Tema 2. Espectrometría de Masas PDF

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Tema 2. Espectrometría de Masas La espectrometría de masas es una técnica analítica mediante la cual los analitos de una muestra son ionizados, separados e identificados. La separación de los iones se produce por una aceleración al aplicar un campo eléctrico, de modo que cada ión se mueve a una velocidad determinada por su masa y carga. Así, se obtiene un espectro en el que se representa la intensidad de señal frente al cociente masa/carga. La mayoría de los espectros intentan mantener la carga en la unidad, de modo que los espectros representen la señal frente a la masa. Para poder conocer la estructura (secuenciar) y cuantificar las muestras, los analitos son fragmentados, de modo que en los espectros aparece la señal tanto del analito completo como de los distintos fragmentos en los que el analito puede dividirse. Así, cada uno de los fragmentos aparece en forma de “pico”, esto es, un número discreto de masa menor al de la molécula completa, y correspondiente a la resta de la parte de la molécula que se ha perdido. La espectrometría de masas es una técnica utilizada especialmente con biomoléculas como las proteínas, permitiendo realizar una secuenciación de éstas mediante la identificación de péptidos. Generalmente tiene lugar al final de la separación de analitos, combinándose con técnicas como la cromatografía en columna (cuya identificación por espectrofotometría UV-Vis no es tan fiable como la espectrometría) y la electroforesis bidimensional (en esta última hay que evitar tinciones con plata puesto que afecta gravemente a la sensibilidad del espectrómetro). Además, la espectrometría de masas permite mejorar la detección cromatográfica: en cromatografía, para cuantificar el analito se utiliza un patrón de modo que relacionando la cantidad de patrón con el pico se obtiene la cantidad de analito. Este método es poco fiable debido a la gran diversidad de moléculas que pueden existir en la muestra, donde el patrón puede constituir hasta un 30% de la cuantificación del pico. Al combinar la cromatografía con la espectrometría de masas se puede realizar una cuantificación exacta del patrón, permitiendo una cuantificación precisa del analito.

· Etapas: · Vaporización: Cómo llevar a cabo la conversión de moléculas grandes a gas y su posterior ionización fue el desarrollo clave y más complejo de la espectrometría de masas, lo

que otorgó el Nobel. Para pasar las especies a fase gas, se lleva a cabo una vaporización en un si sistema stema a alto vacío vacío, sometiendo la muestra a presiones inferiores a 10-6 torr. Otro método de vaporización es la vaporización térmic térmicaa, sólo aplicable a sustancias termoestables y de masa atómica menores a 1000, debido a que las sustancias son sometidas a un calentamiento hasta aproximadamente 500ºC. Existen otros dos métodos de vaporización e ionización más suave, focalizada en macromoléculas:  Electronebulización (ESI): permite la vaporización de sustancias solubles de masa mayor a 106 uma. En ella, la solución de un analito es vaporizada como un spray en presencia de un campo eléctrico sobre una atmósfera seca, lo que produce microgotas de disolvente cargadas eléctricamente, con moléculas de analito disuelto en ellas. El disolvente de las microgotas se evapora debido a su presión de vapor, y a su vez, las microgotas se fragmentan por repulsión culombiana. Ambas consecuencias provocan la desaparición del disolvente, dejando una suspensión del analito cargado. Debido a que cada microgota puede poseer distinta carga estadísticamente (depende de los procesos de fragmentación y evaporación), las moléculas de analito poseerán distinta carga, lo que genera que la gráfica de señal frente al cociente masa/carga posea una distribución gaussiana, sobre la que se puede hallar el peso molecular original de la proteína.

 Desorción/ionización por impacto (láser): permite la vaporización de sustancias no volátiles de masas mayores a 106 uma, incluyendo a átomos, iones o fotones. La técnica se basa en someter a la muestra a pulsos de láser durante un periodo corto de tiempo (10 ns o incluso 120 ps), de modo que se acaba provocando la desorción de las moléculas de analito de la matriz. Para

evitar alteraciones y roturas en las moléculas de analito, a la solución de analito se añaden cromóforos que forman una matriz que confina a los analitos, de modo que los pulsos láser se realizan sobre los cromóforos a su determinada longitud de onda, y al producirse la desorción de estos, se llevan consigo a las moléculas de analito. La desorción se produce debido al aumento de temperatura por el pulso de láser (desorción térmica), y el período corto de tiempo de pulsado permite que los analitos no se alteren al producirse rápidamente la disipación de energía. Los cromóforos tienen un carácter ácido que les permite unirse a los analitos, de modo que, cuando se separan de ellos, los cromóforos quedan cargados generalmente negativamente, y los analitos, positivamente, permitiendo que no sea necesaria una posterior ionización (ionización por transferencia protónica suave, que produce analitos intactos protonados).

Esta técnica es la utilizada en el MALDI-ToF ( Matrix-Assisted Layer Desorption Ionisation), que usa una matriz de cromóforos de carácter aromático, para facilitar la absorción de luz por el láser, y con grupos carboxílicos, que aportan el carácter ácido. MALDI se acopla al detector de iones por tiempo de vuelo (Time-of-flight). Lo más complejo de la técnica es organizar la matriz de cromóforos, lo que generalmente se suele llevar a cabo por ensayo y error, al desconocerse cómo organizarla manualmente. Al generarse una ionización por protonación, hay que tener en cuenta que la masa molecular de las especies siempre será varias unidades mayor, dependiendo del número de protones que haya aceptado. MALDI es especialmente adecuado para la caracterización de polímeros naturales o sintéticos, concretamente para aquellos polímeros cuya longitud varíe según las condiciones de los organismos que los sintetizan. Al no poder

ser estudiados por fragmentación (debido a que interesa conocer la longitud total del polímero), los polímeros son cationizados por metales (Pn-M+, donde M es un metal catiónico como Na, K o Ag), de modo que a partir del espectro de masas se puede hallar la longitud del polímero sabiendo qué metal se ha utilizado (la masa total registrada será la del polímero unido al metal). Es característico en este estudio obtener espectros con picos mayoritarios que se encuentran rodeados por numerosos picos menores. Estos picos menores se deben a la presencia de C13, debido a que el alto número de carbonos de cada polímero aumenta la probabilidad de que alguno sea un isótopo. De este modo, cada polímero tiene un “satélite de picos” en función de su número de carbonos, que determina la proporción en la que aparece C 13. Esta serie isotópica permite distinguir además compuestos de la misma relación m/z, debido a que a mayor masa, mayor serie isotópica, y, por tanto, menor separación entre los picos de la serie isotópica. · Ionización: Una vez vaporizadas, las moléculas de la muestra pasan por un ionizador que les aporta una determinada carga. Para ionizar los analitos existen dos técnicas de ionización:  Impacto electrónico: en esta técnica, las especies en fase gas se hacen fluir por una cortina de electrones que discurre perpendicularmente, y que están acelerados con alta energía, lo que fragmenta y carga a las moléculas. Un voltaje se aplica (de valores típicos 50-100 V) y los electrones se aceleran, de modo que cuando los analitos atraviesan la zona, por colisión con esos electrones, se fragmentan y quedan cargados normalmente positivamente. La ventaja de esta técnica es que afecta a todas las moléculas de la muestra, sin ser selectiva, por lo que cualquier macromolécula acaba siendo ionizada. Las desventajas son que puede provocar rupturas totales en las moléculas, observándose en el espectro final la carencia del pico de masa total debido a una reducción en el número de moléculas, y que puede inducir reacciones que alteren los analitos.  Ionización química: en ella se produce una transferencia de protones de una matriz al analito en fase gas (ej.: A + CH 5+  AH+ + CH4). Esta técnica es más suave, pudiendo generar fragmentación aunque no tan agresiva, pudiendo incluso dejar al analito intacto en condiciones favorables. Es específica de especies de carácter ácido/básico. Los ácidos de la matriz se producen por

impacto electrónico y reacciones secundarias de las especies producidas en dicho impacto (CH4 + e-  CH4+ + 2 e-; CH4+ + CH4  CH5+ + CH3). Esta técnica soluciona el problema del impacto electrónico de arriesgarse a no poseer el pico de la molécula completa, o que la fragmentación sea excesiva cuando, por ejemplo, se estudia la cantidad de producto de una reacción, y sin embargo, el pico del producto no es visible: ¿se ha fragmentado todo o no hay producto? Con ionización química se podría detectar. Sin embargo, el espectro de ionización química por sí solo no aporta más información, debido a que la fragmentación es mínima, y esa es la característica que permite identificar las moléculas. Hay que tener en cuenta que esta técnica aumenta la masa de los analitos en al menos una unidad, debido a la incorporación de H +. · Fragmentación: La fragmentación es una etapa opcional debido a que los analitos pueden ser fragmentados pasivamente en la vaporización y en la ionización, esto es, puede producirse una fragmentación desde la fuente de la que proceden por desorción o nebulización agresiva, aunque lo más común es fragmentar los analitos tras ser ionizados y acelerarlos, lo que permite ver la masa intacta. Las técnicas de fragmentación pueden ser todo lo agresivas que se deseen, y permiten realizar varios análisis de espectrometría de masas subsecuentes, esto es, la fragmentación de picos obtenidos en un espectro anterior, permitiendo ver en qué picos se divide (MS/MS/MS…). La técnica más común es la disociación in inducida ducida por col colisiones isiones (CID) , en la que los iones, tras pasar por un filtro cuadrupolar de selección de masa, son acelerados y se hacen pasar a través de una celda que posee un gas inerte como el helio, de tal manera que se producen colisiones de alta energía con el gas pero de reactividad nula que rompen los analitos en fragmentos iónicos que serán analizados en el detector de iones tras otra separación en un cuadrupolo. Las moléculas más frecuentemente fragmentadas son las biomoléculas: 

Fragmentación de péptidos: permite la obtención de aminoácidos, del esqueleto aminoacídico y de las cadenas laterales. Puesto que las masas de los aminoácidos son discretas, la caracterización es fácil y precisa, permitiendo

aplicar la espectrometría de masas a la proteómica para secuenciación e identificación de péptidos. Las posibles modificaciones post-traduccionales de proteínas se detectan por la generación de fragmentos típicos (fosforilaciones generan fragmentos a una determina distancia consistentes en la proteína no fosforilada, a 80 unidades menos, por lo que también se puede estudiar la proteína fosforilada y sin fosforilar y se observan las diferencias). La localización de la modificación también puede ser estudiada digiriendo la proteína con tripsina y obteniendo el espectro, para luego eliminar la modificación post-traduccional en dichos analitos (ej.: desfosforilación) y obtener otro espectro: comparando ambos se puede hallar qué fragmento ha disminuido en su masa un determinado número de unidades. El estudio de puentes disulfuro es similar, pero en este caso se estudia los fragmentos proteicos antes y después de ser reducidos, de modo que aquellos puentes intramoleculares generarán fragmentos de dos unidades mayor (adición de dos átomos de hidrógeno), y aquellos puentes intermoleculares generarán un pico nuevo (se pasa de un fragmento a dos fragmentos).  Fragmentación de oligosacáridos: es semejante a la peptídica debido a las masas discretas de los distintos monómeros de los oligosacáridos.  Fragmentación de DNA y RNA: generalmente se producen cadenas nucleotídicas y grupos fosfato. · Selección de analitos: Para la selección de analitos, se utiliza un anali analizador zador de iones que separa los analitos de distinta masa/carga. La selección de analitos se puede realizar mediante tres técnicas:  Analizador de iones por tiempo de vuelo: en él, los iones pasan por tres etapas: una primera etapa en la que se someten a un campo eléctrico constante constante, donde los analitos adquieren movilidad y comienzan a adquirir una velocidad de vuelo inversamente proporcional al cociente masa/carga (Ecinética = zE = mv2/2), y donde la energía cinética es igual para todos los iones; una segunda etapa en la que ya no hay campo eléctrico, la zona li libre bre

de campo (tubo de vuelo) en la que los analitos comienzan a retrasarse según la velocidad que habían adquirido al no estar ya sometidos al campo eléctrico (los analitos más ligeros llegarán antes, puesto que el t ) y una √ última etapa en la que se produce la detección de los analitos. De este modo, se obtiene una gráfica donde se recoge la seña obtenida (cantidad de analito) para cada tiempo. La ventaja de este método es que todos los iones llegan al detector, por lo que es útil cuando todos los analitos quieren ser medidos. Para la calibración del tiempo de vuelo, puesto que dependiendo del campo los analitos tardarán más o menos, se utilizan polímeros estándar como el poliestireno, donde para cada masa se recogen los distintos tiempos a los que se detecta la señal.  Analizador de iones de cuadrupolo eléctrico: este método permite seleccionar aquellos analitos que quieran ser detectados. Para ello, los iones pasan por un canal constituido de cuatro varillas por las que circula un campo eléctrico variable variable. Las varillas generan un campo eléctrico negativo y positivo dos a dos que cambia de polaridad a cada instante, de modo que las moléculas que circulen por el canal tenderán a ir en cada instante a un lado del canal, dando como resultado que permanezcan en el centro de éste. Debido a este cambio constante de polaridad en el campo eléctrico, sólo las moléculas de cociente m/z adecuado a dicho campo (previamente sintonizado) pasarán por el canal, perdiéndose el resto debido a su exceso o defecto de m/z. Como generalmente interesa el estudio de varias masas, el campo se va sintonizando para ir variando el filtro de m/z, de modo que al detector vayan llegando a distintos tiempos distintos analitos agrupados en la misma relación m/z. De este modo, los valores del potencial y del voltaje (aunque el cociente V/U es constante y en torno a 6) determinan la masa que atraviesa el filtro: las masas adecuadas oscilarán por el interior del canal hasta el detector, las masas excesivas se movilizarán fácilmente hacia uno de los lados del canal y permanecerá allí, retrasándose (poseen más inercia y responden peor al cambio de sentido) y las masas defectivas oscilarán demasiado de un lado a otro, retrasándose. Si el voltaje aumenta, se consigue que los iones más pesados acaben oscilando en el centro, pero esta modulación hace que iones de inferior tamaño oscilen excesivamente. Por otra parte, disminuciones en el voltaje provoca que los iones pequeños oscilen en el centro, pero que los iones mayores se pierdan.

Este método tiene una limitación de masa, no pudiendo utilizarse para masas mayores a 10000 g/mol, al contrario que el tiempo de vuelo, que no posee limitación de masa.  Separación por movilidad iónica: semejante a la CID, pero en este caso los iones de igual masa o masa similar son acelerados suavemente hacia la celda de interacción con el gas de fondo (helio o N2), donde se producen colisiones de baja energía de los analitos con dicho gas que no provoca fragmentaciones. Los iones de mayor tamaño colisionarán más y se retrasarán más en salir de la celda. Finalmente, se realiza un análisis de tiempo de llegada al detector. Los nucleótidos serán los que menos tarden en llegar, seguido de carbohidratos, péptidos y, por último, los lípidos.

Este tipo de separación es sensible a la forma de los analitos, permitiendo distinguir a analitos de la misma masa pero con distinta estructura tridimensional: aquellos analitos de forma compacta (globular) tardarán menos tiempo en llegar que los analitos lineales. · Detección: La detección de iones consiste en acelerar los iones por acción de un campo eléctrico, haciendo que impacten contra una placa, a la que se le arrancan electrones debido al choque. La cantidad de electrones liberada dependerá del ión, esto es, de su masa y su carga. Para amplificar la señal, estos electrones van acelerados hacia otra

placa a la que también se le arrancan electrones, produciéndose así continuamente una reacción en cadena de amplificación, generando suficiente carga eléctrica como para producir un voltaje, que es medido por el detector, y que es específico para el cociente masa/carga de cada ión. Este método, el multiplicador de el electrones ectrones en etapa etapa, puede realizarse también en continuo utilizando placas continuas que convergen, de modo que cada vez la distancia que recorren los electrones es más corta. También existen los multiplicadores multi multicanal canal canal, donde en cada canal solo entra iones de cierta carga/masa y es detectado. · Medidas de alta resolución: Los picos obtenidos en la espectrometría pueden poseer una relación m/z decimal (masa exacta), debido a que todas las masas atómicas excepto la del carbono son decimales. Cada estequiometría molecular posee una masa molecular distinta debido a la variación de la masa atómica de los elementos que la componen: 12 moléculas de hidrógeno equivaldrían a 1 molécula de carbono en términos de masa, pero debido a que la masa del hidrógeno es 1,008, existe una desviación. Esta consideración es especialmente relevante en metabolómica, debido a la frecuente aparición de interferentes de masa semejante a la del analito de interés, por lo que una alta resolución en masas (resolución decimal) permitirá distinguir el analito de interferentes. Otros campos a tener esto en cuenta es en el análisis de mezclas complejas, como el petróleo, formado por numerosos hidrocarburos de masas semejantes. · Cartografía química de tejidos: Este método permite ver la distribución del analito en una zona de un tejido mediante el calentamiento por pulso láser a lo largo de todo el tejido, para luego estudiar el resultado en un espectrómetro de masas. Así, se pueden generar imágenes en las que cada píxel consiste en un espectro MALDI para un punto del tejido, de modo que la variación en distintos puntos se puede ver reflejada con distintos colores e intensidades. Este procedimiento sólo es posible por láser, debido a que la electronebulización obtiene la solución promedio. Esta técnica es útil, además de para observar la distribución de moléculas en un tejido, para conocer la distribución de compuestos químicos en huellas dactilares....