TP : Analyse d’un fractionnement subcellulaire PDF

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Compte-rendu du TP : Analyse d’un fractionnement subcellulaire ...

Description

Boffy Léa

Padovani Margaux

Groupe B1

Co Comp mp mptte-r e-rend end endu ud du u TP : A Anal nal nalyyse d’ d’un un fr frac ac actio tio tionnem nnem nnemen en entt sub subcell cell cellul ul ulair air aire e I.

Int Introdu rodu roduct ct ction ion

Avant le TP, des méthodes de fractionnement subcellulaires ont été effectuées au préalable. Les méthodes effectuées consistaient à séparer les différents composants cellulaires du foie par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule par centrifugation différentielle. Les morceaux de foie (préalablement découpés) ont été broyés dans un tampon d’homogénéisation (saccharose 0,33M, Tris-HCl 15mM, pH 7,4, EDTA 2,5mM) afin de rompre la membrane plasmique. Un homogénat contenant tous les constituants de la cellule a alors été obtenu. Cet homogénat a ensuite été centrifugé à différentes vitesses dans le but de permettre la séparation des différents organites. De ce fait, l’homogénat a été purifié en fonction de la taille et de la densité de ces constituants. A partir des centrifugations réalisées, 5 fractions ont pu être isolées et conservées à -80°C, chacune contenant différents organites :     

La fraction 1 correspondant à l’homogénat intact La fraction 2 contenant le noyau et le cytosquelette La fraction 3 renfermant les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes La fraction 4 contenant le ribosome, l’appareil de golgi, le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que les microsomes La fraction 5 correspondant à la fraction hydrosoluble du cytosol.

Ce TP avait pour objectif d’analyser ces différentes fractions obtenues lors du fractionnement subcellulaire dans le but d’étudier les activités enzymatiques spécifiques de leurs organites.

II.

Matéri atériel el et méthod éthodes es 1. Obtent btentio io ion n des fr frac ac actio tio tions ns ssubc ubc ubcellula ellula ellulaires ires

Deux cents g de foie de bœuf ont été découpés et lavés dans une solution de saccharose 0,33 M puis broyés dans un litre de tampon d’homogénéisation Tris-HCl 15mM pH 4,4 EDTA 2,5 mM, saccharose 0,33 M. Afin d’obtenir les différentes fractions subcellulaires, des centrifugations de l’homogénat à 800g, 10 min, ont été réalisées avec une première centrifugation différentielle. Le culot a été éliminé et une partie du surnageant (fraction F1, 900 mL) a ensuite été centrifugé à 8200g, 20min afin d’obtenir un culot (fraction F3 repris dans 100mL de tampon d’homogénéisation) et un surnageant (fraction F2). Deux cents mL de F2 ont été centrifugés à 100 000g, 60min afin d’obtenir un culot (fraction F4 repris dans 200mL du même tampon) et un surnageant (fraction F5). Les différentes fractions ont été congelées à -80°C jusqu’à leur utilisation.

2. Ac Activité tivité Lac Lactate tate Dés Déshy hy hydro dro drogéna géna génase se Afin de mesurer l’activité de la LDH dans chaque fraction, un dosage spectrophotométrique a été effectué. La diminution de l’absorbance de NADH à 340nm a été suivie toutes les 10sec pendant une minute dans 1mL de milieu réactionnel composé de 0,04 M de tampon PiNa pH 7,4, du pyruvate 0,5mM, du triton X100 10% (p/v) (20 µL), de la roténone à 0,01 g/L, de 0,2mM de NADH et de l’eau (535 ou 540 µL selon le volume de fraction à ajouter par la suite). L’ajout de 5 et 10 µl de chaque fraction dans les microcuves (une par volume de fraction) a permit de démarrer la réaction, le zéro ayant été fait préalablement avec une cuve d’eau.

3. Ac Activité tivité G Glluco cosesese-6-Ph 6-Ph 6-Phos os ospha pha phata ta tase se (G (G6P) 6P) L’activité G6P a été mesurée dans 500µL de milieu réactionnel composé de tampon acétate 0,1M pH 6,25, G6P 20mM, Triton X-100, 0,2% (v/v). La réaction a été déclenchée par 10µL de chaque fraction. Les essais ont été incubés 10min à 37°C puis la réaction a été stoppée par ajout de 500µL d’acide trichloroacétique (TCA) à 10% (p/v) et les essais ont été centrifugés 1min à 10 000g. Des essais contrôles ont été réalisés en ajoutant le TCA avant l’incubation. Le dosage du Pi libéré a été réalisé dans 22 tubes hémolyses par la méthode d’Ames. A 250 ou 500µL de surnageant préalablement obtenu ont été ajoutés 2,5ml du réactif de Ames composé de 6 volume du tampon A et un volume du tampon B et 0,8% SDS (p/v). Pour les essais avec 250µl de surnageant, le volume a été complété par 250µl d’eau. Les essais ont été incubés 1h à température ambiante et l’absorbance mesurée à 820nm. Une gamme étalon de Pi allant de 0 à 20µg a été réalisée dans les mêmes conditions à l’aide de KH2PO4 1mM suivant le tableau 1 : Tableau 1 : quantités de réactifs introduits dans chaque tube pour réaliser une gamme étalon de Pi Numéro du tube 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Quantité de Pi (µg) 0 1 2 4 6 8 10 15 20 Volume de KH2PO4 1mM (µl) 0 10,5 21 42 63 84 105 158 210 Volume d’eau (µl) 500 489,5 479 458 437 416 395 342 290 500 Volume final (µl) Volume du réactif de Ames (mL) 2,5 Calcul du volume de KH2PO4 1mM pour le tube 1 : Il faut tout d’abord calculer la concentration molaire de Pi : Pi = PO4 3- 

MPi = 4x M(O) + M(P) = 4x16 + 31 = 95g/mol.

D’après la loi de conservation de la quantité de matière : n (Pi) = n (KH2PO4) d’où : C (Pi) x V (Pi) = C (KH2PO4) x V (KH2PO4) Le volume de KH2PO4 peut ainsi être déterminé (ainsi que le volume d’eau à ajouter) : Dans le tube 1 : m(Pi) = 1µg soit 1.10-6g. 𝒎(𝑷𝒊) 𝟏∗𝟏𝟎^𝟔 n(Pi) = = 1,06x10-8mol = 1,06x10-5mmol. = 𝑴( 尠𝒊)

𝟗𝟓

2

V (KH2PO4) =

𝐂 (𝐏𝐢) 𝐱 𝐕 (𝐏𝐢) 𝐂 (𝐊𝐇𝟐𝐏𝐎𝟒)

=

𝟏,𝟎𝟔∗𝟏𝟎𝟓 ∗𝟏 𝟏

= 1,06x10-5 L soit 10,5 µl.

Le volume d’eau à ajouter est donc de 500 – 10,5 = 489,5 µl.

4. Ac Activité tivité C Cyt yt ytoc oc ochrome hrome C O Oxy xy xyda da dasse Afin de doser l'activité cytochrome C oxydase, un pré-traitement des échantillons a d'abord été réalisé en mélangeant 10µL de Triton X100 à 1% (v/v) avec 90µL de chacune des fractions (F1, F2, F3, F4, F5), que l'on a gardé dans la glace. Des mesures ont ensuite été effectuées à l'aide d’un oxymètre (Hansatech) relié à une électrode de Clark préalablement calibrée par du dithionite de Na. Pour cela, la réaction enzymatique a été réalisée dans 1 mL de milieu réactionnel composé de tampon phosphate 30 mM pH 7,2 d’EDTA 0,6 mM, d’ascorbate 2 mM, de cytochrome c 0,06 mM de TMPD (N,N,N'N'-tétraméthyl-1,4-phénylènediamine) 0,5 mM et 260µl d’eau. La réaction a été déclenchée par 50µL de fraction préalablement diluée 1,1 x dans du triton x100.

5. Dos osag ag age ed de e pr proté oté otéines ines selo elon n Bra Bradfor dfor dford d Un dosage de protéine a été réalisé à partir de 5µL, 10 ou 15 µL de chaque fraction diluée 20X dans de l’eau distillée. Le réactif de Bradford a été ajoutée afin d’obtenir un volume final de 2mL et l’ensemble a été agité vigoureusement. Une gamme étalon comprenant 0 à 25µg de SAB (Serum Albumine Bovine) a été réalisée simultanément dans les mêmes conditions et l’absorbance a été mesurée immédiatement à 595 nm.

III.

Rés Résultats ultats 1. Dosag osag protéin age ed des es pro téines es selo selon n Br Brad ad adfor for ford d

Les absorbances mesurées pour la gamme étalon ont été présentées dans le tableau ci-dessous : Tableau 2 : mesure des absorbances à 595 nm de tubes contenant de la BSA dans le but de réaliser une gamme étalon du dosage selon Bradford.

Tubes Volume de BSA (1 mg/mL) en µL Quantité de BSA en µg Volume de réactif de Bradford ajouté (en µl) Absorbance à 595 nm

0

1

2

3

4

5

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

2000

1995

1990

1985

1980

1975

0

0,085

0,169

0,326

0,419

0,549

3

Une droite étalon a alors été tracée à partir de la gamme étalon réalisée en tableau 2 (figure 1 en Annexe 1) Les absorbances mesurées pour les différents essais ont été présentées dans le tableau 3 ci-dessous : Tableau 3 : Mesure de l’Absorbance à 595 nm des différentes solutions analysées. Fractions Volume de réactif de Bradford ajouté (en µl) Volume des fractions (en µl) Absorbances à 595nm Moyennes des absorbances

F1

F2

1995

1990

1985

1995

1990

1985

1995

1990

1985

5

10

15

5

10

15

5

10

15

0,065 0,170 0,174 0,291 0,051 0,123 0,135 0,236 0,063 0,215 0,231 0,175

0,136

F4 1995 5 0,096

F3

0,202 F5

1990 10

1985 15 0,230

0,130

1995 5 0,049

1990 10

0,171 0,123 0,156 0,112 La moyenne des absorbances correspond à des fractions de 10 µL puisque :

0,119

1985 15 0,158

(5 + 10 + 10 + 15) = 10 4 Il a été possible de déterminer la quantité de protéines présentes dans chaque fraction en reportant les valeurs d’absorbance des fractions sur la droite étalon tracée en figure 1 : Les résultats de la détermination de la quantité de protéines sont présentés en tableau 4 : Tableau 4 : quantité de protéine présente dans chaque fraction suivant les absorbances des fractions, et concentration en protéine de chaque échantillon : Fractions

F1

F2

F3

F4

F5

Absorbance pour 10 µl

0,175

0,136

0,202

0,156

0,112

Quantité de protéine dans 10 µl (en mg)

8,4 x 10-3

6,5 x 10-3

9,6 x 10-3

7,4 x 10-3

5,83 x 10-3

Quantité de protéines avant dilution (en mg)

(8,4 x 10-3) x 20 = 1,68 x 10-1

1,3 x 10-1

1,92 x 10-1

1,48 x 10-1

1,166 x 10-1

Concentration en protéine (en mg/µl de fraction)

1,68 x 10-1 / 10 = 1,68 x 10-2

1,3 x 10-2

1,92 x 10-2

1,48 x 10-2

1,166 x 10-2

4

0,302

Concentration en protéine (en µg/µl de fraction)

1,68 x 10-2 x 103 = 16,8

13

19,2

14,8

11,66

Quantité totale de protéine dans chaque fraction (en mg)

1,68 x 10-2 x (1000 x 103) = 16,8 x 103

11,7 x 103

1,92 x 103

0,592 x 103

2,332 x 103

Il a fallu estimer la quantité totale de protéines pour l’équivalent de 1000 ml de F1 initial. En effet, la totalité de la fraction 1 n’a pas été réutilisée pour donner les fractions 2 et 3, et de même pour la fraction 2 pour aboutir aux fractions 4 et 5. On a donc du ajuster la quantité de protéines dans chaque fraction en émettant l’hypothèse où la totalité de la fraction précédente ait été centrifugée (résultats tableau 5). Ces valeurs ont servit dans les calculs de rendement qui vont suivre. Tableau 5 : ajustement de la quantité de protéine dans chaque fraction totale Fractions Quantité totale de protéine dans chaque fraction (en mg) Quantité totale de protéine ajustée dans chaque fraction (en mg)

F1

F2

F3

F4

F5

16,8 x 103

11,7 x 103

1,92 x 103

0,592 x 103

2,332 x 103

16,8 x 103

13 x 103

2,13 x 10 3

2,95 x 103

11,66 x 103

Les calculs sont indiqués en annexe (Annexe) et les valeurs obtenues par la méthode utilisée sont récapitulées dans le tableau 6. Tableau 6 : Tableau récapitulatif du dosage des protéines selon Bradford : Fractions Concentration en protéine (en µg/µL de fraction) Quantité totale de protéine dans chaque fraction (en mg) Quantité totale de protéine ajustée dans chaque fraction (en mg) :

F1

F2

F3

F4

F5

16,8

13

19,2

14,8

11,66

16,8 x 103

11,7 x 103

1,92 x 103

0,592 x 103

2,332 x 103

16,8 x 103

13 x 103

2,13 x 10 3

2,95 x 103

11,66 x 103

5

2. Ac Activité tivité la lacctat ate ed dés és éshyd hyd hydrog rog rogén én énase ase Les différentes valeurs d’absorbances mesurées au cours du temps sont présentées dans le tableau 7 :

Tableau 7 : mesure du suivi des absorbances à 340 nm des fractions étudiées durant une minute : Fraction s F1 F2 F3 F4 F5 Volume des 5 10 5 10 5 10 5 10 5 10 fractions (en µl) Temps (en s) 0 0,868 0,882 0,872 0,889 0,987 1,001 0,981 0,986 0,809 0,802 0,845 0,833 0,848 0,851 0,980 0,990 0,970 0,972 0,784 0,753 10 0,824 0,785 0,823 0,812 0,979 0,989 0,961 0,958 0,760 0,706 20 0,803 0,742 0,793 0,776 0,971 0,979 0,956 0,945 0,739 0,660 30 0,782 0,697 0,768 0,743 0,970 0,972 0,949 0,929 0,712 0,619 40 0,762 0,655 0,745 0,708 0,969 0,961 0,937 0,916 0,688 0,578 50 0,745 0,619 0,720 0,676 0,965 0,958 0,929 0,903 0,665 0,539 60 Les courbes de diminution de l’absorbance au cours du temps ont ainsi pu être tracées. (Voir figure 2 Annexe 2) La concentration en NADH (en ΔDO/s/essai, puis en ΔDO/min/essai) a alors été déterminée en calculant la pente de chaque courbe (en valeur absolue), ces résultats sont rassemblés tableau 8 (A, B et C) Tableau 8 A : concentrations en NADH des fractions étudiées pour 5 et 10 µl de fraction puis moyenne des concentrations pour 10 µl: Fractions Concentration de NADH (en ΔDO/s/5 μl) Concentration de NADH (en ΔDO/min/10 μl) Moyenne de la concentration de NADH pour 10 μl (en ΔDO/s/10 μl) Moyenne de la concentration de NADH pour 10 μl (en ΔDO/min/10 μl) 

F1

F2

F3

F4

F5

0,002

0,0026

0,0003

0,0008

0,0024

0,0044

0,0046

0,00064

0,0014

0,0045

0,0042

0,0049

0,00062

0,0015

0,0046

0,252

0,294

0,0372

0,09

0,276

Calcul des concentrations de NADH (en ΔDO/s/essai) : exemple sur 5µl de F1

Il s’agit ici de calculer la pente obtenue en annexe 1. On choisit 2 points de cette droite : A(40 ; 0,782) et B(50 ; 0,762) ,, = -2x10-3 La pente sera alors de : 

6

En prenant la valeur absolue, on a une concentration de 0,002 DO/s/5µl.



Calcul de la moyenne de concentration de NADH pour 10µl : exemple sur F1 ,

(∗,) 

= 0,0042 ΔDO/s/10 μl

Pour convertir cette valeur en ΔDO/min/10μl, il suffit de multiplier la valeur obtenue par 60 : 0,0042 x 60 = 0,252 ΔDO/min/10 μl Pour déterminer la concentration de NADH en mole/L, nous devons diviser la valeur en ΔDO/min par le coefficient d’extinction molaire du NADH, à savoir 6230 M-1.cm-1.

Tableau 8 B : concentrations en NADH des différents essaies en mol / L / min : Fractions : F1 F2 F3 F4 F5 Moyenne de la concentration de 0,252 0,294 0,0372 0,09 0,276 NADH (en ΔDO/min/essai) : Concentration de 0,252 / 6230 = NADH (en 4,719 x 10-5 5,971 x 10-6 1,445 x 10-5 4,43 x 10-5 4,044 x 10-5 mol/L/min/essai) : Les résultats obtenus ont été multipliés par le volume de la réaction (1 mL, soit 1 x 10-3 L) dans le but d’obtenir une concentration en moles de NADH transformés par min/essai. Fractions Concentration de NADH (en mol/L/min/essai) Concentration de NADH (en mol/min/essai)

F1

F2

F3

F4

F5

4,044 x 10-5

4,719 x 10-5

5,971 x 10-6

1,445 x 10-5

4,43 x 10-5

4,044 x 10-5 x 10-3 = 4,044 x 10-8

4,719 x 10-8

5,971 x 10-9

1,445 x 10-8

4,43 x 10-8

On observe suite à ces calculs de concentration que la quantité de NADH est grande dans les fractions F2 et F5 comparativement aux fractions F1, F4 et F3 (dans laquelle cette quantité est la plus faible) et que la fraction F2 est la fraction la plus riche en NADH. Grâce au dosage de protéines, nous pouvons maintenant exprimer les activités spécifiques puis les activités totales de chaque fraction. Après le dosage des protéines, les activités spécifiques ainsi que l’activité totale de chaque fraction ont pu être calculées.

7



Calcul de l’activité spécifique : exemple sur F1

L’activité spécifique a été calculée par la formule ci-dessous : Activité spécifique =

 é  é   é

Il a d’abord été nécessaire de calculer les quantités totales de protéines dans chaque fraction afin de calculer les activités spécifiques et totales des enzymes. Par exemple pour la fraction 1 :  L’activité enzymatique est de 4,044 x 10-8 moles de NADH transformés par minutes pour 10 µL de fraction.  La concentration en protéine est de 16,8 µg/µL. Pour 10 µL, nous avons donc 168 µg de protéine, soit 168 x 10-3 mg. Activité spécifique =



,∗^ ∗^

= 2,4 x 10-7 mol/min/mg

Calcul de l’activité totale : exemple sur F1 Activité totale = Activité spécifique x Quantité totale de protéine dans chaque fraction

Par exemple pour la fraction 1 :  L’activité spécifique est de 3,48 x 10-7 moles de NADH transformés par minutes par milligramme.  La quantité totale de protéine dans la fraction est de 11,6 x 103 mg. Activité totale = 3,48 x 10-7 x 11,6 x 103 = 4,03 x 10-3 moles de NADH/min. Ces calculs ont été répétés pour chaque fraction et les activités des différentes fractions rassemblées dans le tableau 9 : Tableau 9 : tableau présentant les quantités de protéine activités de chaque fraction étudiée ainsi que le rendement de chaque fraction et que leur facteur de purification. Fractions F1 F2 F3 Protéines totales 168 x 10-3 117 x 10-3 192 x 10-3 dans l’essai (en mg) Activité spécifique 2,4 x 10-7 3,63 x 10-7 0,31 x 10-7 (en mol/min/mg) Activité totale (en 4,03 x 10-3 4,71 x 10-3 0,066 x 10-3 mol/min) Rendement 100 99,64 1,63 (en %) Facteur de 1 1,51 0,13 purification Les valeurs significatives ont été mises en gras sur le tableau 9.

F4

F5

148 x 10-3

116,6 x 10-3

0,97 x 10-7

3,79 x 10-7

0,286 x 10-3

4,42 x 10-3

7,09

96,31

0,4

1,57

8

La lactate déshydrogénase s’est trouvé en grande majorité dans la fraction 5.De plus cette fraction a présente le meilleur facteur de purification. (le plus élevé) les fractions F1, F2 et F5 présentent des activités spécifiques et totales significatives par rapports aux activités faibles de F3 et F4. Enfin les rendements en % d’activité totale par rapport à F1 (100% ) sont très faibles et presque nuls pour les fractions F3 et F4.

3. Ac Activité tivité G Glluco cosesese-6-Ph 6-Ph 6-Phos os ospha pha phata ta tase se Les absorbances mesurées pour la gamme étalon ont été présentées dans le tableau 10 suivant : Tableau 10 : tableau présentant le dosage de la quantité de Pi en fonction de l’absorbance à 820 nm des tubes préparés : Numéro des tubes : 1 2 3 4 5 6 Quantité de Pi 0 1 2 4 6 8 (en µg) : 0 0,073 0,128 0,254 0,382 0,511 Absorbance : Cette gamme étalon est réalisée selon les indications donnée en matériel et méthode

7...