwalanie pozwala przytwierdzić do szkiełka komórki, co zapobiega ich zmyciu podczas barwienia i umożliwia wnikanie barwnika do wnętrza komórek przed utrwalaniem tkankę roślinną odpowietrzyć (zastąpić powietrze wodą lub r-rem soli o odpowiednim pH i stężeniu, w warunkach podciśnienia)

 

rodzaje utrwalania Bakterie

◦

Utrwalanie termiczne – kilkakrotne przesunięcie szkiełka z rozmazem nad płomieniem palnika od spodu preparatu.

◦

Utrwalanie chemiczne - etanol, metanol, mieszanina alkoholu i eteru 1:1 – polega na zalaniu wysuszonego rozmazu na określony czas utrwalaczem, który następnie zlewa się a preparat suszy na powietrzu.

Organizmy tkankowe

 formalina – r-r10% , kwas pikrynowy, dwuchromian potasu czas utrwalania  zależy od rodzaju zastosowanego utrwalacza, rodzaju tkanki oraz wielkości wycinka, zwykle jest nie krótszy niż 12 godzin

  

utrwalacz



Utrwalacze

składa się ze środka utrwalającego i nośnika.

Nośnik utrzymuje stałe pH i osmolarność podczas utrwalania (by utrwalacz nie deformował komórek i organelli) oraz skład jonowy (by nie dochodziło do wytrącania i ekstrakcji materiału). Najlepszymi nośnikami są bufory.

◦ proste – etanol, metanol, aceton, kwas octowy, aldehydy, np.

glutarowy (stabilizuje on struktury białkowe, przez tworzenie wiązań krzyżowych, co zapobiega ekstrakcji białek buforem)

◦ złożone – np. płyn Carnoy’a (zalety: szybka penetracja tkanek, ,

wstępna maceracja tkanki, korzystnie wpływa na morfologię i barwliwość chromosomów), formalina (paraformaldehyd + aldehyd glutarowy – PF stabilizuje struktury, a aldehyd glutarowy je utrwala)

◦ Dobór czasu i temperatury utrwalania zależy od rodzaju utrwalacza i utrwalanej struktury

 

(Dotyczy tylko bakterii: Barwienie)

W przypadku preparatów bakteryjnych po etapie utrwalania następuje barwienie, zalanie utrwalonego rozmazu roztworem barwnika tak, aby pokrywał całą jego powierzchnię.



Czas barwienia zależy od stosowanego barwnika - od kilku sekund do kilkunastu minut.



Barwnik zlewamy a preparat spłukujemy wodą, aż spływać będą bezbarwne krople. Preparat osuszamy i oglądamy.

 

Odwadnianie

odwadnienie – utrwalacze są r-rami wodnymi dlatego materiał przed zatopieniem (wosk, żywice – nie rozpuszczają się w wodzie) należy odwodnić. Płyn odwadniający dobiera się w zależności od tego, w czym zatapiany będzie materiał. w alkoholu etylowym (lub acetonie) o wzrastającym stężeniu (tzw. szereg odwadniający) 50-100%, po kilka –kilkanaście godzin (minut – czas odwadniania powinien być możliwie najkrótszy) w każdym roztworze, w temp. pokojowej. w płynie 70%owym, można przetrzymywać materiał wiele miesięcy.



 

płyny pośrednie

Przed zatapianiem – media zatapiające nie łącza się z alkoholem ani acetonem, dlatego - stosowanie płynów pośrednich - łączą się z alkoholem lub acetonem i z płynami zatapiającymi



Medium zatapiające/płyn pośredni parafina/ksylen żywice poliestrowe/styren/ aceton (do odwadniania) – żywice epoksydowe (np. Epon)/aceton i alkohol, najlepszy - tlenek propylenu



Media zatapiające nie wymagające płynów pośrednich: wosk Steedmana – temp. topn. 37stopni C-nie denaturuje białek – w badaniach cytoszkieletu LR White – żywica akrylowa o małej lepkości, ten sam bloczek z preparatem można stosować do m. świetnego i elektronowego z użyciem przeciwciał znakowanych złotem lub srebrem



zatapianie Medium zatapiające dobieramy w zal. od tego co chcemy obserwować oraz dalszej procedury barwienia lub znakowania preparatów Białka, kwasy nukleinowe, węglowodany - w płynnej parafinie, po ochłodzeniu tworzą się boczki parafinowe;



zatapianie w żywicy -do analizy mikrotubul – wosk Steedmana

-obserw. ścian komórkowych –żywica Epon -obserw. z zast. przeciwciał – LR White



  

Trymowanie i skrawanie trymowanie – formowanie bloczka pod mikroskopem skrawanie – na mikrotomie rotacyjnym na grubość 5-7μm (2-30μm),

noże – metalowe, szklane, diamentowe (w zależności od medium zatapiającego i grubości skrawka)

grubość skrawków 50-100µm.

   

bloczki parafinowe – 10-15 mikrometrów

 

Naklejanie i Barwienie

wosk Steedmana – 7-10 mikrometrów Epon-nawet 1 mikrometr

Wynik krojenia- bloczki parafinowe – wstęga złożona z pojedynczych skrawków (trzeba ją rozprostować umieszczając na pow. wody o temp. 40 stopni); żywice – pojedyncze skrawki wyłapywane ezą z wanienki z wodą

naklejanie na szkiełko podstawowe – - przed przyklejeniem skrawków, szkiełka (odtłuszczone) pokryć lepikami (lepik Haupta, albumina Mayera, Poli-L-lizyna); suszenie w temp. pokojowej



barwienie – przed barwieniem skrawki odparafinować i uwodnić, barwienie, pokrywanie balsamem kanadyjskim i przykrywanie szkiełkiem nakrywkowym



Barwienie

  

obserwacje i rozróżnianie organelli

Cel

określenie kształtu komórek i ich liczby, u drobnoustrojów dodatkowo obserwacja tworzenia układów



Barwienie - proces fizykochemiczny – barwnik adsorbuje się na ścianie komórkowej lub dyfunduje do wnętrza komórki



Barwniki – najczęściej barwniki zasadowe, w których barwny jest kation ze względu na powinowactwo do kwaśnych składników cytoplazmy.

 

Barwniki

u bakterii najczęściej zasadowe barwniki anilinowe, co wynika z budowy i składu chemicznego osłon komórkowych, barwniki anilinowe - powinowactwo do kwaśnych składników komórki - duża ilość grup fosforanowych kwasów nukleinowych – kwaśny charakter cytoplazmy.

 

barwienie - śmierć komórki, zwykle barwi się jednolicie chyba, że stosujemy metody różnicujące.



barwienie drobnoustrojów głównie barwniki zasadowe: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczki, fuksyna zasadowa, safranina, zieleń malachitowa i inne



Metody barwienia W zależności od liczby barwników:



proste (monochromatyczne) – jeden barwnik; najczęściej w barwieniach przyżyciowych. W preparatach utrwalonych stosuje się rzadko gdyż pozwala jedynie na stwierdzenie obecności komórek, obserwację ich kształtów i układów.



złożone – działamy na komórkę kilkoma barwnikami lub ich mieszaniną; do barwienia preparatów utrwalonych. zaprawianie (bejcowanie)- przed barwieniem złożonym w celu zwiększenia chłonności barwnika, ułatwienia jego reakcji z cytoplazmą i trwałego utrzymania go w komórce.





Metody barwienia W zależności od celu barwienia (komórka lub tło):



pozytywowe – obserwujemy zabarwione komórki na niezabarwionym tle



negatywowe – niezabarwione komórki na wybarwionym tle, stosuje się dla organelli nie wchłaniających barwnika. Barwniki o konsyst. tuszu; nie mają dostatecznej dyspersji, co nie pozwala wnikać im do wnętrza (tusz chiński, nigrozyna, czerwień Kongo) negatywowo-pozytywowe- najpierw stosuje się jeden z barwników negatywowych (gruboziarnistych) gruboziarnistych, z którym miesza się zawiesinę komórek i rozprowadza na szkiełku podstawowym, po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem pozytywowym.



 

struktury komórkowe, związki chemiczne i ich barwniki

mitochondria - Zieleń Janusa – po wniknięciu do komórki ulega redukcji i przekształca się w związek bezbarwny. Po utlenieniu w mitochondriach dzięki działaniu oksydazy cytochromowej pojawia się kolor niebieskozielony. jądro/cytoplazma - hematoksylina (substancje kwaśne – chromatyna na czarno lub granatowo), eozyna (cytoplazma na czerwono) – jest to tak zwane barwienie podwójne – różnicuje komórkę część jądrową i cytoplazmatyczną,

 

barwienie jąder i jąderek – safranina, orceina, nigrozyna, fuksyna kwaśna, hematoksylina

   

kutyna, suberyna – Sudany lub błękit Nilu pektyny – czerwień rutenowa, błękit metylenowy lignina – floroglucyno + kwas solny skrobia – płyn Lugola



Odwadnianie  przed zamknięciem wybarwiony preparat odwadniamy we wzrastających stężeniach alkoholu, ze 100% alkoholu - do izopropanolu (gdy zamykamy w Euparalu) lub do ksylenu (gdy zamykamy w balsamie kanadyjskim) Zamykanie

 

pokrycie preparatu medium zamykającym i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym media zamykające dla prep. nietrwałych – woda, 50% glicerol

 

media zamykające dla preparatów trwałych – balsam kanadyjski, Euparal (preparaty trwałe przez kilka miesięcy-kilka lat)...