TEMA 3: ACTIVIDAD CATALÍTICA I CINÉTICA ENZIMÁTICA PDF

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ACTIVIDAD CATALÍTICA I CINÉTICA ENZIMÁTICA
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TEMA 3: ACTIVIDAD CATALÍTICA I CINÉTICA ENZIMÁTICA: CARACTERÍSTICAS GENERALES Y CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS: Las enzimas son catalizadores potentes y muy específicos. El procesamiento de la energía y la información que tiene lugar en el interior de las células consiste en miles de reacciones químicas individuales. Para que estas reacciones sean fisiológicamente útiles deben producirse a una velocidad que satisfaga las necesidades de la célula y deben ser específicas. Las encargadas de este trabajo son las enzimas: la mayoría son proteínas aunque existe RNA CATALÍTICO. Poseen dos características fundamentales: PODER CATALÍTICO, ESPECIFICIDAD(enxim-substrat) Y EFICIENCIA.es capaz de funcionar en entornos suaves. Evitan la aparición de subproductos inútiles y perjudiciales. PODER CATALÍTICO: Las enzimas aceleran la reacción un millón de veces o más

ESPECIFICIDAD: Normalmente una enzima cataliza una única reacción química o un conjunto de reacciones estrechamente relacionas de forma muy específica. - De función. Ej: hexoquinasa: catalizan la reacción de oxidación (1 reacción específica) de la glucosa y la manosa - De sustrato. Ej: Glucosa-6-P se puede producir diversos productos. Ejemplo PROTEASAS: Deshacen el enlace peptídico hidratándolo y regenerando el grupo carboxilo y el grupo amino. También pueden romper los enlaces èter.

La especificidad de una enzima se debe a que la interacción del sustrato con la enzima es muy precisa. Esta precisión es el resultado de la compleja estructura tridimensional de las proteínas que actúan como enzimas. Algunos substratos pueden transformarse en una cosa u otra dependiendo con que enzima se una. Ex glucosa-6-P Existen diferentes grados de especificidad

ESPECIFICIDAD ENZIMAS PROTEOLITICOS TRIPSINA: rompe el enlace peptidico del lado carboxilo de residuos de arginina y lisina.

TROMBINA:rompe el enlace peptidico entre una arginina y una glicina (dentro de una sequencia concreta).

PAPAINA: rompe cualquier enlace peptidico.

CoFACTORES: Muchas enzimas requieren de cofactores para su actividad APOENZIMA+COFACTOR=HOLOENZIMA Derivados de las vitaminas Enzimas con la misma coenzima, que tienen normalmente la misma funcion. Los cofactores se clasifican en: - Metales - Coenzimas: ➔ Grupo Prostético Union fuerte ➔ Segundo sustrato (cosustrato) u  nion debil

Los enzimas interconvierten diferentes formas de energía que permiten el funcionamiento de la cel. los enzimas interconvierten distintas formas de energia para hacer posible el funcionamiento de la celula. el atp se sintetiza a partir de la oxidacion quimica de conbustible

CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS:

Nombre propio. Ej: hexoquinasa, tripsina Nombre sistemático: nombre de los sustratos y la reacción que cataliza con el sufijo asa. Eje ATP sintasa, glucosa fosfotransferasa. Número de cuatro dígitos según la Enzyme Commision . Ej 2.7.1.1 EC clase, subclase, nº de série TERMODINÁMICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS: La energía libre es una función de la termodinámica muy útil para la comprensión de las enzimas. Energía libre: energía libre disponible para llevar a cabo un trabajo útil. Las enzimas aceleran las velocidades de las reacciones químicas, pero las propiedades de la reacción, que se produzca o no, depende de la diferencia de energías libres. La energía libre (G) es una propiedad termodinámica que representa una medida de la energía útil (energía capaz de realizar un trabajo) - La diferencia de energía libre (Δ  G) entre los productos determinará si la reacción es espontanea o no. - La energía requerida para iniciar la conversión de los sustratos en productos determinará la velocidad de la reacción. Aquí influyen las enzimas (energía libre de activación) Los cambios de ΔG proporcionan información sobre la espontaneidad, pero no sobre la velocidad de la reacción: - ΔG0: NO ESPONT. Es necesario un aporte de energía (ENDERGÓNICA) - ΔG=0: SISTEMA EN EQUILIBRIO. No hay cambio neto de las concentraciones de los productos y los sustratos. El ΔG de una reacción depende solo de la energía libre de los productos y los sustratos, no depende del mecanismo molecular de la reacción. ΔG no proporciona ninguna información sobre la velocidad de la reacción.

El incremento de energía libre estándar (ΔGº) esta relacionado con la constante de equilibrio. Para determinar ΔG de la reacción hay que tener en cuenta: - La naturaleza de los reactivos (Δ  Gº) - Las concentraciones de los reactivos (Keq)

El ΔG se puede calcular a partir de la constante de equilibrio. R: constante gases T: temperatura absoluta K’eq= relación entre la concentración de sustratos y la concentración de productos. [A]…: concentraciones molares de los reactantes. ΔGº: es el incremento de energía libre en condiciones estándar: . E s el cambio que se produce en una situación ideal con una concentración de sustratos y productos a 1M (1 molar) temperatura 298K (25º) y a 1 atmosfera de presión. En bioquimica el ΔGº a pH 7 es ΔGº’ Se utilizan unidades como kilocaloría (kcal) o el kilojulio (kJ). 2,1kJ=0,239 kcal El criterio de espontaneidad es ΔG no ΔGº: reacciones que no son espontaneas se pueden volver espontaneas ajustando la concentración de los reactantes y producto (acoplamiento de reacciones)

Los enzimas únicamente alteran la velocidad, sin alterar el equilibrio entre concentracion de sustrato y producto. Las enzimas no pueden alterar el equilibrio de una reacción química, ya que este únicamente depende de la diferencia de energía libre entre el sustrato y el producto. La velocidad se estabiliza porque las enzimas han alcanzado el equilibrio. -> Considerando la ruta química que va del S al P.

Una reacción química que transforma un S en P transcurre a través de un estado de transición S. ESTADO DE TRANSICIÓN: es una estructura molecular transitoria (no es ni S ni P). Es la especie menos estable y más difícil de encontrar a lo largo del proceso de reacción ya que es la que tiene mayor energía libre. La diferencia de energía libre entre el estado de transición y el sustrato se denomina ENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN. Las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación y facilitan la formación del estado de transición. No afectan a la ΔG de la reacción. Si no existiera esta barrera del estado de transición se estarían produciendo constantemente las reacciones. Estado de transición: barrera que limita las reacciones que se producen en una cèl. La disminución del estado de transición se produce gracias a que la enzima es capaz de disminuir la energía libre de transición. Cuanto más baja es la energía libre de transición más moléculas superan esta barrera.

En la gráfica: reacción termodinámica exergónica. Estado de transición.- estado necesario para que se produzca la transformación del sustrato en el producto. Estado con una energía libre superior. Los átomos del sustrato tienen que ordenarse de una determinada forma. Los enzimas aumentan la velocidad disminuyendo la energía libre del estado de transición. CENTRO ACTIVO. COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO: Los enzimas no se consumen en una reacción: aparece igual en reactivos y producto La combinación del sustrato y una enzima genera un mecanismo de reacción en la que la energía del estado de transición es menor de la que tendría en ausencia de la enzima. Habrá más moléculas con la energía necesaria para alcanzarlo y se formará más producto de forma más rápida. El centro activo de la enzima es complementario al estado de transición.

La interacción enzima-sustrato se produce en una región concreta donde tiene lugar la reacción= Centro activo (región pequeña del enzima, que pueden ser residuos aa muy lejanos en la cadena)

La primera etapa de la catálisis enzimática es la formación de un complejo enzima-sustrato.

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Llave-cerradura: cada enzima se ajusta a su sustrato. Ajuste inducido: el enzima se adapta a la estructura del sustrato, es decir, el sustrato induce a la proteïna a adoptar una conformación determinada.

Los centros activos tienen características comunes: - Es una grieta o hendiduras tridimensionales formada por residuos que provienen de partes diferentes en la secuencia lineal de aminoàcidos. - Representa una pequeña parte del volumen total de la enzima. - Son microentornos únicos normalmente apolares. - El agua queda excluida a menos que sea un reactante. - Los residuos polares del centro activo participan en la unión al sustrato o en la catálisis. - El sustrato se une mediante fuerzas débiles como: enlaces electroestáticos, puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas. - La especificidad de la unión depende de la disposición de los átomos en el centro activo.

Generalmente el centro activo tiene un entorno hidrofóbico. Los residuos se encuentran alejados en la estructura primaria (secuencia lineal) pero próximos en la terciaria. Los sustratos se unen a los enzimas por numerosas fuerzas débiles. - Enlaces electroestáticos (entre cargas) - Puentes de hidrógeno - Fuerzas de Van der Waals (debidas a la aproximación espacial de distintos átomos) - Interacciones hidrofóbicas

Interacciona de forma perfecta sin modificar estructura.

Es la que ocurre en la mayoría de casos, ajuste inducido, el enzima se adapta através de esas interacciones al sustrato. La mayoría de las reacciones bioquímicas incluyen múltiples sustratos. como por ejemplo las relaciones de fosforilación (glucosa y ATP)

Los mecanismos de estas reacciones son distintos en función de los enzimas y se pueden clasificar (en función de como se produzca la reacción) 1. Mecanismo secuencial a) Ordenado b) Al azar 2. Mecanismo de doble desplazamiento o ping-pong: 1. a) MECANISMO SECUENCIAL ORDENADO Se tiene que producir de una forma determinada. A modifica la estructura de E para que encaje con B.

1. b) MECANISMO SECUENCIAL AL AZAR

Pueden unirse los sustratos en cualquier orden, no afectan a la forma del enzima. La interacción con un sustrato no influye para nada con la interacción del otro.

2. a) MECANISMO DE DOBLE DESPLAZAMIENTO O PING-PONG

Entra un sustrato que se transforma en un producto. El enzima queda modificado y luego entra en siguiente producto. Primero se produce una reacción y luego la otra. Por ejemplo, la transaminación. El enzima queda en las mismas condiciones de partida.

La actividad puede ser modificada por pH, humedad, temp… - La temperatura incrementa la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. P  resentan una T optima para su función. Un aumento de temperatura produce más movimientos en los átomos, de manera que se facilita la interacción sustrato-enzima. Esto pasa hasta que se llega a la temperatura en la que se produce la desnaturalización de las proteínas.

Poiquilotermos.- no regulan su temp. Ej reptiles Los enzimas no actúan hasta que augmenta la temp. Homeotermos.- regulan la temp corporal

La mayoría de los enzimas tiene un pH óptimo ( la acidificación tmbn provoca la desnaturalización).

Muchos complejos multienzimáticos son proteínas multifuncionales. Ej.- fructosa 2-6 bisfosfato metabolito fundamental para el control de la velocidad de la glucolisi, metabolito regulador. Reacción de fosforilacion catalizada por una quinasa (fosfofructoquinasa 2) Eliminacion grupo fosfato.- fosfatasa (fructosa bis fosfatasa 2) Ambas actividades residen en la misma proteína Hay un dominio con actividad quinasa y otro domino donde hay actividad fosfatasa. Hay un suceso de regulación (fosforilacion) que activa a la quinasa e inhibe a la fosfatasa y viceversa.

piruvato—acetil coA Participan hasta 3 act enzimáticas distintas. 5 coenzimas necesarios Este tipo de asociación se produce por que la reunión de los enzimas en una estructura común favorece la velocidad y la eficiencia.

Las actividades necesarias para las síntesis de los acidos grasos se encuentran en una sola proteína. (En animales superiores) En animales más simples esta funciones están realizadas por diferentes proteínas. La síntesis de cadenas de acidos grasos, se forman por la unión de dos atomos de carbono. (cada ciclo) Esta unidad no es capaz de llevar a cabo la síntesis, se tiene que unir a otro, se necesita un dímero. En el proceso de síntesis participan dominios de una unidad y de la otra (ESQUEMA) Aumenta la eficiencia. ENZIMAS ALOSTÉRICOS La mayoría muestran una cinética hiperbólica (michaelis- Menten) velocidad max con la saturación del sustrato. Existen una serie de enzimas que siguen una cinetica sigmoidea, enzimas alostericos (la actividad puede ser afectada por moléculas que están interaccionando en sitios distintos al centro activo. Alos= distinto, puede regular positivo (más velocidad) o negativo) Su actividad puede ser modificada. En vías metabólicas solemos encontrar enzimas alostericos El producto final actua como inhibidor del primer producto.- retroregulación. Permiten que la celula economice.

a) La actividad de un enzima alostérico puede ser modificada por moléculas reguladoras. - Regulación positiva ( aumenta la actividad enzimática, desplaza la gráfica a la izquierda)  o negativa (desplaza la gráfica a la derecha) - Efectores heteroscópicos (regulaldor distinto al sustrato) - Efectores homotrópicos (el sustrato como regulador) b) Generalmente son oligoméricos (formados por distintas subunidades) c) Participan en la regulación de las vías metabólicas.

CATÁLISIS ENZIMÁTICA. MODELO DE MICHAELIS-MENTEN:

La velocidad de catálisis aumenta de forma lineal a medida que aumenta la concentración de sustrato. Llega un punto en el que por mucho sustrato que añadamos, la velocidad de la reacción deja de aumentar, esto se da cuando todos los enzimas tienen los centros activos ocupados. Existe una velocidad máxima que se alcanza a una determina cantidad de sustrato cuando se saturan los enzimas. Posteriormente se estabiliza en un valor máximo donde no hay cambio neto en S o P. Se ha alcanzado el equilibrio. Michaelis i Menten dedujeron una fórmula que explicaba este comportamiento.

Podemos simplificar el estduio si determinamos velocidades iniciales - A tiempos próximos al inicio de la reacción [ Velocidad inicial (V0)] - El complejo ES tiene dos posibles destinos y se puede disociar en E y S con una constante K1 o puede proseguir para formar el producto con una constante K2 - El modelo se basó en la existencia del complejo ES.

KM: Es una combinación de constantes. Es característica de cada enzima y es independiente de la concentración de enzima. Es la concentración de sustrato a la cal la mitad de los centros están ocupados. Así KM proporciona una medida de la concentración de sustrato necesario para que tenga lugar una catálisis significativa. KM es igual a la constante de disociación del complejo ES, si K2 es mucho mejor que K-1. Indica la estabilidad del complejo ES: una KM baja indica una unión fuerte.

Los valores de KM  varían ampliamente. Solo depende del sustrato y condiciones ambientales (pH, T, fuerza iónica) Proporciona una medida de la concentración de sustrato para que tenga lugar una catálisis significativa. El valor de la KM representa una aproximación de la concentración de sustrato in vivo . corresponda al de la Los enzimas han evolucionado para tener un valor de KM que  concentración de sustrato que suele estar disponible.

Los enzimas presentan una actividad significativa (la mitad de Vmáx) pero sigue siendo significativa. VMÁX: Depende de la concentración de enzim Da una idea del numero de recambio (Kcat o k2) de una enzima que es el nº de moléculas de sustrato transformadas en producto por unidad de tiempo cuando la enzima está totalmente saturado de sustrato.

Una disolución de anhidrasa carbónica 10-6 M, cuando está completamente saturada del sustrato, la formación del 0,6M de H2CO3 por segundo. K2=6x10-5s-1 Cada ciclo catalítico tiene lugar en un tiempo igual a 1/k2 que es 1,7 microsegundo para la anhidrasa carbónica.

ENZIMAS ALOSTÉRICAS: Son catalizadores y sensores de información. En la célula la mayoría de los enzimas siguen la cinética de Michaelis y Menten Hay sustrato, catalizan Un método eficaz de regular las vías metabólicas consiste en regular la actividad enzimática. Las enzimas alostéricas suelen regular los procesos metabólicos. La actividad de una enzima alostérica se puede modificar por moléculas reguladoras, productos de las vías que están bajo su control. La retroinhibición es un método frecuente de regulación bioquímica. La molécula inhibidora es el producto final de la vía metabólica.

Las enzimas alostéricas no se ajustan a la cinética de Michaelis y Menten:

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Están reguladas por moléculas que se unen a lugares distintos del centro activo. No se parecen ni a S ni P. Presentan una estructura cuaternaria con varios centros activos. Las enzimas alostéricas dependen de cambio en la estructura cuaternaria (dos formas: T y R) Es más sensible a cambios en la concentración de sustrato en las proximidades de la KM que las enzimas de Michaelis-Menten.

Moléculas reguladoras modulan el equilibrio entre la forma R y T: - Un efector positivo se une al centro regulador de la forma R, distinto del centro activo, y estabiliza esta forma. - Un efector negativo se une a la forma T - Los efectos de las moléculas reguladoras se denominan heterotrópicos. - Los efectos del sustrato se denominan homotrópicos. Gráfica sigmoidea. La actividad de estos enzimas puede ser alterada por moléculas que se encuentran en un centro diferente al activo de la enzima. La unión de esa molécula reguladora puede marcar la activación o inhibición de la enzima. -

heterotrópico: regulador distinto al sustrato. homotrópico: propio sustrato el regulador.

ISOENZIMAS: Son enzimas que difieren en sus secuencias aminoácidicas (codificados por genes distintos) pero catalizan a misma reacción.

La existencia de las isoenzimas permite un ajuste fino del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un tejido o una etapa determinada del desarrollo: - Distintas propiedades cinéticas: diferentes KM  Vmáx  - Diferentes propiedades reguladoras (diferentes efectores) - Diferentes preferencias por coenzimas. - Diferente distribución celular

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Una vez dentro del hepatocito, la glucosa es fosforilada para dar G 6-P por la glucoquinasa. La glucoquinasa pertenece a la familia de las hexoquinasas. Hígado (IV) y músculo (I, II y III) Se diferencia de otros isoenzimas de la familia en que: ➔ Su KM para la glucosa (12mM) es 50 veces mayor ➔ No es inhibida por el producto (G 6-P) Es insensuble, a corto plazo, a la acción de la insulina.

ENZIMAS BIFUNCIONALES:

ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: En los mamíferos, los ácidos grasos se sintetizan mediante un complejo enzimático multifuncional Ejemplo de fructosa…: En el enzima hay un dominio que hace la actividad fosfatasa y otro dominio que hace la actividad quinasa.

COMPLEJOS MULTIENZIMÁTICOS: Ej 2 acido graso sintetasa: Una única proteína contiene tot lo necesario para la síntesi de ácidos grasos, en 3 dominios diferentes. Para su síntesi, se necesita un dímero de esta enzima que se unen en orientación contraria. Esta organización estructural aumenta la eficiencia del proceso....