TEMA 2. Variabilidad GenÉtica - RecombinaciÓn PDF

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TEMA 2. VARIABILIDAD GENÉTICA – RECOMBINACIÓN 1. INTRODUCCIÓN La variabilidad genética se puede alcanzar mediante mutaciones (malas para la salud) y mediante recombinación genética con el objetivo de evolucionar y adaptarse al medio. El reordenamiento de la información genética dentro y entre moléculas de ADN, que comprende diversos procesos, conocidos colectivamente como recombinación genética.  Recombinación homóloga: es el intercambio de información genética entre secuencias homólogas, que sufren una reorganización como consecuencia de dicho proceso. Es un proceso conservado evolutivamente. Se da durante la meiosis. Las funciones principales de este proceso son: -La producción de un intercambio de genes entre cromosomas homólogos durante la meiosis para generar diversidad genética. -Mecanismos de reparación de ADN dañado -Mantenimiento telomérico -Reordenamientos de secuencias de ADN específicas en células embrionarias (recombinación somática)  Recombinación somática o específica de sitio: se lleva a cabo en células somáticas como por ejemplo: el mecanismo que solo ocurre en un momento temprano del desarrollo embrionario del los linfocitos B. Selecciona y ensambla al azar segmentos de genes que codifican proteínas específicas con papeles importantes en el sistema inmunitario. Si el sistema inmunitario comenzará a fallar caeríamos enfermos. La recombinación da variabilidad al sistema inmunológico. Algunos tipos de cáncer génico como el Síndrome de Bloom y la Anemia de Fanconi y, probablemente, algunos casos de cáncer de mama, tienen como base problemas en el mecanismo de recombinación homóloga.

2. RECOMBINACIÓN GENÉTICA EN LA MEIOSIS El fenómeno de recombinación tiene lugar en la meiosis, en la fase de paquitena (profase I). Es un proceso recíproco y exacto, y si no es así da lugar a graves patologías. Significado biológico:  Generación de diversidad genética sobre la que puede actuar la selección natural.  Proporciona una unión física transitoria entra las cromátidas que es necesaria para la segregación de Anafase I.  Mejora la diversidad genética de una población. Consiste en el intercambio de material genético entre cromátidas homólogas (NO HERMANAS) dentro del quiasma. Proporciona una unión física transitoria (bivalente) 1

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que es necesaria para la segregación de los cromosomas en la anafase I → La bivalente se asocia al huso mitótico y los cromosomas homólogos van a polos opuestos. 2.1 MODELO DE HOLLIDAY

Robin Holliday fue un autor que propuso un modelo para explicar la recombinación genética. ~ Se produce un corte en la misma posición en ambas cadenas de ADN (cadenas de distintos cromosomas) → Cada corte genera un extremo 3’ y 5’ en cada cadena. ~ Los extremos 3’ invaden la hebra del cromosoma homólogo, uniéndose al extremo 5’ del contrario (enlace fosfodiéster)→ Se forma el quiasma, denominado intermediario de Holliday. ~ Migración de las ramas → El punto de intercambio migra hacia un extremo y como consecuencia se generan zonas de heterodúplex (cada hebra procede de un cromosoma). ~ Resolución del intermediario → Puede darse de 2 formas: 1. Se genera 1 corte en cada hebra (4 hebras), en la misma posición y al azar, puede unirse de 2 formas:

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Con los extremos más cercanos→ Los cromosomas siguen siendo los mismos, aunque con un pequeño trozo de heterodúplex (NO genera variabilidad genética) → NO es un cromosoma recombinante. Intercambiando los trozos → Un cromosoma se ha unido con el otro (genera mucha variabilidad genética) → Es un cromosoma recombinante.

2. El cromosoma inferior gira 180º respecto al superior, y se genera 1 corte en 2 hebras, que puede ser:  Corte horizontal → Genera cromosomas NO recombinantes.  Corte vertical → Genera cromosomas recombinantes. En el interior del quiasma se produce la estructura de Holliday o ADN heterodúplex. Los 2 cromosomas se superponen, y van a estar unidos de forma covalente (se recombinan las cromátidas hermanas). Hay que romper y formar enlaces de tal forma que el intermediario de Holliday sea recíproco y exacto. Los cromosomas eucariotas tienen los extremos libres y eso permite que puedan rotar libremente en el espacio al estar en una disolución acuosa. Si los extremos rotan, las enzimas pueden cortar en distintas posiciones. Es necesario que las 2 cromátidas homólogas (con diferentes alelos) se corten en posiciones recíprocas en una de las cadenas. Así no se pierde información. Formándose en esos cortes, extremos 3’ y 5’. Los 3’ son invasivos. La ligasa forma enlaces fosfodiéster. Toda la región donde se forma el intermediario hasta el punto final de desplazamiento se llama heterodúplex, toda esa región cambia de sitio y tiene información alélica diferente. La región superpuesta al no estar unida, si los cromosomas rotan por sus extremos libres, dejan de estar superpuestos. La superposición permite al intermediario de Holliday moverse, desplazarse. Al moverse el intermediario de Holliday, dejan de tener la misma información alélica del principio. Si se produce el corte de resolución tal cual están, éste corte será horizontal, NO hay giro. Los extremos NO se han cambiado, son los mismos del principio, por lo cual, se trata de un heterodúplex NO recombinante→ Productos patched (parcheado). Si se produce un giro en los extremos (isomerización→ Rotación de los brazos que son solubles en agua), las enzimas en vez de cortar horizontalmente, cortan en vertical, dando lugar a productos spliced→ Heterodúplex recombinante.  PROBLEMAS DE DICHO MODELO Y COMPARACIÓN CON EL MODIFICADO 1. Los eucariotas no podemos tener productos parcheados en las células, ya que aunque sean muy pequeños pueden producir mutaciones. 2. Un año después de la publicación de dicho modelo, se modificó, siendo el modelo actual de recombinación homóloga. 3. Diferencias: El modificado dice que en lugar de cortar en posiciones equivalentes, la recombinación se inicia por la rotura de doble cadena en una sola hebra, formándose extremos 3’ y 5’ en una hebra, solamente en una cromátida. 3

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2.2 MODELO ACTUAL – MODIFICADO DE HOLLIDAY Se propuso porque el anterior no explicaba la recombinación en meiosis y la reparación del ADN dañado. Cada cromátida a recombinar tiene doble hélice. Recombinan cromátidas homólogas. En los puntos de recombinación no tienen por qué recombinar las mismas cromátidas. La recombinación se inicia por una rotura de la doble cadena de 1 de las hélices, sólo en 1 cromosoma, generando nuevos extremos 3’ y 5’. La doble hélice se rompe en las dos cadenas de las cromátidas hermanas. Una exonucleasa destruye partes de estos extremos, sufriendo los extremos degradación (se degrada el ADN desde sus extremos), hay exonucleasas que degradan desde el 5’, siendo más rápidas que las que degradan desde 3’ (los cuales, quedan colgantes como regiones de cadena sencilla, pudiendo romperse). Uno de los extremos 3’ colgantes se convierte en extremo invasivo, llevando a cabo la invasión, la recombinación, se desplaza a la cromátida complementaria y busca homología de secuencia. Para buscar la cadena complementaria en una hebra que está intacta, hay que meterse en el heterodúplex, rompiendo los puentes de hidrógeno, dando lugar al lazo D. Por lo tanto, la invasión de una hebra (desde el extremo 3’) de este cromosoma realiza un rastreo hasta encontrar su región homóloga → Crea enlaces de hidrógeno y desplaza la hebra de dicho cromosoma (lazo D). Una polimerasa alarga el extremo siguiendo como patrón la hebra homóloga complementaria, mientas, que la que tendría que estar en esta posición, realiza el mismo proceso pero en el otro cromosoma → Hay 2 sobrecruzamientos. Esto lo hace para reponer el ADN que ha roto, necesitando un cebador que le proporciona un extremo 3’ y un molde. La polimerasa extiende el cebador, y va desplazando, extendiendo el lazo D, hasta que se encuentre con el extremo 5’ porque el intercambio tiene que ser recíproco y exacto. Lo que extiende la polimerasa está punteado en la imagen de abajo. Cuando se extiende con la polimerasa se une al 5’, formándose el 2º intermediario de Holliday. Por lo tanto, hay 2 intermediarios de Holliday. Al tener 2 se pueden cortar los 2 en la horizontal o en la vertical, obteniéndose 4 productos. No siempre es cierto pero vamos a considerar que siempre que hubo sobrecruzamiento hay recombinación. Finalmente las ligasas forman el último enlace fosfodiéster que la polimerasa no puede hacer, ya que ésta solo puede añadir enlaces en sentido 3’→5’. Se forma el intermediario de Holliday, pero hay 2 quiasmas en lugar de 1.

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Después tiene lugar la migración de las ramas y la generación del heterodúplex, y finalmente la resolución. Los quiasmas pueden cortarse en ambos sentidos, en transversal y horizontal.

Que se produzca la formación del heterodúplex no quiere decir que se haya producido necesariamente la recombinación genética. Al acabar este proceso el cacho que pretende que se recombine solo lo hará si se une con otro cromosoma, si se une a el mismo otra vez no habrá recombinación. Este proceso se realiza al azar por lo que será distinto en cada célula. No se realiza de la misma manera siempre ya que hay muchas maneras de cortar y desenredarse.

Conversión génica: proceso que se parece a la recombinación genética que genera heterodúplex pero que no genera variabilidad genética. “Es como empezar a hacer la recombinación y luego arrepentirse”

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3. ENZIMAS IMPLICADAS EN LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA 3.1 SPO11 Lleva a cabo la rotura doble de cadena (DSBs) 3.2 RAD51 Busca la homología, es una recombinasa. 3.3 DMC1 Invasión del dúplex homólogo (de hebras) 3.4 REC A Es la proteína central del proceso de recombinación homóloga. Promueve el intercambio de hebras homólogas para la formación del heterodúplex. Intercambia las hebras, hace que el extremo 3’ sea invasivo.Rec A se une a los extremos 3’. En el 1º paso, Rec A guía la invasión de la doble cadena, y en el 2º paso, Rec A desplaza a la homóloga formando un heterodúplex. Se une a un ADN de hebra sencilla (ADNss) mediante el gasto de ATP, después invade y rastrea una hebra homóloga complementaria, formando el lazo D. Posteriormente actúan las polimerasas y las ligasas.

3.5 COMPLEJO REC BCD Es la que primero actúa, en las regiones próximas a Chi→ En ese punto se forma una X(secuencia GCTGGTGG→ Secuencia consenso, siempre se corta en esa posición) ya que tiene 2 tipos de actividad enzimática:  

Endonucleasa → Rompe enlaces fosfodiéster en el interior de las cadenas. Helicasa → Rompe puentes de hidrógeno entre ambas hebras.

Realiza los cortes iniciales del proceso de recombinación y separa ambas hebras de un cromosoma para permitir la actividad de la Rec A y SSB (evitan que se unan las hebras entre sí y se vuelva a formar el dúplex) ya que genera un ADNss.

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3.6 RUV ABC Aún no se ha encontrado un homólogo en humanos, es la única que no. Hay distintos tipos de proteínas Ruv, aunque todas ellas forman parte de un mismo complejo: RuvA, RuvBy RuvC→Es la resolvasa, encargada de dar el corte:  

Migración de las ramas → Participan las proteínas Ruv A y Ruv B. Resolución → Interviene Ruv C (actividad endonucleasa, realiza los cortes de la resolución).

3.7 HOMÓLOGOS EN HUMANOS Las proteínas estudiadas hasta el momento son propias de las bacterias. En humanos tienen otros nombres, aunque las mismas funciones: ~ Rec BCD → Rad 52. ~ Rec A → Rad 51. ~ SSB → RP-A.

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La única diferencia es que en humanos, Rad 51 interactúa con otra proteína denominada BRCA2. Cuando esta proteína está mutada, se relaciona con el desarrollo del cáncer de mama y de ovario.

4. C. MANTENIMIENTO TELOMÉRICO Es una recombinación homóloga no meiótica. Es el mantenimiento de las secuencias teloméricas independientemente de telomersas descrito en diferentes tipos de eurcariotas. Algunas células inmortales y algunos tumores presentan este tipo de actividad que se define como mecanismo alternativo de alargamiento telomérico (ALT) El mecanismo implica la recombinación entre secuencias teloméricas utilizando como molde los telómeros de otro cromosoma El alargamiento telomérico se cree que evita la senescencia celular.

5. RECOMBINACIÓN GENÉTICA SOMÁTICA – DE SITIO La recombinación genética somática/de sitio se da en células somáticas, concretamente en linfocitos B durante el proceso diferenciación de estos. No se hereda porque afecta a líneas no sexuales. Se da siempre y cuando hay diferenciación celular, cuando una célula madre pasa de pluripotente a normal hay recombinación genética somática, decir en el desarrollo embrionario. No precisa regiones de grandes homologías de secuencias, con que exista un poquito de homología, va a haber recombinación. Se llama recombinación por homología de sitio, dándose en células en período de diferenciación. Estas recombinaciones pueden ser recíprocas pero NO exactas, principal diferencia con el anterior. Tenemos un clon de linfocitos para cada antígeno (cada recombinación forma un soldado, y éste se clona, formándose un ejército mediante copias idénticas). Consiste en: ~ Ocurre entre secuencias de ADN que comparten una pequeña región homóloga. ~ Principal diferencia con la recombinación meiótica→ NO sucede durante la meiosis, sino en células en proceso de diferenciación, en el periodo embrionario. 8

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~ Es mediada por proteínas que reconocen dianas específicas de ADN (sólo en sitios específicos del genoma) y dirigen el intercambio de hebras por complementariedad en esa zona. ~ El ejemplo que estudiamos es la recombinación en genes de inmunoglobulinas que es la causa de la variabilidad de anticuerpos. 5.1 INMUNOGLUBULINAS O ANTICUERPOS Las inmunoglobulinas son proteínas tetraméricas(cuatro polipéptidos), que constan de 2 pares de cadenas:  

2 cadenas ligeras (L) → Una se llama k (kappa) y otra λ (lambda). 2 cadenas pesadas (H) → Son idénticas.

La información genética para codificar las cadenas pesadas está en el cromosoma 14 (tiene unos genes V,D,J Y C colocados en fila), la de la cadena ligera k está en el cromosoma 2 y la de la cadena ligera λ está en el cromosoma 22.

Entre cada dos genes de la región variable y en las tres cadenas, existen secuencias muy conservadas evolutivamente (secuencia prácticamente igual que se van a reconocer como homólogas) denominadas SSR (secuencias de recombinación). Son las responsables de la recombinación. Todas las cadenas tienen un extremo constante y otro variable. La región variable es la que reconoce específicamente a los antígenos, y es la que tiene, en la secuencia de genes, SSR. Dicha variabilidad se consigue gracias a la recombinación específica de sitio que sufren los linfocitos B de un embrión (periodo embrionario) durante su maduración a partir de la dotación genética en la línea germinal. 9

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5.2 RECOMBINACIÓN SOMÁTICA Durante la maduración de los linfocitos B se reordenan los segmentos génicos de las inmunoglobulinas→ recombinación intracromosómica. La recombinación somática es intracromosómica (a diferencia de la meiótica), NO necesita a su cromosoma homólogo. El ADN de los linfocitos tiene lazos, cuyos extremos se aproximan por la presencia de SSR (se reconocen como homólogos). Se produce un corte a ese nivel y el ADN del lazo se desancla del resto y se pierde → De esta manera se reordenan los genes. En cada gen este proceso se da en zonas distintas, al azar (donde haya SSR). Cuando se transcriba y traduzca la información dará lugar a proteínas distintas, y por lo tanto, a cadenas distintas. Cada linfocito dará lugar a extremos variables distintos de las cadenas de sus inmunoglobulinas.

En las cadenas ligeras suele darse únicamente 1 recombinación, entre genes tipo V y J, pero en las cadenas pesadas se dan 2 recombinaciones: Una entre genes V y D,y otra entre genes D y J. Este tipo de recombinación NO es hereditaria a la descendencia del individuo, ya que se ha producido únicamente en nuestros linfocitos, NO en las células germinales. Pero SÍ será hereditaria a la descendencia de estos linfocitos.

5.3 PROTEÍNAS SSR 10

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Las proteínas SSR están formadas por 3 partes:   

Heptámero (7 bases). Espaciador (12 ó 23bases). Nonámero (9 bases).

Las proteínas SSR que se reconocen durante la recombinación son distintas: Una 7-129con otra 7-23-9. Los heptámeros y nonámeros son complementarios y se unen. La enzima recombinasa corta este lazo, de manera que, se pierden las SSR y los genes que había entre ellas.

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