TEMA 13. ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO PDF

Preview

Summary

Download TEMA 13. ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO PDF

Description

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO La fotoabsorción produce la capacidad de captar luz para generar ATP y NADP, que pueden ser utilizados para: ∞ Reducir CO 2 y producir fotoasimilados. ∞ Asimilación fotosintética de nitratos y sulfatos. Asimilación del nitrógeno Existen dos procesos para obtener nitrógeno orgánico: ∞ Fijación biológica de nitrógeno atmosférico. ∞ Absorción y asimilación del nitrato (NO3 -). El nitrógeno en la naturaleza se encuentra distribuido en tres reservorios: ∞ La atmósfera. ∞ El suelo. ∞ La biomasa. Las complejas reacciones de intercambio entre estos tres reservorios se conoce como el ciclo del Nitrógeno. Fijación biológica de nitrógeno atmosférico El nitrógeno atmosférico se vuelve útil por procesos naturales no biológicos: ∞ El nitrógeno se encuentra en forma de N 2 (78%) en la atmósfera. Esta molécula es extremadamente estable por la presencia de un triple enlace, que ha de romperse (879 Kj) para que reaccione. Esta capacidad en los seres vivos descansa únicamente en procariotas caracterizados por la presencia de la enzima nitrógeno reductasa. La actividad nitrogenasa requiere: → NADPH. → ATP. → Atmósfera microaerobia (bajas concentraciones de O2). ∞ Los productos que se obtienen son formas aminadas. ∞ Las tormentas (con la energía de los rayos) son capaces de formar ácido nítrico que se deposita en forma de nitratos en el suelo. ∞ Reacciones fotoquímicas. ∞ Fijación mediante planta-microorganismo y organismo. Todo procariotas. ∞ Los humanos somos capaces de coger el nitrógeno molecular y formar amonio con un consumo enrome de energía. Las plantas tienen una competición brutal del nitrógeno entre ellas y otros organismos. La energía que se necesita para convertir el nitrógeno en un compuesto utilizable por las plantas es muy grande.

1

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

¿Cómo obtienen las plantas el nitrógeno? ∞ Por absorción del suelo en forma de nitratos y amonio. Cuando se lleva a cabo una fertilización del suelo y existen altas concentraciones tanto de amonio como de nitratos, éstos son absorbidos por las raíces a veces excediendo la capacidad que tiene la planta de asimilación de estos iones, en estos casos se acumulan en los tejidos de las plantas. ∞ Por reducción del nitrógeno atmosférico, mediante el establecimiento de simbiosis con bacterias capaces de realizar la fijación biológica del nitrógeno. Absorción del nitrato La cinética de absorción es bifásica, en función de la concentración del sustrato en el suelo: 1. [nitrato]1 mM. La absorción tiene lugar mediante canales específicos de nitrato, que son constitutivos. Es un proceso simporte, que requiere ATP de origen respiratorio. Las plantas toman de dos maneras el nitrógeno inorgánico: en forma de amonio o en forma de nitrato: Por lo general, el nitrato en las plantas no tiene efecto nocivo, pero en los animales sí. El amonio (NH 4 +) es tóxico tanto en animales como en plantas, es decir, es un fuerte tóxico celular, por lo que la reducción de compuestos nitrogenados requiere que los productos se fijen en esqueletos carbonados (que provienen de la fotosíntesis). Si el ión NH4 + está en el citoplasma (donde hay un pH alto) se combina con los OH- dando lugar a agua y amoniaco. La membrana es permeable al amoniaco y puede salir al espacio intermembrana que tiene un pH bajo con alto contenido en H+. El amoniaco se combina con los H+ para dar lugar otra vez al ión NH 4+. Tanto la concentración de iones OH- como de H+ se ve afectada y se disipa por tanto el gradiente de pH. Cuando aumenta mucho la composición del amonio es tóxico. Para evitarlo las plantas mantienen esta concentración muy baja. Los transportadores son de tipo simporte con protones. Asimilación del nitrato Las plantas asimilan la mayoría del nitrato absorbido por las raíces en forma de compuestos orgánicos. Para que tenga lugar la asimilación, ocurre una fase de reducción, que puede tener lugar en la raíz o en la hoja. Cuando la planta está en una etapa de crecimiento, el nitrato se emplea fundamentalmente en la consolidación del sistema radicular (por lo que su reducción tiene lugar a nivel de raíz). De esta primera reducción se encarga la nitrato reductasa, que reduce por tanto el nitrato a nitrito (en el citoplama). Posteriormente, comienza a subir a nivel de hoja, donde la reducción tiene lugar durante la fotosíntesis.

2

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

La reducción tiene lugar en dos fases: NO 3 -

NO 2→ NRasa NAD(P)H → AD(P)+

→ NiRasa Fdred → Fdox + Mo

NH 4+

1. La nitrato reductasa (NRasa) se localiza en la cara citosólica del cloroplasto unida a la membrana cloroplástica (es decir, fuera del cloroplasto pero unida a él). Esta enzima puede funcionar a nivel de hoja o raíz (donde no hay cloroplastos, pero sí plastidios). La diferencia radica en el poder reductor que se va a utilizar: en hoja es NADPH que proviene del cloroplasto y en la raíz es NADH, de origen mitocondrial. La enzima es un homodímero, (dos subunidades idénticas de 100 KDa). Cada subunidad contiene tres grupos prostéticos: FAD (dinucleótido de flavina y adenina) un grupo hemo y un complejo de Mo. El Mo se encuentra unido a la enzima mediante un agente quelante de dicho metal. La nitrato reductasa es la enzima principal que contiene Mo en tejidos vegetativos, un síntoma de la falta de Mo es la acumulación de nitrato.

2. La nitrito reductasa (NiRasa) reduce el nitrito a amonio. La célula de la planta rápidamente transporta el nitrito generado tras la reducción del nitrato desde el citoplasma hacia los cloroplastos en las hojas y hacia los plastos en las raíces. En estos orgánulos la nitrito reductasa reduce el nitrito a amonio, transfiriendo electrones desde la ferredoxina al nitrito de acuerdo con la siguiente reacción: NO2 - + 6 Fdred + 8 H+ NH4 + + 6 Fdox + 2 H 2 O El poder reductor se obtiene de la cadena de transporte electrónico que ocurre en el cloroplasto durante la fotosíntesis o el NADPH generado en el ciclo oxidativo de las pentosas fosfato en tejidos no fotosintéticos a partir de la ferredoxina-NADPH oxido-reductasa (extramitocondrial). La nitrito reductasa, es un polipéptido sencillo que contiene dos grupos prostéticos: uno estructurado por hierro y azufre (Fe 4 S 4 ) y un grupo hemo.

3

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

La reducción del nitrato y nitrito está sometida a procesos de regulación: 1. El nitrato es el gran regulador, ya que su presencia induce la síntesis de enzimas. Tanto la nitrato reductasa como la nitrito reductasa son enzimas inducibles por presencia de sustrato. 2. La síntesis de la proteína transportadora de nitrato dentro de la célula (permeasas o canales, en función de la concentración) se inhibe por el propio producto final (productos aminados). El producto final también inhibe la actividad enzimática. Relación C/N≈20 en plantas. Regulación de la nitrito reductasa La luz, los niveles de carbohidratos y otros factores ambientales inducen una fosfatasa que defosforila un residuo de serina. De esta manera se activa la enzima. Por el contrario, la oscuridad y la alta concentración de Mg2+ inducen una kinasa que fosforila el mismo residuo de serina, inactivando la enzima. La nitrito reductasa se transcribe en el núcleo celular llevando una secuencia codificante de un péptido señal en la zona amino terminal. Este péptido señal es típico de los que penetran en el interior de los plastos. Las altas concentraciones del ión nitrato y la luz inducen la transcripción de este gen. Asimil ación del amonio Las plantas obvian la toxicidad del ión amonio transformándolo con mucha rapidez. Convierten el amonio generado tras la asimilación del nitrato o la fotorrespiración en aminoácidos. La primera ruta de esta conversión se debe a la acción secuencial de la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa.

La GS (glutamina sintetasa) es una enzima muy buena (Km NH4 = 3-5 µM) con distintas isoformas, fundamentalmente en hoja (GS 1 y GS 2 ) y nódulo (GS n1 y GS n2 ). Forman dímeros que se sintetizan a partir de 4 genes, que se combinan entre ellos en función de que se trate de plantas fijadoras de nitrógeno o no. ∞ GS 1 aparece en cotiledones nuevos, es la forma cloroplástica. Esta glutamina sintetasa transforma el amonio que se produce en las hojas debido a la fotorrespiración y en la asimilación del amonio primario que llega hasta los tejidos fotosintéticos. ∞ GS 2 se encuentra en cotiledones senescentes, es la forma citosólica. Las formas citosólicas producen glutamina para ser transportada. Se expresan durante la germinación de la semilla y más tarde en los tejidos vasculares tanto de la raíz como del tallo. 4

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

∞ GS n1 y GS n2 solo aparecen en plantas fijadoras de nitrógeno. ∞ La glutamina sintetasa de los plastos de la raíz se expresa para consumo local del amonio que se absorbe a través de la raíz. Los niveles de carbohidratos y la luz pueden alterar la expresión de la glutamina sintasa localizada en plastos pero tienen poca incidencia sobre la forma localizada en el citosol de células de tejidos vasculares. La GS ha de funcionar en cooperación con la enzima GOGAT, que puede aparecer en tejidos verdes (cloroplasto) en forma de ferredoxina-GOGAT o en tejidos no fotosintéticos (nódulos, raíz, tejidos etiolados, etc.) en forma de NADH-GOGAT (mitocondria). Esta enzima en nódulo tiene la particularidad de ser muy activa en situaciones de fijación de N 2 . Cuando en los plastos se elevan los niveles de glutamina se induce la actividad de otra enzima (plastídica) que es la glutamato sintasa o GOGAT (glutamina 2-oxoglutarato aminotransferasa). Esta enzima transfiere el grupo amida de la glutamina al 2 oxoglutarato, dando lugar a dos moléculas de glutamato. Las plantas contienen dos tipos de GOGAT; una que acepta los electrones provenientes del NADH (tejidos no fotosintéticos) y otra que los acepta provenientes de la ferredoxina reducida (en el cloroplasto). Otra forma de asimilar el ión amonio se debe a la acción de la glutamato deshidrogenasa (GDH) que cataliza una reacción reversible que o bien sintetiza o bien desamina el glutamato. Esta reacción es la fotorrespiración. Mediante la cual se fija parte del NH 4 +, pero las concentraciones son altas y no es suficiente.

Ciclo GS/GOGAT Es claramente la ruta de fijación de NH4 + más importante. Permite drenar el metabolito altamente tóxico mediante sistemas enzimáticos acoplados que lo fijan en esqueletos carbonados El nitrato entra en la célula mediante simporte con protones. A través de la nitrato reductasa, se forma nitrito, que se transporta al cloroplasto. Ese nitrito, con la nitrito reductasa se forma amonio (se necesitan electrones). La GS incorpora el amonio a la glutamina. La glutamina se convierte en glutamato con gasto de poder reductor por la acción de la GOGAT y el glutamato vuelve hacia el citosol donde las formas citosólicas de la glutamina sintetasa lo vuelve a convertir en glutamina con ayuda de amonio para que la célula que produce aminoácidos los exporte. 5

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

Reacciones de transaminación y transferencia del nitrógeno asimilado Una vez que el nitrógeno ha sido asimilado a glutamina o glutámico, puede ser incorporado a otros aminoácidos mediante reacciones de transaminación. Las enzimas que catalizan este tipo de reacciones se denominan aminotransferasas que se encuentran en: citoplasma, cloroplastos, mitocondrias, glioxisomas y peroxisomas. Un ejemplo de estas enzimas es la aspartato amino transferasa (AAT), que pasa el glutamato a aspartato. Una vez obtenido el aspartato mediante acción de la asparagina sintetasa que requiere ATP (otra reacción de transaminación) se obtiene la asparagina. Fijación biológica del nitrógeno El N 2 lo fijan aquellos microorganismos que cuentan con el complejo enzimático nitrogenasa (capaz de reducir el N2 a NH 4 + en ausencia de O 2 ). El espectro de microorganismos diazotrofos o fijadores de N 2 es amplio y pueden encontrarse en cualquier hábitat. Fijadores en vida libre: ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞

Arqueobacterias. Anaerobios: (Clostridium en suelos, aguas dulces y marinas, sedimentos, tracto intestinal). Anaerobios facultativos: (Klebsiella en flora intestinal, suelos, aguas). Microaerobios: (Azospirillumen suelos generalmente asociados a las raíces de las plantas). Aerobios: (Azotobacteren suelos, aguas y superficies vegetales). Bacterias fotosintéticas: (Rhodospirillum y Chromatium, acuáticas-fijan N en anaerobiosis utilizando la energía de la fotosíntesis).

∞ Cianobacterias sin heterocistos: Fijan N en microaerobiosis o aerobiosis con separación temporal de la fijación y fotosíntesis (durante el día fotosintetizan y la nitrogenasa permanece inactiva; durante la noche, la respiración mantiene los niveles de oxígeno bajos y la nitrogenasa está activa). ∞ Cianobacterias con heterocistos: Fijan N en condiciones anaeróbicas y aeróbicas. La fijación de N debida a cianobacterias representa un tercio del total de la fijación biológica. Fijadores en simbiosis: ∞ Con leguminosas: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium… Que establecen simbiosis con las leguminosas de origen templado, tropical y subtropical. ∞ Con no leguminosas: Frankiacon plantas actionorrícicas. ∞ Otras simbiosis: Nostoc formando líquenes… Simbiosis rhizobio/leguminosa Son las más conocidas e importantes desde una perspectiva agrícola-económica. Las establecen los géneros: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium. A diferencia de las cianobacterias y las bacterias del género Frankia, las rizobiáceas no pueden generar ambiente anaerobio para llevar a cabo la fijación de N por sí solas. Pero pueden llevar a cabo este proceso interactuando con la planta para finalmente desencadenar la formación de un órgano mixto como es el 6

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

nódulo simbiótico (entorno controlado con muy baja concentración de O 2 y con los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación). Fases de la interacción: 1. 2. 3. 4.

Señalización química entre planta y bacteria. Adhesión. Infección bacteriana, formación del canal e invasión. Inducción de morfogénesis en la planta. Diferenciación de la bacteria a bacteroide (forma bacteriana especializada en la fijación de nitrógeno).

1. Señalización Algunos flavonoides encontrados en los exudados de las plantas a concentración nanomolar provocan quimiotaxis activa de los rizobios hacia la superficie de la raíz. Estos mismos flavonoides, a concentración micromolar, activan en la bacteria los genes responsables de la nodulación (genes Nod). La presencia de estos factores es suficiente para que la planta produzca deformación de los pelos radiculares. Como efecto del factor Nod, entra Ca 2 + al citoplasma, originando la despolarización de la membrana del pelo radicular.

2. Adhesión La unión de las bacterias a la superficie de la raíz es preliminar a la invasión, las bacterias se multiplican ampliamente en la zona curvada del pelo. En esta zona y como respuesta a los factores Nod se degrada la pared celular y comienza la formación del canal de infección. Este canal es una extensión tubular de la membrana externa producida por la fusión de las vesículas del aparato de Golgi (C), y va alongándose a lo largo de la célula del pelo. Cuando el canal de infección alcanza el final de la célula del pelo radicular (D) se fusiona con la membrana de las células corticales circundantes invadiéndolas (E y F).

7

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

3. Introducción de la invasión celular en las células del córtex Las células de la planta comienzan a dividirse formando un área diferenciada que se denomina primorido del nódulo. Para la formación del nódulo se requiere la inducción de un nuevo meristemo en las células del córtex haciendo que las células ya quiescentes y diferenciadas vuelvan a reentrar en el ciclo celular.

4. Formación del simbiosoma Paralelamente al desarrollo del nódulo, los rizobios se van distribuyendo a través de canales de infección, o de la división de células previamente infectadas y sufren modificaciones que culminan en la formación del simbiosoma, con características esenciales para que se pueda realizar la actividad fijadora de N. La nitrogenasa Cataliza la reducción de dinitrógeno a amonio siguiendo la reacción: N 2 + 16 ATP + 8 H+ + 8 e-

2 NH 3 + H 2 + 16 ADP + 16 Pi.

Se necesita mucho ATP (16) para formar 2 moléculas de NH 3 La nitrogenasa tiene dos ferrosulfoproteínas: ∞ El componente II o dinitrogenasa reductasa ó Fe-proteína es un dímero que contiene cada uno un centro de 4Fe y 4S. ∞ El componente I (dinitrogenasa propiamente dicha), Fe-Mo proteína es un tetrámero que contiene 30 átomos de Fe, 30 átomos de S, 2 átomos de Mo y 1 átomo de C. 8 ferredoxinas bacterianas, ceden electrones al componente II y éste, gracias al uso de ATP magnesio, cede los electrones al compartimento I, que a su vez, lleva la cesión de 6 electrones para el amonio y 2 electrones para el N 2 . Ambas proteínas son extremadamente sensibles al O 2 y se inactivan de forma irreversible cuando se exponen al aire. La reacción catalizada por la nitrogenasa requiere: un donador de e- (potente reductor como la ferredoxina), ATP, Mg 2 + y una concentración muy baja de O 2 . Es un proceso de oxido/reducción. Procedencia de la Energía y Fuentes de Carbono para que los bacteroides fijen N 2 La energía necesaria para fijar nitrógeno proviene originariamente de la de la fase luminosa de la fotosíntesis. Y la fuente de carbono que utiliza el bacteroide son ácidos dicarboxílicos como el malato que proviene de la sacarosa que ha sido previamente transportada a los diferentes órganos a través del floema.

8

FISIOLOGÍA VEGETAL TEMA 13: ASIMILACIÓN DEL NITRÓGENO

La membrana del bacteroide es muy permeable al malato, que puede ser oxidado gracias al proceso respiratorio que se lleva a cabo en el bacteroide. La asimilación de NH 4 también se lleva a cabo en los nódulos El primer producto estable de la fijación del nitrógeno es el NH 4 +. Los bacterioides tienen poca actividad asimiladora de amonio y es excretado en un 95% al citoplasma de las células del nódulo donde se incorpora a compuestos carbonados gracias a la acción de la glutamina sintetasa. La glutamina también puede donar un grupo amida al aspartato para dar lugar a la asparagina mediante la asparagina sintetasaque requiere de ATP. El nitrógeno asimilado puede ser exportado al resto de la planta a través del xilema en forma de glutamina, asparagina o uréidos (alantoína, ácido alantóico, citrulina). La síntesis de uréidos se realiza a partir de las amidas glutamina y asparagina e implica la síntesis de novo de purinas y posterior oxidación para formar los uréidos. La concentración de O 2 ha de estar muy controlada Los bacteroides requieren O 2 para sintetizar ATP, necesario para los procesos biosintéticos y para la fijación de nitrógeno. Sin embargo el O 2 inactiva la nitrogenasa irreversiblemente. Los nódulos han de poseer mecanismos que mantengan las concentraciones de O2 muy bajas, pero constante en las células infectadas para permitir a la vez tasas elevadas de respiración y fijación de nitrógeno en los bacteroides. Una vez que parte del O 2 difunde hacia la zona central del nódulo, la leghemoglobina se encarga de captarlo (proteína sintetizada por la planta que capta el O 2 y mantiene la zona de nitrogenasa libre del mismo). Los bacteroides contienen también varias oxidasas terminales con diferente afinidad por el O 2 , lo que determina que la concentración de oxígeno regule el flujo de electrones de la cadena respiratoria. La función de estas oxidasas en la fijación de nitrógeno es: ∞ Permitir la síntesis de ATP (respiración eficiente) en condiciones de baja concentración de O 2 , estas oxidasas intervienen en la respiración. ∞ Elim...