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TEMA 5.- PROTEÍNAS III TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS BIOQUÍMICA TEMA 5. PROTEÍNAS III. TÉCNICAS __________________________________________________________________________ ______________________________ Aspectos generales Una buena parte del trabajo en bioquímica implica la purificación de las moléculas de estudio, ya que una célula contiene miles de sustancias distintas, muchas de las cuales son semejantes por sus propiedades físicas y químicas. Además, estas moléculas son más o menos inestables y se encuentran en cantidades muy pequeñas. Para estudiar y caracterizar una molécula determinada es necesario disponer de ella en estado puro, o en un alto grado de pureza (más del 98%), mientras en la célula es frecuente que signifique menos del 0.1% de su peso seco (menos aún si consideramos el agua). Algunas de las técnicas que se estudian a continuación son comunes a moléculas distintas de las proteínas (cromatografía, centrifugación, electroforesis...), por lo que es de gran importancia comprender bien su fundamento. En cualquier caso, la descripción en profundidad de las técnicas de estudio y separación de biomoléculas queda fuera de los objetivos de esta asignatura, de manera que sólo veremos algunas de las características más relevantes. En general el primer paso en la purificación de una proteína es la elección de la fuente biológica: el material de partida. Distintos organismos o tejidos de un mismo organismo pueden contener la proteína en la que estamos interesados. Por tanto, es conveniente buscar un material biológico disponible en cantidades suficientes, y que tenga una riqueza tan alta como sea posible en nuestra proteína. En este paso estaremos limitados por las restricciones que imponga el estudio que queremos hacer en las características de la proteína: las distintas fuentes pueden tener variantes de la proteína cuyas características no sean adecuadas. Por ejemplo, si queremos estudiar la enzima glucolítica hexoquinasa, podemos elegir entre una gran variedad de organismos, ya que prácticamente todos tienen esta actividad catalítica, pero las propiedades de la hexoquinasa en organismos procariotas, vegetales y animales pueden ser muy diferentes. Los microorganismos tienen la ventaja de poder crecerse en el laboratorio en grandes cantidades, pero la regulación de la actividad de sus proteínas puede ser significativamente distinta de la que tiene lugar en animales. Una posibilidad muy empleada actualmente es

el uso de la clonación molecular para producir grandes cantidades de proteínas en microorganismos, cualquiera que sea el origen de la proteína buscada. El gen correspondiente puede ser aislado de su organismo, y utilizando las técnicas de ingeniería genética, insertado en un microorganismo (bacteria, levadura,...), de manera que éste sintetice la proteína en grandes cantidades. Una vez tenemos el material de partida, es necesario obtener la proteína en disolución libre de células (romper las células que la contienen). Este paso depende del tejido biológico con el que trabajemos y de la localización subcelular de la proteína (si es nuclear, citosólica, mitocondrial, etc.). En estos pasos se necesita una técnica de rotura celular y técnicas de centrifugación que separen los distintos componentes u orgánulos celulares. Es frecuente utilizar desde este paso agentes que estabilicen la proteína en cuestión (controlar el pH, la fuerza iónica, impedir la degradación de las proteínas por temperatura, por la acción de enzimas e incluso de microorganismos). También se hace necesario el uso de métodos de detección de la proteína que queremos, para poder comprobar que las separaciones que hacemos son correctas, y para medir la concentración de la proteína. Si nuestra proteína tiene actividad enzimática, ésta suele ser utilizada (en general se ensaya su actividad biológica, cualquiera que sea). También se suelen utilizar técnicas inmunoquímicas para detectar específicamente las proteínas de interés, ya que estas técnicas son muy sensibles Estas técnicas implican el uso de anticuerpos específicos, e incluyen el radioinmunoensayo, el ensayo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), etc. Con estos parámetros, se planifica una estrategia de purificación de la proteína buscada. La purificación se suele hacer por una secuencia de pasos de fraccionamiento, en cada uno de los cuales se suele sacar ventaja de las distintas propiedades fisicoquímicas de la proteína buscada. Generalmente es prioritario eliminar toda presencia de proteínas indeseadas, aunque sea a costa de perder rendimiento. A lo largo de la historia de la bioquímica se ha podido comprobar que preparaciones que se pensaba que eran puras, una vez que mejoran las técnicas de separación y análisis, resultan ser mezclas de moléculas muy semejantes. Por lo tanto, los criterios para decir que tenemos una proteína pura no pueden ser tomados como absolutos: se debe probar que sólo hay un componente con todos los métodos disponibles, aunque quepa la posibilidad de que algún otro componente no sea detectado. Las características de las proteínas que se consideran son la solubilidad, carga iónica, polaridad, tamaño molecular y especificidad de unión a otras moléculas biológicas. Basándose en estas características existen diferentes técnicas.

Un procedimiento típico pueden empezar por separaciones basadas en la solubilidad para continuar con la carga iónica, la polaridad y el tamaño molecular, terminando con la unión específica a moléculas biológicas. Técnicas de separación de aminoácidos y proteínas: Parámetros: Fuerza iónica (I) Solvente pH, T Basadas en su solubilidad Ultracentrifugación Exclusión molecular Afinidad Intercambio iónico Interacciones hidrofóbicas Cromatografía PAGE-SDS Isoelectroenfoque Electroforesis Espectrometría de masas Basadas en la solubilidad de las proteínas La presencia de grupos con distinta polaridad y carga en las proteínas hace que su solubilidad dependa de factores como la polaridad del solvente, el pH, la temperatura, y la presencia de sales disueltas. Efecto de la presencia de sales sobre la solubilidad de proteínas La concentración de sales se puede expresar en función de la fuerza iónica (I) I=1/2 ciZi 2 , donde c es la concentración molar de la especie iónica y Z es la carga de dicho ión. La solubilidad de las proteínas a baja fuerza iónica suele aumentar con la concentración salina (“salting in”), explicándose por la presencia de iones que rodean a los grupos cargados de las proteínas por atracción electrostática, incrementando la solubilidad al atraer más moléculas de agua de solvatación. A fuerzas iónicas elevadas, la solubilidad de las proteínas suele disminuir con la concentración salina (“salting out”), como resultado de la competencia que se establece entre los iones de la proteína y de la sal por el agua de solvatación (la actividad o concentración efectiva del agua disminuye). Este fenómeno es ampliamente utilizado en los primeros pasos de la purificación de una proteína, ya que el valor de I al que precipita una proteína dependerá de su composición en aminoácidos, si bien sólo permite la separación de grandes grupos de proteínas. En estos procesos se suele utilizar sulfato amónico como sal, debido a su elevada solubilidad, que permite alcanzar valores elevados de fuerza iónica. Efecto de la constante dieléctrica sobre la solubilidad de las proteínas Algunos solventes orgánicos como acetona y etanol son miscibles con el agua y provocan la precipitación de las proteínas debido a su baja constante dieléctrica (aumenta la fuerza electrostática que mantiene la unión de cargas de distinto signo y se disminuye la capacidad de solvatación por parte del agua). Esta técnica es conveniente utilizarla a bajas temperaturas (0- 4ºC) porque a temperaturas superiores

se produce la desnaturalización de las proteínas. El uso de solventes orgánicos en frío junto con sales mejora la precipitación por salado. Efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas El pH es otro factor a controlar porque las proteínas, debido a los grupos ionizables que poseen, tendrán carga eléctrica dependiendo del pH del medio. La actividad biológica depende del pH, ya que muchas de las uniones que realizan las proteínas necesitan un estado de ionización determinado (inmunoglobulinas o anticuerpos, enzimas, receptores, etc). Existe un valor de pH al que la proteína tiene el mismo número de cargas positivas que negativas, por lo que la carga neta es cero: es el punto isoeléctrico. En ese punto la solubilidad de la proteína es mínima: no puede sufrir el proceso de solubilización por salado (“salting in”) y primarían las interacciones electrostáticas que favorecen la agregación y precipitación de las proteínas. EFECTO DEL pH sobre la solubilidad Existe un mínimo de solubilidad de las proteínas cuando pH = pI Técnicas cromatográficas Los métodos más utilizados actualmente para la separación de aminoácidos se basan en las técnicas cromatográficas, técnicas también utilizadas para la purificación y análisis de otros compuestos como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, azúcares, etc. La cromatografía puede ser de muchos tipos, pero todas ellas se basan en el distinto reparto de las moléculas a separar entre dos fases: una fase móvil y otra estacionaria. Reservorio de fase móvil La fase móvil es una disolución de pH y composición controlados La fase estacionaria está unida a la matriz que hace de soporte inerte Mediante cromatografía se pueden separar muestras biológicas muy variadas: aminoácidos, proteínas, fármacos, lípidos,... En la cromatografía de reparto: las dos fases son inmiscibles y de distinta hidrofobicidad. En el equilibrio, dependiendo de la naturaleza del soluto y las fases, la concentración del soluto en cada fase es distinta. La relación de concentraciones del soluto en las fases en equilibrio se denomina coeficiente de reparto. La separación se consigue con un elevado número de etapas de reparto o distribución separadas, que suele tener lugar sobre gránulos microscópicos de una sustancia inerte, insoluble e hidratada (almidón, gel de sílice, diversos polímeros, etc.) empaquetada en una columna. Los procesos de reparto que tienen lugar en la superficie de cada gránulo no alcanzan necesariamente el equilibrio, pero el número total de etapas de reparto es tan grande que

los aminoácidos se desplazan a diferentes velocidades y el líquido que sale de la columna, el eluato, se recoge en fracciones y se analiza, bien por el ensayo de ninhidrina u otro, obteniéndose distintos picos que corresponden a los distintos aminoácidos; se determina la absorbancia después de realizar ciertas reacciones (Edman, etc) y se determina el tiempo de retención de cada aminoácido en la columna. El mismo principio se aplica a la cromatografía en papel, en la que el soporte es un papel derivado de la celulosa, que está hidratada. En este caso el avance no es por gravedad, sino por capilaridad (o capilaridad unida a gravedad si es descendente). Una vez desarrollada, se seca el papel y se pulveriza sobre el papel ninhidrina, calentándose. Para esta cromatografía se puede aumentar la resolución, desarrollando en dos dimensiones, con distintas fases móviles en cada dimensión. En la cromatografía en papel se determina el valor de Rf: distancia recorrida por su soluto/distancia recorrida por el solvente o fase móvil. Los valores de Rf son característicos para cada compuesto y cada fase móvil Actualmente es muy frecuente realizar esta cromatografía no sobre papel, sino en capa fina: se prepara ésta con gel de sílice, óxido de aluminio o tierra de diatomeas, extendido de forma homogénea sobre una placa, pero el principio es idéntico a la cromatrografía en papel. En la cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel se hace pasar la mezcla de proteínas por una columna de gel formado por unas microesferas porosas, cuyo tamaño de poro está controlado, de forma que deje pasar proteínas no superiores a cierto tamaño. Así, todas las proteínas mayores que este límite de exclusión pasarán por el gel sin penetrar en sus esferas, por lo que pasarán más deprisa que aquellas proteínas que, por su tamaño, puedan penetrar, con lo que recorrerán un camino más largo y sujeto a mayor resistencia. Entre las proteínas capaces de penetrar, aquellas más pequeñas tienen más probabilidad de entrar en poros, por lo que serán las más retenidas. Esta técnica, además, permite el cálculo del peso molecular de una proteína, al poderse comparar con una serie de patrones de peso molecular conocido. Los geles utilizados suelen ser de dextrano, agarosa o poliacrilamida. La cromatografía de intercambio iónico aprovecha la diferencia de cargas netas entre los distintos aminoácidos a cierto pH. En este caso la fase estacionaria está situada sobre una matriz sólida insoluble (resina sintética generalmente) a la que se ha unido grupos cargados. Si las cargas son negativas (carboximetil-, etc), se dice que es un intercambiador catiónico, porque retarda el flujo de cationes. Si la carga es positiva (dietil-aminoetil-, p. ej.), es un intercambiador aniónico. La carga de la resina puede depender del pH del tampón empleado para eluir la columna; la unión a la resina

será más fuerte para aquellos aminoácidos con carga neta de signo contrario a la resina. La cromatografía de afinidad es la más selectiva de las cromatografías y, por ello, la que proporciona un mayor grado de purificación, debido a que emplea alguna de las propiedades biológicas que puedan ser exclusivas de una proteína o de un pequeño grupo de ellas. Así, se puede utilizar un ligando, receptor, sustrato enzimático, o una inmunoglobulina (inmunoafinidad), etc que se une covalentemente a la matriz y se hace pasar por ella la mezcla de proteínas. Sólo aquéllas con afinidad por el ligando quedarán retenidas en la matriz, pudiéndose liberar de ella más tarde al cambiar las condiciones de pH o fuerza iónica. Debido a que los ligandos no suelen ser fáciles de conseguir, esta cromatografía se emplea en pequeños volúmenes, cuando la proteína está parcialmente purificada y concentrada. En muchos casos las separaciones cromatográficas comentadas anteriormente se hacen utilizando la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En HPLC el eluyente fluye a través de la columna conducido por aplicación de presiones hidrostáticas en el rango de 350-700 Kp/cm2 y como soporte cromatográfico se usan resinas de partículas muy finas y con gran resistencia mecánica. Estos procedimientos mejoran grandemente la resolución y permiten analizar muestras mucho más pequeñas. Una técnica para determinar la composición de aminoácidos de una proteína es la cromatografía de HPLC con el tratamiento con feniltioisocianato. Los feniltiocarbamilderivados se separan por HPLC en función de su hidrofobicidad en una columna de gel de sílice a la que se ha fijado grupos hidrocarbonados de pequeño tamaño (HPLC en fase reversa). La concentración y posición se determina espectrofotométricamente, aplicando la ley de LambertBeer A =  x C x l  = A/(C x l) M1cm-1, siendo la concentración proporcional al área de los picos. Se puede detectar hasta cerca de 1 pmol de aa. 5.2.3. Electroforesis Al ser las proteínas moléculas con carga o potencialmente cargadas, migran en un campo eléctrico. Esta posibilidad se emplea en la electroforesis y el isoelectroenfoque. La magnitud y velocidad de la migración dependerá de la carga y el tamaño (rozamiento) de las distintas proteínas. En las electroforesis se suele emplear un soporte sólido, como el papel o ciertos geles porosos. Ambos soportes se utilizan estando siempre empapados o sumergidos en una disolución salina que permita el paso de corriente eléctrica. La electroforesis en papel se emplea en la separación de aminoácidos. Para proteínas es más utilizada la electroforesis en geles , generalmente de poliacrilamida (PAGE). Las proteínas se separan en forma de

bandas, cuya anchura debe ser lo menor posible para poder resolver proteínas de tamaños parecidos. Las proteínas se separan según su tamaño Muestra de proteínas Dirección de migración En el isoelectroenfoque se utiliza un gradiente de pH en el gel de separación (creado mediante polianfolitos, una mezcla de moléculas con distintos puntos isoeléctricos conteniendo grupos carboxilo, que se distribuirán en el campo eléctrico, generando un gradiente de pH, ácido en el ánodo y básico en el cátodo; el gradiente de pH se mantiene por el poder tamponante de los polianfolitos). Al introducir una mezcla de proteínas en estas condiciones, las proteínas se desplazarán hasta alcanzar el valor de pH correspondiente a su punto isoeléctrico, momento en que pasan a tener carga neta cero y dejan de migrar). En muchas ocasiones es necesario cambiar la disolución en la que se encuentra la proteína, bien para su conservación o para un ulterior paso de purificación. Para ello se recurre a la diálisis. En esta técnica la disolución de proteínas se introduce en una especie de pequeño saco de celofán (o nitrocelulosa, o colodión), material poroso que permite el paso de moléculas pequeñas, pero no el de las proteínas en cuestión. Si este sistema se introduce en otra disolución de composición diferente y se facilita la difusión por una agitación suave, se acaba consiguiendo un equilibrio en el que la composición de la disolución interna y externa son iguales. Utilizando un volumen suficientemente grande de la disolución externa y renovando varias veces esta disolución, se puede conseguir la práctica desaparición de ciertas moléculas y la concentración adecuada de las nuevas. Diálisis Membrana porosa Ultracentrifugación Un último grupo de técnicas muy utilizadas en el trabajo con proteínas es la ultracentrifugación, que permite separar partículas o proteínas al someter la mezcla a campos centrífugos grandes (cientos de miles de veces superiores a la aceleración de la gravedad g) y se utiliza tanto para el aislamiento de la fuente inicial de proteína (orgánulos celulares, citosol, etc) como para el aislamiento de proteínas de una mezcla de ellas en ciertas condiciones, dependiendo de su tamaño y forma y para determinar su masa molecular. La ultracentrifugación se puede emplear tanto con fines analíticos (determinación del coeficiente de tamaño de proteínas) como con fines preparativos (aislamiento de proteínas para su posterior utilización o estudio). ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1- Selección del material de partida se tiene en cuenta la facilidad de obtención de cantidad suficiente de tejido también se considera una elevada concentración de la proteína de interés, que facilite su aislamiento y estabilización (las proteínas se desnaturalizan a bajas concentraciones por interacciones hidrofóbicas con superficies e interfases aire-agua, etc). Como material de partida es frecuente utilizar microorganismos o animales de experimentación que se puedan crecer y reproducir rápidamente En los últimos tiempos se utiliza también la clonación, como vía para expresar proteínas fuera de su sistema biológico original, en organismos procariotas de rápido crecimiento 2 - Extracción de las celulas, tejidos u orgánulos en los que se encuentra la proteína de interés Rotura del tejido, bien sea mecánicamente, por choque osmótico, etc Separación de orgánulos por centrifugación y ultracentrifugación 3- Solubilización de las proteínas: En proteínas globulares no hay problema, al ser solubles en soluciones acuosas. En proteínas de membrana o citoesqueleto, etc (insolubles, en general), se utiliza detergentes Control de pH y T: las proteínas se pueden desnaturalizar y/o precipitar dependiendo de los valores de estos parámtros Inhibición de proteasas (enzimas que hidrolizan proteínas): estas proteasas degradarían las proteínas que queremos aislar. Se inhiben con quelantes de iones divalentes (Ca, Mg), trabajando a temperaturas bajas (4ºC), y utilizando inhibidores específicos de cada una o de cada grupo de ellas. Evitación del crecimiento microbiano que pueda degradar nuestras proteínas o contaminarlas con la presencia de proteínas de dichos microorganismos. 4 - Purificación de la proteína mediante distintas técnicas, de elección según el caso particular Separación por carga: cromatografía de intercambio iónico electroforesis isoelectroenfoque Separación por polaridad: cromatografía de reparto. Separación por tama...