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Clase práctica de 3º curso Ecología I Bloque V.- Interacciones entre poblaciones: Competencia interespecífica

Alelopatía: Competencia por interferencia química entre plantas Objetivos 1. Entender el proceso de diseño de una experiencia para comprobar una hipótesis. 2. Obtención y análisis estadístico de los resultados de un bioensayo. 3. Ver un ejemplo de capacidad alelopática potencial y discutir su representatividad en condiciones naturales. La alelopatía es el término empleado para definir todo efecto (positivo o negativo) directo o indirecto (utilizando microorganismos como intermediarios) que una planta produce sobre otra a través de compuestos químicos liberados al medio ambiente. La mayor parte de estudios sobre el tema se han dirigido a los efectos negativos de un organismo sobre otro, centrándose en el estudio de la supresión de la germinación, crecimiento o reproducción de un individuo por parte de otro como consecuencia de la liberación de toxinas al entorno. En este sentido, la alelopatía puede verse como un fenómeno de competencia por interferencia química o de carácter pasivo. A los compuestos químicos responsables de los fenómenos alelopáticos se les conoce como fitotoxinas, agentes alelopáticos, o aleloquímicos. Las plantas poseen numerosas sustancias metabólicas secundarias cuya utilidad para las propias plantas es desconocida. Algunos, con un grado de toxicidad elevado, se identifican como agentes aleloquímicos. La planta evita la autotoxicidad por procesos de compartimentalización, inactivación, o liberación. La liberación puede hacerse directamente desde la planta (lavado, exudados, volatilización) o acumulándolos en órganos renovables (hojas, pétalos). Así pues, la función primordial de la liberación de agentes aleloquímicos al medio sería evitar la autotoxicidad y, secundariamente, conseguir una ventaja adaptativa. Se comprende también así, que plantas que han coevolucionado sean más resistentes a los compuestos alelopáticos que plantas originarias de ecosistemas diferentes. La alelopatía puede jugar un papel importante en la estructuración y dinámica de las comunidades, en la sucesión y finalmente en la evolución vegetal. Se han utilizado diversos métodos en la investigación alelopática: bioensayos de laboratorio, bioensayos de campo, correlaciones entre los resultados de los bioensayos y la distribución espacial de las especies o la secuencia sucesional.

Procedimiento En este caso vamos a utilizar el método de bioensayo de laboratorio. En síntesis, consiste en tomar un fragmento, lixiviado, exudado… de la planta sospechosa de acción alelopática y aplicarlo a una especie receptora, observando los cambios que pueda producir respecto a un control. Puede usarse cualquier parámetro fisiológico como medida del efecto producido (fotosíntesis, germinación, crecimiento...). En este caso usaremos como respuesta la germinación y la elongación radicular de semillas de l especie modelo Lactuca sativa, frente a hojas en descomposición o sus lixiviados de roble (Q. robur), eucalipto (E. globulus) y acacia (A. dealbata). La etapa de germinación es un momento de gran sensibilidad frente a factores adversos, tales como la presencia de substancias tóxicas, debido al gran número de procesos fisiológicos que se pueden ver alterados. De modo que la evaluación de la germinación y de la elongación radicular constituye un indicador representativo de éxito o fracaso en cuanto al establecimiento y desarrollo de una planta.

Material de apoyo La guía de prácticas. El tema 13B del programa de teoría perteneciente al Bloque V sobre: Interacciones entre poblaciones: Competencia inter-especifica por interferencia. Para el análisis de datos se puede utilizar cualquier paquete estadístico, como Statgraphics Centurión XVI. Versión 16.2.04, 32bit (Software de libre disposición para los estudiantes de la USC)1.

Preparación de las placas de cultivo y desarrollo del bioensayo El grupo de cada sesión se divide en 4 subgrupos de 6 alumnos. Cada subgrupo tomará los datos correspondientes a 3 réplicas de cada uno de los 4 tratamientos e interpretará los resultados de un experimento preparado e incubado varios días antes de la práctica por varios alumnos voluntarios de cada subgrupo en el laboratorio de Ecología. Durante la práctica todos los alumnos aprenderán a realizar el ensayo sembrando al menos dos réplicas o placas Petri. La lechuga (Lactuca sativa) es una especie test muy utilizada en numerosos tipos de bioensayos (alelopatía, ecotoxicología, herbicidas, fertilidad…) y el protocolo ha sido estandarizado por numerosas instituciones (e.g. Lettuce root elongation test, USEPA, 1989). El ensayo consiste en:

1.- Se toman tantas placas Petri ( 9 cm) como tratamientos (control, roble, eucalipto y acacia) por réplicas (3) se han planificado, en total 12 placas para cada subgrupo. Las placas se rotulan adecuadamente en la base y la tapa (C=control, R= roble, E= eucalipto, A= acacia).

1

Para instalar: Statgraphics Centurion XVI.1.15 seguir: Home » Services » Information and Communication Technologies Area (ATIC) » Software » Catálogo de software » Statgraphics Directamente: (http://www.usc.es/en/servizos/atic/software/catalogo/Statgraphics/centurionxvi.1.15.html Inicio>ejecutar (elegir la versión 32 o 64 bit copiar y pegar) cmd /c net use \\software.usc.es&&\\software.usc.es\atic.software\l\centurion16115_64.lnk Introducir Nombre de usuario: __________Contraseña:______________Instalar > El nº de serie é: L9B0-6B0A-1AS0-YK0E-2EM3 Más rápido: Baja la versión software libre por internet> Instalar> validar con el número de serie de la USC> L9B0-6B0A-1AS0-YK0E2EM3 > introducir el código recibido por e-mail

2.- Se recortan círculos de papel de filtro que entren cómodamente dentro de las placas. Cada círculo se marca con lápiz con dos rayas perpendiculares para tener los cuadrantes bien definidos y se hace un pequeño corte para evitar su torsión al humedecerlos con el extracto. 3.- Una vez secas en cámara controlada (20 C) las hojas son troceadas con el fin de simular el papel de los insectos fragmentadores en el proceso de descomposición. A partir de la fragmentación de las hojas tenemos dos métodos de ensayo: Con hojas: En cada placa (réplica) se deposita la cantidad determinada de material vegetal (g de hoja seca/placa) y se cubre con un círculo de papel de filtro. En las placas control, se sustituye las hojas por papel de filtro y se ponen 3 círculos de papel de filtro en cada una. A continuación, se siembran 20 semillas en cada placa, distribuidas holgadamente, poniendo 5 en cada cuadrante (hay que evitar la competencia entre las propias semillas). Se riegan con agua destilada de modo que los papeles de filtro queden bien humedecidos, pero sin ahogar a las semillas en el agua. Con extractos: Se realiza una extracción acuosa con agua destilada (e.g. 25 C, agitación y oscuridad) de una muestra de hojas fragmentadas (g de hoja seca/ml) durante un tiempo determinado (24h). El ensayo consiste en adicionar una muestra del extracto acuoso obtenido a cada placa Petri, sembrada previamente con semillas de la especie test sobre papel de filtro. Extracción

Recolección de hojas

Secado Fragmentación

Filtración

Ensayo con extractos

Ensayo con hojas

No se deben utilizar semillas con malformaciones, que sean demasiado pequeñas o semillas de otras especies (a veces aparecen impurezas). Por su facilidad utilizaremos el segundo método ensayando tres extractos con concentraciones diferentes de cada tratamiento problema (50, 25 y 12,5 g/l). A continuación, el procedimiento a seguir es común a las dos alternativas. 4.- Las placas se incuban en oscuridad, a 22 ±1 °C y 100 % de humedad en cámara controlada durante 120h. 5.- Finalizado el período de incubación se frena el proceso congelando las semillas germinadas

durante 24h para evitar diferencias entre placas o tratamientos debidos a distintos tiempos de desarrollo. Se toma como criterio de germinación la emergencia visible de la radícula ( 1mm). Para medir la longitud máxima, se estiran las radículas con unas pinzas, con cuidado de romperlas, sobre papel milimetrado. También se puede usar un calibre pie de rey.

Ensayo con extractos Añadir extracto Rotular: Especie: Replica: Fecha:

Corte

Placa de Petri (9 cm)

Incubar 22 C Oscuridad 120h

Siembra Riego

Rotular: Especie: Replica: Fecha:

Trozos hojas

Ensayo con hojas

Recuento de semillas germinadas y medición de radículas

Cada subgrupo realizará un bioensayo de 4 3 Control

Replica 1

Replica 2

Réplica 3

Roble

Eucalipto

Acacia

Obtención de resultados y cálculos Se cuentan todas las semillas germinadas en cada placa y se mide la longitud máxima radicular de cada semilla cuando esto sea posible. Las medidas se recogen en una tabla como la del Anexo o se crea una en Excel. Se resume el porcentaje de semillas germinadas en cada placa, según la tabla siguiente: Germinación (%) Replica

Control

Concentración ensayada: ___g/l

Roble

Eucalipto

Acacia

1 2 3

Igualmente, se resume la longitud radicular media de las máximas (LR) de cada placa (LR = L/20) . L. radicular (LR mm) Replica

Control

Concentración ensayada: ___g/l

Roble

Eucalipto

Acacia

1 2 3

A partir de los resultados las preguntas a resolver son:

-

¿Existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de germinación observado en los diferentes tratamientos?

-

¿Existen diferencias significativas en la longitud radicular media observada en los diferentes tratamientos?

En el Anexo se adjunta ejemplos de los análisis estadísticos a realizar.

ANEXO Base de papel milimetrado para la medición de la longitud radicular

Tabla para la toma de datos radiculares de cada subgrupo (6 alumnos). Cada subgrupo analizará tres réplicas por tratamiento (Control, Roble, Eucalipto y Acacia) en total 12 placas (2 placas por alumno)

Material

CONTROL

Material

ROBLE

Placa 1

Placa 2

Placa 3

Placa 1

Placa 2

Placa 3

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

3

4

4

4

4

4

4

5

5

5

5

5

5

6

6

6

6

6

6

7

7

7

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7

7

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9

9

9

9

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19

20

20

20

20

20

20

LR= L/20

LR= L/20

LR= L/20

LR= L/20

L R= L/20

L R= L/20

Material

EUCALIPTO

Material

ACACIA

Placa 1

Placa 2

Placa 3

Placa 1

Placa 2

Placa 3

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

3

4

4

4

4

4

4

5

5

5

5

5

5

6

6

6

6

6

6

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19

19

19

19

20

20

20

20

20

20

LR= L/20

LR= L/20

LR= L/20

LR= L/20

L R= L/20

L R= L/20

Clase práctica de 3º curso Ecología I Bloque V.- Interacciones entre poblaciones: Competencia interespecífica

Alelopatía: Competencia por interferencia química entre plantas Ejemplo. - Análisis de la Varianza de la germinación Se puede utilizar cualquier paquete estadístico gratuito (e.g. Statgraphics Centurión XVI. Versión 16.2.04, 32bit)

Germinación (%) Control

Roble

Eucalipto

Acacia

Replica 1

18

14

10

8

Replica 2

16

15

9

7

Replica 3

17

10

11

6

Después de introducir los datos en Statgraphics Centurión XVI>COMPARAR>VARIAS MUESTRAS>MULTIPLES COLUMNAS> SELECCIONAR: Gráfico de medias, Tabla ANOVA, Prueba de Múltiples rangos Gráfico de medias En el gráfico de medias e intervalos de confianza, podemos observar que los intervalos de los diferentes tratamientos no se solapan, por lo que podemos suponer que las medias difieren significativamente entre los tratamientos. Tabla ANOVA La tabla ANOVA descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre-grupos y un componente dentro-de-grupos. La razón-F, que en este caso es igual a 21,9, es el cociente entre el estimado entregrupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que 0,05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 4 variables con un nivel del 95% de confianza.

Fuente Entre grupos Intra grupos Total (Corr.)

Tabla ANOVA Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio 164,25 3 54,75 20,0 8 2,5 184,25 11

Prueba de Múltiples rangos Para determinar cuáles medias son significativamente diferentes empleamos el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. La tabla muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias y el asterisco que se encuentra al lado de los 6 pares indica que todos los pares muestran diferencias estadísticamente significativas (p COMPARAR>VARIAS MUESTRAS>MULTIPLES COLUMNAS> SELECCIONAR: Gráfico de medias, Tabla ANOVA, Prueba de Múltiples rangos. Gráfico de medias En el gráfico de medias e intervalos de confianza, los intervalos están escalados para controlar el error del experimento como mucho con una tasa del 5% (método de Tukey). Como el intervalo para la muestra 4 (Acacia) no solapa con ningún otro intervalo, la media difiere significativamente de la de las otras tres muestras. Para el resto de tratamientos sus intervalos se solapan. Tabla ANOVA La tabla ANOVA descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre-grupos y un componente dentro-degrupos. La razón-F, que en este caso es igual a 6,58642, es el cociente entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos. Puesto que el valor-P de la prueba-F es menor que 0,05, podemos decir que existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 4 variables al nivel de confianza del 95%. Fuente Entre grupos Intra grupos Total (Corr.)

Suma de Cuadrados 88,9167 36,0 124,917

Gl 3 8 11

Cuadrado Medio 29,6389 4,5

Razón- F Valor -P 6,59 0,0149

Prueba de Múltiples rangos Para determinar cuáles medias son significativamente diferentes empleamos el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. La tabla de las pruebas de múltiples rangos muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco indica los pares que muestran diferencias estadísticamente significativas (P...