Tema 3 (V): Lentivirus i adenovirus PDF

Preview

Summary

Download Tema 3 (V): Lentivirus i adenovirus PDF

Description

Tema 3 (IV)

Teràpia gènica

Tema 3 (V). Lentivirus i adenovirus LENTIVIRUS A diferència dels gammaretrovirus, tenen la capacitat d’infectar cèl·lules que no estan en mitosi. Aquesta propietat és molt interessant des del punt de vista de teràpia gènica, ja que permet una extensió significant del rang de cèl·lules en les quals es poden transferir gens terapèutics (ja que la majoria de les cèl·lules del nostre organisme no estan en replicació). A més, s’ha vist que és efectiva una transducció de cèl·lules mare hematopoètiques mitjançant vectors lentivirals, inclús en absència de factors de creixement. És a partir del VIH-1 d’on s’han obtingut la majoria de virus lentivirals, degut al ampli coneixement de les seves propietats. Hi ha tres generacions: 

Primera generació: es generen mitjançant la transfecció de la cèl·lula empaquetadora amb 3 plasmidis o

Plasmidi 1: 

5’ LTR wt



Seqüència líder: conté PBS i un splicing donator 5’



350 bp del gen gag (correspon a la regió psi)



700 bp del gen env, que conté la regió RRE, la

qual

permet

l’exportament

dels

transcrits virals del nucli 

Promotor que controla l’expressió del gen terapèutic, ja que el promotor 5’ U3 LTR del HIV-1 està silenciat degut a l’absència de la proteïna Tat (no present per raons de seguretat)

 o

3’ LTR amb la regió PPT upstream

Plasmidi 2: conté tots els gens virals a excepció de env. Aquest plasmidi conté una mutació en la regió psi per evitar que s’empaqueti, també manca de 3’ LTR. L’expressió d’aquest plasmidi està controlada per un promotor constitutiu del citomegalovirus (CMV IE)

o

Plasmidi 3: codifica per la proteïna VSV-G (Recorda del pseudo-typing dels retrovirus), per eliminar les limitacions que tenen els lentivirus en quant al tropisme (tenen una capacitat fusogènica baixa)

La producció de les partícules infectives es duu a terme en HEK293T (Human Embryonic Kidney 293 T) mitjançant una transfecció transitòria dels 3 plasmidis. Les partícules infectives es troben en el medi de cultiu. La primera generació de lentivirus presenta problemes de seguretat, relacionats amb la seva producció i amb el seu ús clínic. A nivell de producció, hi ha problemes de seguretat basats en problemes de recombinació. Hi ha dos tipus:

Tema 3 (IV) Teràpia gènica - Recombinació entre plasmidi 1 i 3: recombinació entre el plasmidi d’empaquetatge i el plasmidi que conté el vector lentiviral, generant un lentivirus amb capacitat replicativa. es poden reconstruir partícules infectives, la infectivitat de la qual pot ser estesa degut a la presència de la proteïna VSV-G -

Recombinació entre plasmidis 2 i 3: els HIV poden combinar amb alguna d’aquestes partícules terapèutiques i crear o reconstituir partícules víriques  no es pot escapar de les mans l’eina terapèutica

A nivell terapèutic, l’ús d’aquests virus en un pacient infectat amb HIV-1 podria estimular una replicació del vector degut a una estimulació per part de les cèl·lules transfectades amb el HIV-1 wt (el virus wt actuaria com a helper per a la replicació del vector)  aquest fet pot determinar el tropisme del vector dins l’organisme. 

Segona generació:

Es van evolucionar els vectors per fer-los més segurs. En la segona generació s’eliminen les proteïnes accessòries i es mantenen les estructures mínimes necessàries per a que l’estructura sigui funcional (en la primera generació es mantenien fragments accessoris que eren favorables per a l’encapsidació del virus). Quan es van testar els virus de segona generació, es va veure que seguien havent problemes de seguretat, ja que tenen capacitat de recombinar entre ells i donar lloc a partícules infectives. Aquest vectors eren òptims per models animals, models pre-clínics, ja que en aquests no hi ha aquests handicaps. 

Tercera generació

Es va fer ús dels vectors SIN (Recorda de retrovirus),

que

s’auto-inactiven.

Es

deleciona la regió LTR 3’ per tal de truncar el promotor del vector de transferència (el abans plasmidi 1). Aquest fet evita que el DNA del provirus es transcrigui desprès de la transcripció reversa. Es requereixen 4 plasmidis. Hi ha un plasmidi més perquè ens separen els plasmidis estructurals per temes de seguretat.L’estructura terapèutica requereix un promotor endogen, però en aquesta perspectiva són molt més segurs. Des de la perspectiva de la mida, segueixen sent vectors petits que acumulen estructures petites (7-9 kb). Els de tercera generació es troben en fases pre-clíniques per tractar cèl·lules potents ex vivo o en estratègies in vivo, ja que són molt segurs. L’avantatge d’això és que la latència de la informació serà més gran. plasmidi és el VSV (pseudo-typing).

Tema 3 (IV)

Teràpia gènica ADENOVIRUS

Els virus es van purificar en una glàndula del tracte respiratori. Es va veure que aquests eren molt bons infectant cèl·lules epitelials. Després es va veure que eren força bons o molt potents en expressió, això vol dir que el control o la submissió que feien de la cèl·lula eucariota era molt gran  domini sobre cèl·lula eucariotes en síntesi de proteïnes virals era força gran. Inicialment es pensava que eren específics de cèl·lules epitelials però després es va veure que el seu tropisme era característic del lloc on s’aïllaven. Es va veure que també eren capaços d’infectar cèl·lules no epitelials. Això va fer que tinguessin un ampli tropisme. No s’integren però el temps de permanència de la seva informació és llarg  la seva informació es troba en forma d’episoma. Això es va fer interessant per desenvolupar vectors en teràpia gènica. Podien acomodar unes 37 kb i, en concret, el 2 i el 5 eren molts interessants. En funció del perfil de la resposta immunitària que s’obtenien, es van començar a definir sub-grups. Es va veure que el 2 i el 5 eren molt òptims per teràpia gènica perquè tenien un tropisme força interessant (cèl·lules musculars, etc). Aquest virus té les ITR en 5’ i 3’. En el seu cicle de replicació, té uns gens Early (5 gens), uns gens Intermediate –early (2 gens) i uns gens late (1 mRNA – splicing -> diferents formes). Sempre es comença pels early, que estan en 5’. Aquestes estructures són bàsiques pel procés de replicació del virus: -

Early genes: procés de contacte partícula vírica – hoste  endocitosi  expressió dels early genes; aquests faciliten la duplicació del genoma però a banda inhibeixen processos apoptòtics de la cèl·lula, inhibeixen també processos de defensa de la cèl·lula dels virus  el que fan és facilitar de forma significativa el procés d’infecció. Un codifica per una proteïna que inactiva p53. S’han fet delecions únicament d’aquesta regió i s’usen com a virus oncolítics, des de la perspectiva que només infecten a les cèl·lules que tenen p53 inactiu.

-

Els gens més tardans: estaran implicats en la maduració de l’estructura viral

És un genoma gran comparat amb els lentivirus i per tant, pot acumular molta informació. Un cop es va conèixer en profunditat el cicle replicatiu d’aquests virus, es va començar a pensar com es podrien usar des de perspectiva de teràpia gènica. Es van fer diferents generacions dels vectors adenovirals. 

Primera generació: deleció de dos gens (E1 i E4), per tal de que càpiga informació (promotor, gen terapèutic, poli-A). El que es va veure és que aquestes estructures eren molt immunogèniques, produïen una resposta immunitària molt gran. Per a fer-los, es pot fer mitjançant processos de recombinació en bacteris (també els de segona generació). El que passava és que algunes d’aquestes delecions estaven suprimint informació que estava facilitant que la resposta immunològica no fos molt elevada. No obstant, es va veure que independentment d’això, hi havia una resposta immunològica des de la perspectiva de la partícula infectiva. La solució va ser buidar-los encara més



Segona generació: si el sistema immunitari està reconeixent moltes estructures d’aquests virus, s’ha de silenciar més informació per disminuir la resposta immune. Es van delecionar més early genes. En aquest cas hi ha una resposta immune més baixa, però encara no són òptims ja que encara donen un tipus de resposta significatiu

Tema 3 (IV)  Vectors gutless: vectors destripats, en els quals s’elimina tot

Teràpia gènica

el genoma excepte les ITR. Des d’aquesta perspectiva, tenen les ITRs i tot lo que hi ha entremig s’ha canviat, i dins es troba la nostra estructura terapèutica. Des de la perspectiva de l’encapsidació, es requerirà tota la informació, (després es veurà com es fa per encapsidar-los). A més, la mida d’aquests vectors ha d’estar al voltant de les 37 kb  si l’estructura terapèutica no permet arribar fins aquesta mida, s’addiciona stuffer-DNA (de relleno). Això es fa perquè ha de tenir la mida òptima sinó no serà òptimament encapsidat. En aquest virus se li ha sacrificat molta maquinària, que se li ha de proporcionar en trans La producció dels adenovirus gutless es duu a terme en cèl·lules 293/Cre+. Aquestes es transfecten amb el vector gutless linealitzat i s’infecten amb un vector adenoviral helper (donarà la informació en trans per empaquetar). Aquest helper té la regió psi flanquejada per dos seqüències loxP. Un cop dins les cèl·lules, la Cre recombinasa elimina la regió psi del genoma del helper virus, de forma que està evitant la incorporació del genoma del helper virus en els virions i per tant, duent a terme un empaquetatge selectiu del vector gutless. Tenim cèl·lules molt potents en encapsidació i per tant, una concentració elevada de partícules infectives. El nivell de contaminació pot anar del 1 al 10%. La contaminació serà d’adenovirus normal, aquesta contaminació causarà potents reaccions immunològiques. Avui en dia el que s’està fent és intentar optimitzar aquests processos per tal de disminuir al màxim aquesta contaminació. Es fa provant altres sistemes d’encapsidació, basant-se bàsicament en la mateixa metodologia. S’ha vist que malgrat no integrar-se, la durada de la seva expressió és força òptima  s’han usat en teràpia gènica per guarir distròfia muscular de Duchenne i malalties hepàtiques. Els adeno-associats són òptims perquè són molt menys immunogènics que els adenovirals. Els adenovirals causen resposta immune cel·lular i humoral, aquesta no només pot comprometre la salut de l’individu, sinó que moltes vegades inactiva l’estratègia terapèutica....