Tema 6. Transcripción en procariotas PDF

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Transcripción en procariotas.
Profesora: Ana Bonnin...

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria

BLOQUE III. TRANSCRIPCIÓN DE DNA Y PROCESAMIENTO DE RNA TEMA 6. TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS 6.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA TRANSCRIPCIÓN •

La transcripción es la síntesis de secuencias de RNA tomando como molde una de las cadenas del DNA, la hebra molde.

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El RNA se sintetiza en dirección 5’ a 3’. Cuando las dos hebras de la doble hélice de DNA se separan se forma la burbuja de transcripción. Hay una zona donde se forma por complementariedad un híbrido de RNA-DNA de doble cadena, el cual da estabilidad a todo el complejo de transcripción.

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La transcripción es generalmente asimétrica. Solo se transcribe una de las hebras de DNA, la hebra molde, mientras que la hebra codificante no. La hebra codificante tiene la misma secuencia de bases que el RNA transcrito, a excepción de los uracilos, presentes en el RNA en lugar de las timinas. No todo el DNA se transcribe. Todo el DNA se replica, pero no todo se transcribe. A partir del start se transcribe, hasta la región de terminación. Se denomina unidad de transcripción. De esa unidad de transcripción, no todo se traduce, de manera que se traduce a partir del codón de iniciación. DIBUJO La transcripción es más lenta que la replicación.

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La RNA polimerasa puede sintetizar de novo, no necesita iniciador. La enzima encargada es la RNA polimerasa.

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6.2. RNA POLIMERASA BACTERIANA. La RNA polimerasa es una holoenzima, formada por 4 subunidades principales. El enzima mínimo o núcleo de la polimerasa (core catalítico) está formada por las subunidades β, β’, 2α y ω; posee actividad RNA polimerasa cobre cualquier tipo de DNA.

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Dos subunidades α: intervienen en el ensamblaje de la holoenzima, reconocimiento del promotor y en la unión de algunos activadores. Subunidad β y β’: forman el centro catalítico de la enzima. Subunidad ω: tiene una función reguladora. Subunidad o factor σ: se une de forma temporal y permite reconocer de manera específica los promotores y seleccionar la hebra adecuada a transcribir. Hay distintos factores σ, cada uno de los cuales se nombra según su peso molecular. La subunidad σ más abundante, de masa molecular 70 kDa, se denomina σ70. El cambio de subunidades σ en la RNA-polimerasa puede hacer que la polimerasa central reconozca distintos promotores. El enzima mínimo junto con este factor forma la RNA polimerasa holoenzima.

Conceptos importantes de la transcripción: ➢ Promotor: región del DNA a la que la RNA polimerasa se une para iniciar la transcripción. ➢ Sitio de inicio (+1): la primera base que se sintetiza en el RNA. ➢ Terminador: secuencia del DNA que causa que la RNA polimerasa termine la transcripción. ➢ Unidad de transcripción: la secuencia de DNA transcrita a cadena simple de RNA, la cual empieza en el sitio de inicio y termina en el terminador. Iniciación de la transcripción. La transcripción se inicia en el sitio +1 (start point). La RNA polimerasa debe unirse al DNA en el promotor. Para colocar las “cosas” en los genes, se usan los términos upstream y downstream, tomando como referencia el nucleótido +1. Del +1 a la derecha las bases se cuentan sumando. Del +1 a la izquierda las bases se cuentan restando, omitiendo el 0).

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria (Por qué hay uracilo en el RNA y no en el DNA: hay una reacción de desaminación en la que la citosina se convierte en uracilo, la cual es relativamente frecuente en la célula (100 veces/célula/día). Si el DNA tuviera uracilo, se desaminarían las citosinas convirtiéndose en uracilos y sería imposible para los sistemas de reparación distinguir las citosinas que se han desaminado a uracilo y los uracilos originales. En el RNA esto da igual, no es significativo, ya que tiene una vida media muy corta y se está constantemente formando y destruyendo.) Hay diferentes técnicas que permiten estudiar la unión de cualquier proteína al DNA. Por ejemplo, la unión de la RNA polimerasa a un DNA determinado: -

Geles de retardo (band-shift assay): permite saber si hay alguna proteína que reconozca una secuencia de DNA determinada. Para ello se utiliza un fragmento de DNA corto (entre 50 y 300 nt) marcado radiactivamente, se incuba con diferentes concentraciones de la proteína (o un extracto proteico que la contenga) y se migra en una electroforesis no desnaturalizante, en un gel de poliacrilamida muy diluido. o Si tal proteína existe, el complejo DNAproteína migra más lentamente, se va a retardar. o Si el DNA no es reconocido por ninguna proteína, migra más rápidamente con el frente electroforético.

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Footprint: sirve para determinar la secuencia exacta de un DNA a la que se unen algunas proteínas, tales como factores de transcripción. Consiste en: 1. Se clona el fragmento de DNA que contiene el sitio en el que se une la proteína de interés. 2. Se marca uno de los extremos de las moléculas de DNA con una molécula radioactiva. 3. Se digiere el DNA con una DNA-asa I (esta enzima corta las moléculas del DNA de forma aleatoria, a diferencia de las enzimas de restricción que lo cortan en secuencias determinadas). El resultado es una mezcla de fragmentos radioactivos de longitud variable, en la que el fragmento más pequeño representa un sólo nucleótido. 4. Se separan los fragmentos radioactivos por electroforesis y se revela el autoradiograma. Cuando la proteína se une a una secuencia determinada del DNA, la DNA-asa I no puede atacar la secuencia, por lo que los fragmentos cubiertos por la proteína no aparecerán en el autoradiograma. La ausencia de estos representa el footprinting. 5. La misma muestra de DNA sin la proteína se somete a un proceso normal de secuenciación, comparándose con el autoradiograma anterior. La secuencia exacta de bases en el sitio de unión de la proteína puede ser leída directamente ya que está representada por los fragmentos escalonados de DNA que están ausentes en el footprint. (Zonas de hipersensibilidades: zonas en las que la nucleasa tiene más facilidad para cortar. En el gel se obsevan como bandas más gruesas.) 3

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Primer extension: técnica mediante la cual los extremos 5' del ARN pueden mapearse, es decir, pueden identificarse y secuenciarse. La extensión del cebador se puede usar para determinar el sitio de inicio de la transcripción en el DNA, por el cual se conoce su secuencia. Se requiere un cebador radiomarcado (2050 nucleótidos) que es complementario a una región cerca del extremo 3 'del mRNA. Se hibrida el cebador con el RNA y se usa la transcriptasa inversa para sintetizar el ADNc a partir del RNA hasta que alcanza el extremo 5 'del ARN. Al desnaturalizar el híbrido y usar el cebador de ADNc extendido como marcador en un gel electroforético, es posible determinar el sitio de inicio de la transcripción.

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Inmunoprecipitación de cromatina: sirve para detectar la unión de proteínas a la cromatina. 1. Se hace un crosslink con productos químicos para que las uniones entre las proteínas y el DNA se hagan covalentes y no se suelten en los posteriores pasos. 2. Se corta la cromatina en fragmentos pequeños. 3. Se usa un anticuerpo específico contra la proteína de interés. 4. Al inmunoprecipitar, solo precipita la proteína de interés que ha sido marcada con su anticuerpo específico, y con el DNA que está unido a dicha proteína. 5. Se revierte el entrecruzamiento entre el DNA y la proteína de interés y se estudia el fragmento de DNA (se amplifica por PCR, se secuencia, etc).

6.3. EL PROMOTOR PROCARIOTA. En el promotor encontramos dos cajas o secuencias consenso: -

Caja Pribnow o TATA box (TATAAT): alrededor de la secuencia -10. TTGACA: alrededor de la secuencia -35.

Son secuencias consenso, por lo que pueden no ser exactamente las mismas secuencias en todos los organismos. Se marcan en la hebra codificante. Entre ambas secuencias -10 y -35 hay 17 pares de bases idealmente. Cuando la distancia entre ambas cajas es menor o mayor de 17 la transcripción es menos eficiente.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria Más upstream, en la secuencia -40/-65 se encuentra, en ocasiones, el elemento UP. Éste aumenta la transcripción.

El n +1 es una adenina en la mayoría de los casos. La traducción se inicia en un triplete y la transcripción en un nucleótido (n +1). Promotor débil o fuerte. Un promotor puede ser débil, y por lo tanto la transcripción será peor; o fuerte, en cuyo caso la RNA polimerasa se unirá mejor al DNA y la transcripción será óptima. Cómo mejorar un promotor: 1. Hacer que la región o distancia entre las dos cajas (TATA box y TTGACA) sea de 17 nucleótidos. Si es, por ejemplo, 15, se debería hacer una inserción de 2 nucleótidos. 2. Mutagénesis dirigida para hacer más parecida las secuencias del promotor a las secuencias consenso. 3. Incluir un elemento UP. Mutación promotor UP= mejorar un promotor; mutación promotor DOWN= empeorar un promotor. 6.4. RECONOCIMIENTO DEL PROMOTOR POR LA RNA POLIMERASA La RNA polimerasa tiene afinidad por todo el DNA en general, pero es importante que tenga afinidad especial por el promotor y que comience a sintetizar en el start point. El factor σ es el encargado de reconocer el promotor para que la RNA polimerasa se una. • •

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La RNA polimerasa más el factor σ constituyen la RNA polimerasa holoenzima. El factor σ proporciona especificidad a la unión de la RNA polimerasa y aumenta su afinidad por el promotor: se une al promotor aumentando la afinidad de la RNA polimerasa por éste. El factor σ solo se une al DNA cuando interacciona con la RNA polimerasa. El factor σ se disocia del enzima mínimo o core para comenzar la elongación y que la RNA polimerasa pueda avanzar a lo largo del DNA.

Hay algunas zonas del factor σ que interaccionan con zonas del promotor. Por ello, es importante que la distancia entre las cajas sea de 17 nucleótidos, y que las secuencias sean lo más parecidas a las secuencias consenso.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria El elemento UP interacciona directamente con la subunidad α de la RNA polimerasa, no interacciona con el factor σ. De esta manera, cuando está el elemento UP la unión de la RNA polimerasa al DNA es más fuerte y por ello se favorece la transcripción. Tipos de factores σ. Existen muchos factores σ. Cada factor lleva asociado un número, el cual es su peso molecular. El factor σ70 de E. coli reconoce las secuencias consenso -10 y -35 del promotor de genes básicos necesitados para el crecimiento bacteriano. Los demás tipos de factores σ reconocen un promotor en la que las cajas -10 y -35 tienen secuencias distintas y específicas. -

El factor σ54 reconoce promotores de genes implicados en la asimilación del nitrógeno. El factor σ32 activa promotores en respuesta a un choque térmico. Ésta desplaza a σ70 evitando que se expresen esos promotores, y expresándose las chaperonas implicadas en el plegamiento de las proteínas desnaturalizadas por las altas temperaturas.

Cambiando el tipo de factor σ cambia la expresión génica de la bacteria. Los factores σ están regulados transcripcionalmente o mediante factores anti-sigma que controlan su localización, degradación o secuestro. La iniciación se divide en varios pasos para poder estudiar la regulación de la iniciación de la transcripción: 1. La RNA polimerasa y el factor σ se unen al promotor. 2. Formación del complejo binario cerrado: constituido por proteína (RNA polimerasa unido al factor σ) y DNA. Es cerrado porque no se ha abierto aún la burbuja de transcripción. Se abre la doble cadena y se forma la burbuja de transcripción. 3. Formación del complejo binario abierto. Es abierto porque se ha formado ya la burbuja de la transcripción. 4. Formación del complejo ternario: constituido por proteína (RNA polimerasa unido al factor σ), DNA y algunos nucleótidos de RNA. 5. Liberación del factor σ.

Todos estos pasos de la transcripción son susceptibles de ser regulados por proteínas reguladoras que activan o reprimen el inicio de la transcripción. 6

Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria Si un promotor tiene unas secuencias -10 y -35 muy parecidas a las secuencias consenso y, además, la distancia entre ambas es de 17 nucleótidos, el complejo binario cerrado se forma eficientemente, pero ello no significa que la transcripción vaya a transcurrir perfectamente; por la razón de que hay proteínas reguladoras que intervienen en cada paso de la iniciación. Existen también proteínas que regulan la actividad de la RNA polimerasa mientras ésta está sintetizando. Iniciaciones abortivas. El factor σ mantiene a la RNA polimerasa unida al promotor, de manera que se necesita que éste se separe de la RNA polimerasa para que ésta pueda continuar con la elongación. En los primeros instantes, cuando el factor σ sigue unido a la RNA polimerasa, hay muchas síntesis abortivas donde se liberan RNA de pequeña longitud (2-9 nucleótidos). Los primeros RNA que sintetiza la RNA polimerasa no son definitivos hasta que no se libera la RNA polimerasa del promotor cuando el factor σ se separa de la RNA polimerasa.

Actividades correctoras de errores. La RNA polimerasa tiene actividad de corrección de errores, aunque no es actividad exonucleasa exactamente. Tiene actividad de degradación del RNA, es decir, degrada unos pocos nucleótidos de los que ha ido sintetizando de manera menos específica y menos exacta. La actividad de corrección de errores no reside en un sitio activo, a diferencia de las DNA polimerasas. 6.5. TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN. Hay dos tipos de terminaciones: •

Terminación intrínseca: depende de una secuencia que hay en el DNA, la cual se va a transcribir a RNA. En el RNA mensajero se forma, debido a esta secuencia de terminación del DNA, una horquilla, rica en pares G-C en la base, y un track de uracilos. - La horquilla, como estructura secundaria, provoca la desestabilización de la maquinaria de transcripción, provocando que la RNA polimerasa se detenga. - Zona de hibridación rica en U: el track de uracilos forma uniones U-A con el DNA en la burbuja de replicación (hibridación RNA-DNA que mantiene estable la RNA polimerasa) provocando que la RNA polimerasa se caiga. Las uniones U-A son muy débiles.

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La traducción está acoplada a la transcripción, de manera que a medida que el RNA se sintetiza los ribosomas se van uniendo a éste. La unión de los ribosomas impide que se formen estructuras secundarias. Si el DNA no tiene nada unido, lo normal es que forme estructuras secundarias y la polimerasa se detiene. De esta manera, se deduce que si hay estructuras secundarias es porque el RNA no se está traduciendo. Terminación dependiente de ρ (rho): rho es una proteína con varias subunidades y con actividad ATPasa dependiente de RNA. La proteína rho se une a la secuencia rut. La secuencia rut, la cual está en el DNA se transcribe en el RNA, de manera que rho se une a ese sitio, avanza en dirección 5’-3’ hacia la RNA polimerasa, hasta alcanzarla. La proteína rho es una helicasa de DNA-RNA, de manera que rompe los puentes de hidrógeno destruyendo el híbrido RNA-DNA que da estabilidad a toda la maquinaria en la burbuja de transcripción, liberándose todos los componentes que intervienen en la transcripción, pudiendo comenzar de nuevo la transcripción de otro DNA.

Antibióticos que inhiben la transcripción bacteriana. Hay algunos antibióticos que inhiben la RNA polimerasa, tales como la rifampicina y la actinomicina D. La rifampicina interfiere con el DNA-RNA recién formado. Bloquea el canal por donde pasa el híbrido DNARNA y por ello bloquea la transcripción después de la adición de 2 ó 3 nucleótidos al RNA. No inhibe la unión de la RNA polimerasa al DNA ni la reacción de polimerización. La actinomicina es un agente intercalante. Se intercala entre las bases del dsDNA inhibiendo la replicación y la transcripción. A bajas concentraciones afecta selectivamente a la transcripción sin inhibir la replicación. 8...