TEMA 11. MULTIPLICACIÓN DE LOS VIRUS PDF

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Apuntes completos de Microbiología. Profesores: V. Jiménez Cid, M. Molina Martín y C. Gil García....

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TE TEMA MA 111. 1. M MU ULTI LTIPLI PLI PLICA CA CACIÓ CIÓ CIÓN N DE LO LOSS V VIR IR IRU US DIVE DIVERS RS RSIDAD IDAD DE LO LOSS V VIRUS IRUS Los virus son una parte importante de la biomasa. A lo largo de toda la escala filogenética, todos los organismos van a padecer infecciones virales y los virus van a ser específicos para cada una de las especies. Sin contar con los más numerosos que son los que afectan a los seres también más numerosos, es decir, a bacterias y arqueas, tendríamos 1.740.330 especies de virus. La biomasa de virus es de aproximadamente 3.000.000 de partículas virales por mL de agua.

VIRO VIROM MA El viroma es el conjunto de virus de un (eco)sistema biológico en su globalidad. Por ejemplo, el “viroma humano” comprende: • Los virus que infectan a nuestras células. • Los elementos víricos integrados en nuestros genomas. • Los virus que infectan a otros microorganismos que integran nuestro microbioma. El viroma, por tanto, es parte del microbioma. El viroma es algo que evoluciona rápidamente y además, es una de las vías de intercambio de material genético entre organismos, como por ejemplo las bacterias.

BAC BACTER TER TERIÓF IÓF IÓFAGO AGO AGOSS Los bacteriófagos o fagos son virus de procariotas en general. Los clásicos tenían la simetría compleja que mencionamos con la cabeza icosaédrica y la cola helicoidal. Los bacteriófagos son interesantes para nosotros por diferentes razones: • Posible utilidad terapéutica en la lucha contra bacterias. En la actualidad se está intentando llevar a cabo, pero aún no se ha desarrollado. • Importantes herramientas en Biología Molecular y Biotecnología. • Algunos confieren propiedades a las bacterias que les alojan: • Toxina diftérica. La bacteria que causa la difteria en sí no causa la enfermedad, sino que es su fago el que codifica para la toxina diftérica. • Toxina eritrogénica. • Toxina colérica. • Toxina botulínica. Clasificación de fagos: • Por material genético: DNA, RNA, ds, ss, lineal, circular. • Por la morfología:

• Filamentosos: m13, Pf1. • Complejos: T4, λ. Fago con ccíclo íclo lític lítico: o: T4 d de e E.co E.colili Tiene un cabeza de geometría icosaédrica, un cuello con unas pequeñas fibras y una cola retráctil sólida por dentro y recubierta por una vaina contráctil. Al final tiene la placa basal. El reconocimiento bacteriano se lleva a cabo en las fibras y en las espículas de la placa basal. Entre los ciclos de los fagos distinguimos el ciclo lítico y el ciclo lisogénico. En el ciclo lítico, el virus va a reconocer gracias a los receptores de sus espículas a la célula e inyecta su genoma. Este genoma se expresa, es decir, una vez en el interior de la célula produce las proteínas necesarias para su replicación. De esta manera, se ensambla en el interior de la célula y destruye el genoma. El virus va a cambiar toda la biología celular de la bacteria favoreciendo la replicación del virus ensamblando en el interior partículas virales. Al final del ciclo replicativo, por fenómenos físicos, se produce la lisis y la liberación de las partículas virales que son idénticas a la inicial e irán a por otras bacterias. Etapas del ciclo: 1. Adsorción: Fijación, reconocimiento e interacción molecular entre las proteínas de las espículas del virus y los receptores de la superficie de las bacterias. 2. Penetración del ácido nucleico en la célula hospedadora. Las bacterias presentan mecanismos de defensa frente a estos fagos. Las bacterias van a presentar enzimas de restricción (endonucleasas) que se encargan de cortar los DNA extraños por palíndromes. Es un sistema de restricción-modificación, ya que la bacteria metila su genoma correspondiente a las dianas de restricción para que las enzimas de restricción no destruyan su propio genoma. Hay virus que traen sus DNA con bases modificadas genéticamente, es decir, hidroximetilado para evitar que las enzimas de restricción puedan destruir su genoma. El sistema de los CRISPR/cas de las bacterias consiste en expresar en zonas de su genoma trozos de secuencias de virus que la han ido infectando pero al revés para interferir con el genoma del propio virus generar enzimas de restricción que ataquen al genoma del virus. Este sistema modificado se puede utilizar para editar células madre, hongos, levaduras de interés industrial, etc. 3. Síntesis de proteínas y replicación del virus. El virus debe adaptar su naturaleza a la biología molecular del hospedador para : a. Expresar sus genes –mRNA (+)- y producir sus proteínas. b. Replicarse (especies de ácidos nucleicos “raras” requieren enzimas propias). Los primeros genes que se expresan son los genes tempranos y después se expresan los genes tardíos que expresarán las proteínas de la cápside. Si el virus que entra en la célula es RNA, debe producir sus propias enzimas replicativas y sus propias transcriptasas para producir el mensajero. 4. Ensamblaje de partículas víricas (maduración). En esta fase se producen las proteínas estructurales. En primer lugar se ensambla una especie de andamiaje, es decir, proteínas en torno a las cuales se ensamblan los capsómeros formando la cápside icosaédrica. Después, el andamiaje se hidroliza y la cápside queda hueca. Siempre hay un poro en la cápside donde se

ensambla una proteína llamada temrinasa que es la responsable de introducir una copia del genoma viral. La terminasa reconoce determinados sitios en el genoma e introduce una copia de esos fragmentos concatenados en cada una de las cápsides. En el caso de los virus de simetría helicoidal, el ensamblaje es más sencillo, se van disponiendo los protómeros en forma de escalera de caracol alrededor del ácido nucleico interno. 5. Liberación de virus por lisis. Los propios fagos, dentro de su genoma, codifican enzimas líticas como la lisozima fágica y la holina, que van a destruir la pared celular para provocar la lisis. A veces es lisozima. Estas enzimas son proteínas tardías.

En el caso del fago filamentoso M13 no tiene estructuras para inyectar el genoma y sus receptores serán puntos débiles de las bacterias con los que pueden interactuar como los pelos o fimbrias. El fago M13 introduce DNA de cadena sencilla, por lo que lo primero que hace es duplicar su cadena y generar un DNA de cadena doble. En este momento, este DNA de doble cadena sería un plásmido. Se van a producir muchas copias de este DNA, por lo que producirá muchas partículas virales que se ensamblarán e irán saliendo de la célula muchas veces sin necesidad de lisarla.

Fagos ccon on cciclo iclo lis lisogé ogé ogénic nic nico: o: FFago ago λ Estos virus se llaman lisófagos o atemperados. No dan lugar a una lisis inmediata de las bacterias sino que quedan atemperados durante un tiempo. Dentro del cromosoma bacteriano, se llamará profago. El hecho de que un virus esté integrado en el genoma de la bacteria durante un tiempo determinado sin expresarse, conlleva su perpetuación en la división de las bacterias. Así, las bacterias descendientes tendrán en un genoma este profago. Cuando un profago está incluido en una célula, le confiere una serie de características fenotípicas:

• Inmunidad a la superinfección por ese mismo tipo de virus. Cambia propiedades de la superficie de la célula para que no sea reconocida por el mismo tipo de virus. • Fenómeno de conversión fágica: provocan alteraciones en el hospedador: • En la superficie (fago ε de Salmonella). • En la patogenicidad del hospedador (ej. Toxinas codificadas por el profago, fago β de Corynebacterium diphteriae). La diferencia entre el ciclo lisogénico y el lítico es que el genoma viral se queda silente en el genoma bacteriano durante generaciones hasta que en un momento dado se activa y da lugar a un ciclo lítico. El paso de ciclo lisogénico a ciclo lítico se denomina inducción del profago. Es decir, la escisión de ese genoma viral, su liberación y el comienzo del ciclo lítico. La decisión de pasar a un ciclo lítico va a depender de señales medioambientales. Si no hay estrés bacteriano, el fago se quedará de forma latente en el genoma bacteriano, pero si las condiciones medioambientales son adversas y la bacteria está sometida a estrés, el virus procederá a la lisis de la célula. En una zona del genoma del fago existe un elemento regulatorio que contiene 2 factores correspondientes a la expresión génica: Cro y CI, que son factores de transcripción inhibitorios. Cro inhibe todos los genes necesarios para llevar a cabo un ciclo lítico y CI los genes necesarios para un ciclo lisogénico. Además, se inhiben el uno al otro, de manera que si predomina uno se favorece un tipo de ciclo u otro.

CUL CULTIVO TIVO Y REC RECUE UE UENTO NTO DE FFAGO AGO AGOSS En una placa Petri, cuando se siembran millones de células bacterianas susceptibles a una infección vírica, y después se añaden los virus, vamos a obtener “calvas” en un césped bacteriano o unidades formadores de “placas”. Así, contando esas “calvas” podemos saber cuántos virus por unidad de volumen de muestra problema. La titulación de fagos, por tanto, se realiza en UFP/mL.

CUR CURVA VA DE M MULTIP ULTIP ULTIPLIC LIC LICACIÓ ACIÓ ACIÓN N DE LO LOSS VIRU VIRUSS Esta curva representa el número de partículas virales a lo largo del tiempo. A tiempo 0, se pone en contacto el virus con el cultivo de bacterias y cada cierto tiempo se recoge una alícuota de la mezcla. Hasta un tiempo de 10-20 minutos, no sucede nada, es decir, hay un periodo de eclipse cuya explicación es que aún no se están ensamblando ni liberando partículas virales, por lo que tendremos aún tantos virus como hayamos añadido al principio e incluso habremos perdido algunos ya que pierden su genoma. Hasta que no se produce la fase de explosión o liberación en la que culmina el ciclo lítico, las células infectadas se rompen a la vez y aparecen miles de partículas virales.

Si lisamos las bacterias antes de este momento y obtenemos partículas virales, el ciclo se encontraba en fase de latencia. La curva de multiplicación del virus nos indica cómo se rápido se multiplica el virus y cuántos viriones más o menos se producen en cada ronda del ciclo lítico.

INFE INFECCIÓ CCIÓ CCIÓN N VIR VIRAL AL D DE E LAS C CÉLUL ÉLUL ÉLULAS AS AN ANIMAL IMAL IMALES ES 1. Adhesión o fijación. Consiste en el reconocimiento de receptores de superficie. Se produce la interacción específica entre fibras o espículas del virus y los receptores de la célula animal (tropismo=especificidad).

2. Penetración (endocitosis, fusión). Al contrario de los virus bacteriófagos aquí penetra todo el virus, incluida la cápside. Los virus desnudos entran por endocitosis, por un proceso que se denomina endocitosis mediada por receptor. Si los virus son envueltos, pueden fusionar su envoltura viral con la membrana plasmática de la célula hospedadora. Esto hace que se libere la cápside al interior del citoplasma. Entre los virus desnudos más importantes se encuentran Adenoviridae y Papillomaviridae. Los virus envueltos también pueden penetrar por endocitosis, donde el mecanismo es igual que en un virus desnudo, solo que obtendremos una vesícula con la cápside envuelta, habiendo una doble membrana. 3. Liberación del material genético (decapsidación). La decapsidación se produce en función de cómo haya entrado el virus en la célula. Por ejemplo, los virus desnudos, que entran por endocitosis, una vez en la vesícula endocítica, de alguna manera la rompen, la nucleocápside se abre y liberará el ácido nucleico que migrará hacia el núcleo. Hay una excepción, los Poliovirus, que tienen un poro por el que insertan el genoma viral al interior de la célula. Lo hacen desde una vesícula endocítica. Los virus envueltos, que entran por fusión, simplemente se deshacen gracias a un debilitamiento de los enlaces entre los capsómeros y liberan el ácido nucleico. Cuando un virus envuelto entra por endocitosis, fusionan la envoltura con la vesícula endocítica, de manera que la cápside viral sale limpiamente al citoplasma y libera su ácido nucleico de la misma manera que los virus envueltos que entran por fusión. 4. Síntesis de proteínas tempranas. Transcripción de los genes virales y su traducción a proteínas. Estos genes se expresan antes. Las proteínas que aquí se generan serán sobre todo maquinaria replicativa. Después se producen los capsómeros y espículas. Esto suele ir acompañado de una serie de daños colaterales a la célula hospedadora. 5. Síntesis de nuevos materiales genéticos. Replicación del genoma viral. Suele suceder en el núcleo de la célula hospedadora, a excepción de Poxvirus (citoplasma), Hepadnavirus y Retrovirus (post-encapsidación).

6. Síntesis de proteínas tardías. 7. Ensamblaje y maduración. Normalmente se utilizan compartimentos de la célula para ensamblar las partículas. Un virus desnudo no tiene más que ensamblarse. Las espículas de un virus envuelto no van a ir a la cápside sino que van a ser secretadas a la membrana plasmática para que cuando salgan se las lleven por gemación. Las factorías de virus son los distintos sitios de la célula donde se pueden ensamblar los virus. Lo más normal es que lo hagan en el citoplasma o asociados a vesículas. Los que se ensamblan en el citoplasma reciben el nombre de esférulas o tubos si lo hacen dentro de compartimentos membranosos, viroplasmas si lo hacen en los Corpúsculos de Guarnieri, e incluso hay otros virus que se ensamblan en vesículas con membrana doble. Los que se ensamblan en el núcleo lo suelen hacer en el interior de compartimentos replicativos (Ej: Herpesvirus). 8. Liberación de nuevos virus: lisis celular y salida por exocitosis. Se liberan unos 10.000-50.000 virus por célula. La liberación se puede producir por lisis celular mediante la producción de viroporinas que permeabilizan la membrana de la célula infectada para romperla y poder liberarse. Lo que hacen los virus envueltos es salir por gemación. Existe otro fenómeno de salida que es la exocitosis y lo realizan virus con doble membrana que salen envueltos en una vesícula exocítica. Ni la gemación ni la exocitosis producen la lisis de la célula.

CLA CLASIF SIF SIFICAC ICAC ICACIÓN IÓN DE BAL BALTIMOR TIMOR TIMORE E Baltimore clasificó a los virus según la naturaleza de su ácido nucleico. • Grupo I: virus cuyo genoma es DNA de doble cadena. Una vez que entran en el núcleo de la célula a la que infectan, con sus propios enzimas o los que le piratean a la célula, son capaces de transcribirse a mensajeros y estos ser traducidos a proteínas. Ej: Herpesvirus, Poxvirus, Adenovirus. • Grupo II: virus que encapsidan DNA de cadena sencilla. El único género que afecta a humanos es Parvovirus. Una vez desencapsidados tienen que convertir su DNA de cadena sencilla en DNA de cadena doble mediante una polimerasa y después expresan sus genes sin problema. • Grupo III: Virus que empaquetan RNA de doble cadena. Estos virus, para expresar sus genes, tienen que generar su propia maquinaria ya que su transcriptasa no va a ser una transcriptasa con actividad RNA polimerasa DNA dependiente, sino que es una RNA polimerasa RNA dependiente. Es una transcriptasa vírica que no existe en nuestras células. • Grupo IV: Virus que empaquetan RNA de polaridad positiva. Ej: Picornavirus, Coronavirus, Togavirus, Flavivirus. Estos virus, cuando se desencapsidan, tienen un genoma libre de RNA de polaridad positiva. Su genoma ya es un mensajero que podría saltarse la transcripción, pero esto no es eficiente. Por eso, primero utilizan su genoma para generar una copia del sentido antiparalelo y complementaria, que va a ser el molde para producir los mensajeros, con una RNA polimerasa RNA dependiente. Este molde sirve tanto para expresar sus genes como para generar copias de sus genes. • Grupo V: Virus que encapsidan RNA de polaridad negativa. Ej: Osthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridao, Filoviridae. Su genoma ya es un molde para producir el

mensajero con una RNA polimerasa RNA dependiente. De nuevo, este RNA de polaridad positiva, sirve tanto para expresar sus genes como para realizar copias de los mismos. • Grupo VI: Virus con RNA de cadena simple. Ej: Retrovirus. Son virus que expresan la reverso transcriptasa. Esta transcriptasa inversa permite la transcripción de RNA a DNA. Se retrotranscribe el RNA en un DNA de doble cadena. A partir de este DNA generan el mensajero de RNA de polaridad positiva para expresar sus genes, siguiendo el dogma de la biología. Son tan eficaces como los virus del grupo I. • Grupo VII: Virus con genoma de DNA y con transcriptasa reversa. Ej: Hepadnaviridae, virus de la hepatitis B. El genoma viral cuando es desencapsidado en el hepatocito se expresa en mensajeros. En lugar de utilizar todo el mensajero en producir proteínas, utiliza una parte como sustrato de la reverso transcriptasa para generar DNA viral que es el que se va a encapsidar.

REP REPLICA LICA LICACIÓ CIÓ CIÓN N En todos los virus RNA, vamos a asumir que su forma replicativa va a ser RNA de doble cadena. En el caso de los virus DNA, asumimos que su forma replicativa es DNA de doble cadena.

Rep Replicac licac licación ión d de e los re retro tro troviru viru viruss Son capaces de pasar su RNA de polaridad positiva a DNA de doble cadena mediante la transcriptasa inversa. Este DNA de doble cadena podrá transcribirse a mRNA y esta traducirse a proteínas. La transcriptasa inversa es una enzima multitarea: es capaz de realizar 3 reacciones. En primer lugar, la transcriptasa inversa copia el RNA a DNA. Por lo tanto, hay un momento en el que hay un dúplex de cadena de RNA+/DNA-. En segundo lugar, la propia enzima tiene acciones de ribonucleasa H pasando de la cadena dúplex a cadena de DNA- sencilla. En tercer lugar tiene actividad de DNA polimerasa convirtiendo el DNA de cadena sencilla en DNA de cadena doble.

INFE INFECCIÓ CCIÓ CCIÓN N VÍR VÍRICA: ICA: ABO ABORTIV RTIV RTIVA A O PRO PRODUCT DUCT DUCTIVA IVA Un virus, cuando infecta a una célula animal, puede tener diversos efectos. Podemos decir que una infección vírica puede ser abortiva, es decir, que no se produce porque no hay compatibilidad entre el virus y las células que queremos infectar. Cuando se produce una infección de verdad hablamos de infección productiva, que da lugar a un ciclo completo y a la producción de miles de viriones. Los virus que producen las infecciones líticas son los que causan infecciones agudas como la gripe. Hay otros virus que infectan una célula y no la matan necesariamente sino que pueden estar toda la vida dentro de esa célula liberando partículas virales. A este fenómeno se le denomina persistencia vírica y es la capacidad de un virus de producir una infección crónica. Este es el caso de las hepatitis B y C. Existe un tercer escenario en el cual los virus pueden estar en la célula pero de manera latente o críptica, es decir, penetran en la célula pero no se multiplican. Muy común en la familia Herpesviridae. La infección latente se suele producir en células que no son permisivas para la infección del virus. Cuando una célula diana u hospedadora no puede ser infectada por el virus, se dice que es no permisiva para ese virus. En algunos casos, cuando una infección por virus lítico resuelve, algunos

virus migran a las células neuronales y no se reproducen en ellas sino que quedan en ellas de manera latente. En un momento dado, se reactiva el virus y migra desde el núcleo de la neurona y a través de los axones hasta las células epiteliales y vuelve a causar la infección. A este fenómeno se le denomina recurrencia.

VIRU VIRUSS ONC ONCOG OG OGÉNIC ÉNIC ÉNICOS OS Hay virus capaces de llevar a cabo una transformación celular, es decir, la transformación de una célula normal en una célula tumoral. • Cáncer de cérvix: es causado por el virus del papiloma humano HPV-16/18 (Alphapapillomavirus) y virus del herpes simplex-2-HSV-2 (Simplexvirus). • Carcinomas hepáticos: son una complicación de las hepatitis ya que una infección mantenida y persistente produce una inflamación. La hepatitis está producida por los virus de la hepatitis B (HBV) (Orthohepadnavirus) y virus de la hepatitis C (HCV) (Hepacivirus). • Leucemia de células T en adultos: producida por HTLV-1 (Deltaretrovirus). • Tumores de tejidos blandos: El linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo son producidos por el virus de Epst...