TP métabolisme : Recherche sur le fonctionnement de la chaine respiratoire mitochondriale PDF

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Licence 2 Chimie Sciences de la Vie parcours chimie biologie ; TP métabolisme énergétique : Recherche sur le fonctionnement de la chaine respiratoire mitochondriale...

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ARIYALINGAM Saranki

TP1 Métabolisme énergétique

L2 CB3 09/12/2020

Recherche sur le fonctionnement de la chaine respiratoire mitochondriale

UPEC – Université Paris Est Créteil 2020/2021

INTRODUCTION : La chaine respiratoire est une chaine qui transporte des électrons provenant de différents métabolismes. Elle se situe au niveau de la membrane interne des mitochondries. Cette chaine oxyde des coenzymes réduites qui proviennent de la dégradation de composés. Elle est composée de complexes protéiques (complexe I, II, III et IV) et de transporteurs d’électrons tel que le cytochrome ou encore le coenzyme Q. D’ailleurs, lors des transports des électrons, dans certains complexes, il y a des expulsions de protons de la matrice vers l’espace inter membranaire, qui provoque une force proton-motrice. Cette dernière permet la synthèse d’ATP par le retour des protons dans le complexe V qui est le lieu de synthèse des ATP. Dans le domaine de la recherche, ce sujet est très abordé car en effet nous avons pu constater de nombreuses pathologies mitochondriales liées à un déficit de la chaine. De plus, ceci cause une instabilité sur l’ADN mitochondrial. Le but de notre travail pratique (TP) sera d’étudier des aspects du fonctionnement de la CRM. Avec l’utilisation d’un réactif de laboratoire, nous allons mettre en évidence le transfert des électrons dans la CRM. Donc, nous allons observer les différences sur l’activité de la chaine avec l’ajout de différents métabolites cellulaires.

MÉTHODES : Lors de ce TP, nous avons réalisé 3 expériences Premièrement, nous avons des cuves pour le spectrophotomètre, des micropipettes, une machine pour le bain marie pour conserver notre solution tampon qui correspond au milieu réactionnel à une certaine température (37°C), des tubes contenant les composés à étudier et un bac de glace afin de préserver nos mitochondries. D’ailleurs, nous avons utilisé un logiciel qui permet de transcrire les résultats de la spectrophotométrie, c’est Datalyse. De plus, notre spectrophotomètre est thermostaté à 37°C et il est réglé à une longueur d’onde de 600nm avec un intervalle de mesure tous les 5 secondes. Nous avons utilisé plusieurs composés lors de ces expériences. Le DCPIP (2,6-dichlorophénol indophénol) qui est un réactif de laboratoire qui peut agir comme un accepteur d’électrons, il peut exister sous 2 états. Lorsqu’il est oxydé, il apparait en bleu car il absorbe fortement dans les 600nm. Sinon lorsqu’il est réduit, ce dernier est incolore, c’est-à-dire qu’il n’absorbe pas de lumière. D’ailleurs, il se trouve au niveau du complexe III étant donné qu’il possède un potentiel redox de +0,22V (proche du potentiel redox du cytochrome c qui se trouve dans le complexe III).. Ensuite nous avons le succinate qui est un métabolite du cycle de Krebs, ce dernier est oxydé en fumarate en cédant des protons et des électrons qui seront capté par un coenzyme nommé FAD qui sera réduit en FADH2. L’enzyme de cette oxydation est le succinate déshydrogénase. Puis, nous avons le NADH qui est un coenzyme de nombreuses déshydrogénases du cytoplasme et de la matrice mitochondriale. Ce coenzyme sous forme oxydée NAD+ fixe réversiblement un proton H+ et deux électrons sur le noyau nicotinamide pour donner la forme réduite du couple NADH. Pour finir, nous avons notre fraction riche en constituants mitochondriaux obtenue à partir de foie de rat par la technique de centrifugation. Cette préparation de mitochondrie sera conservée dans de la glace tout le long du TP. Avant de commencer la première expérience afin de déterminer le temps de stabilisation. Nous devons commencer par régler initialement l’appareil à zéro (témoin blanc). C’est-à-dire, dans une cuve spectrophotométrique, nous mettons 500 𝜇𝐿 de la solution tampon seule. Ensuite, nous plaçons la cuve dans le spectrophotomètre et nous devons faire le blanc à partir du logiciel Datalyse. Pour faire entamer notre première expérience, dans une cuve de spectrophotomètre, nous introduisons dans un premier temps, 390 𝜇𝐿 du milieu réactionnel (tampon) à l’aide d’une micropipette de 1000 𝜇𝐿 et 100 𝜇𝐿 de DCPIP avec une micropipette de 200 𝜇𝐿. Ensuite, nous installons notre cuve dans le spectrophotomètre afin de vérifier la densité optique qui ne doit pas dépasser 1,5, nous constatons 1,23 dans notre cas. Par la suite, nous sortons la cuve du spectrophotomètre et nous ajoutons 10 𝜇𝐿 de la préparation de mitochondries à l’aide d’une micropipette 20 𝜇𝐿 et puis il faut homogénéiser la cuve en tapotant manuellement la cuve. Ensuite, nous replaçons directement cette dernière dans la machine et procéder à

l’acquisition avec le logiciel. Nous pourrons enfin déterminer le temps de stabilisation à partir des données collectées lors de l’acquisition sur une feuille Excel. D’ailleurs, nous arrêtons l’acquisition lorsque nous avons un alignement des points qui correspond à une stabilisation. L’expérience suivante, a pour but d’étudier l’effet du NADH. Nous avons pris à nouveau une cuve en y ajoutant 380 𝜇𝐿 du milieu réactionnel (à l’aide d’une micropipette de 1000 𝜇𝐿 ) avec 10 𝜇𝐿 de préparation de mitochondrie avec une micropipette de 20 𝜇𝐿 . Enfin, 100 𝜇𝐿 du réactif de laboratoire avec une micropipette de 200 𝜇𝐿. Par la suite, nous installons la cuve dans le spectrophotomètre afin de lancer l’acquisition et observer le temps de stabilisation déterminé dans la manipulation précédente ensuite nous mettons le logiciel en pause et nous retirons la cuve de la machine. Puis, nous rajoutons 10 𝜇𝐿 de NADH dans cette dernière et nous homogénéisons. Ensuite, nous replaçons la cuve dans la machine et ainsi continuer l’acquisition jusqu’à stabilisation de notre courbe. D’ailleurs, lorsque nous prélevons de la solution du milieu réactionnel, nous devons toujours veiller à replacer cette dernière dans le bain marie, de même pour la préparation de mitochondrie dans la glace afin que ces composés ne se dégradent pas. Pour finir, lors de la troisième expérience, où nous allons observer les effets du succinate. Nous avons pris les mêmes quantités pour le milieu réaction, la préparation de mitochondrie et de DCPIP que l’expérience 2, ensuite nous lançons l’acquisition et nous observons le temps de stabilisation. Puis, nous sortons la cuve et nous introduisions ici, 10 𝜇𝐿 du succinate à la place du NADH. Après homogénéisation, nous plaçons celle-ci directement dans le spectrophotomètre et nous continuons l’acquisition. RÉSULTATS : Expérience 1 : Détermination du temps de stabilisation

Courbe représentant absorption en fonction du temps en seconde

1,280 1,278 1,276 1,274 1,272 1,270 1,268 1,266 1,264 1,262 1,260 1,258 0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

Lors de cette expérience, nous pouvons remarquer que notre courbe est instable dans un premier temps mais qu’il se stabilise par la suite. Nous pouvons constater une diminution de l’absorbance par la présence de mitochondries, ceci peut être due par le fait que les mitochondries doivent posséder des métabolites cellulaires à basse quantité. Ce qui peut provoquer des réactions de transfert d’électrons et lorsqu’ils seront au niveau du complexe III, ils vont réagir avec le réactif DCPIP qui sera réduit. Cela explique l’instabilité de notre courbe. Lorsque les métabolites seront consommés, il n’y aura plus de transfert donc la chaine ne sera plus fonctionnelle. A partir de ce moment notre courbe va se stabiliser et nous pouvons déterminer notre temps de stabilisation. Ici, ce dernier est de 230 secondes. D’ailleurs, notre réactif n’a presque pas été réduit car nous remarquons que la solution est toujours bleue. En outre, s’il est incolore, cela signifie qu’il y a eu beaucoup de transfert d’électrons et que le DCPIP est totalement réduit.

Expérience 2 : Effet du NADH

Évolution de l'absorbance en présence de NADH 1,200

Absorbance (sans unités)

1,000

0,800

0,600

0,400

0,200

y = -0,0037x + 2,2688

0,000 0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

900,0

Temps (en secondes)

Pendant cette manipulation, après ajout de NADH, nous avons pu constater une forte baisse de l’absorbance au cours de notre expérience. Ceci est totalement cohérent puisque le NADH est un coenzyme où ses électrons seront récupérés par le complexe I, par l’action de NADH coenzyme Q réductase, par la suite NADH sera réduit en NAD+. Ce complexe permet l’expulsion de 4 protons vers l’espace inter membranaire. Ensuite, dans le complexe I, il y aura des transferts d’électrons puis au bout de ce complexe, le coenzyme Q qui sera réduit après avoir récupérés les électrons va les transporter vers le complexe III où se trouve le réactif. Ceci provoquera la réduction de DCPIP donc a une forte diminution de l’absorbance. Nous avons réalisé par la suite une pente qui se traduit par la diminution de l’absorbance avant stabilisation. Lorsque nous avons terminé cette expérience, nous avons pu constater que notre réactif était devenu incolore. C’està-dire que ce dernier était totalement réduit donc la CRM ne fonctionnait plus par l’absence de substrats et cela s’observer par la stabilisation de la courbe. Ce donneur nous prouve que par sa présence, la chaine respiratoire est active.

Expérience 3 : Effet du succinate Pour cette dernière expérience, nous pouvons observer une diminution de l’absorbance après ajout de succinate au cours du temps. Mais ceci, n’est pas plus intense que celui de l’expérience 2. Lorsque nous appliquons une pente à la courbe, nous la comparons à la précédente. Nous constatons une différence : la courbe du haut est plus marquée que celle avec du succinate. En effet, le succinate est oxydé en fumarate par l’action de la succinate déshydrogénase (réaction du cycle de Krebs). Cette dernière a la particularité d’appartenir au cycle de Krebs et à la chaine respiratoire à la fois. Cette réaction libère moins d’énergie que celui de NADH, ceci se traduit par le fait que le complexe ne participe pas à la génération de la force protonmotrice. Ici, les électrons seront captés par FAD qui va transférer ces derniers à d’autres transporteurs dans le complexe afin d’arriver au niveau du coenzyme Q qui va les transporter jusqu’au complexe III, où nous aurons le même déroulement que les électrons provenant de NADH. Tout cela, explique la baisse de

l’absorbance. A la fin de la manipulation, on a pu observer que notre cuve était presque incolore donc cela signifie que notre DCPIP était presque réduit totalement. Ainsi que pour ce donneur, il est aussi un élément important pour l’activation du fonctionnement de la CRM.

Évolution de l'absorbance en présence de succinate 1,300 1,280

Absorbance (sans unités)

1,260 1,240 1,220 1,200 1,180 1,160 1,140 1,120 y = -0,0009x + 1,4896

1,100 1,080 0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

400,0

450,0

Temps (en secondes)

230 secondes-1

-3,7.10-3 s-1 -9,0.10-4 s-1 Le temps de stabilisation commence dans les environs de 230 secondes. Lorsque nous comparons nos deux pentes, nous pouvons constater que celle du NADH est plus élevé que celle du succinate. Cela signifie que l’absorbance de NADH est plus marquée que celle du succinate. Donc nous pouvons émettre l’hypothèse que la réaction de NADH est plus rapide que celle du succinate.

DISCUSSION : Pour conclure sur ce TP, nous pouvons déduire que le succinate et le NADH sont des métabolites cellulaires indispensables au fonctionnement de la chaine respiratoire. En effet, ce sont les premiers à faire fonctionner la chaine respiratoire au niveau des 2 premiers complexes. D’après nos connaissances, cette chaîne commence lorsque les coenzymes NADH et FADH2 (ces électrons proviennent de l’oxydation du succinate) sont réduits afin de transmettre leurs électrons à des transporteurs tel que le FMN dans le complexe I avec NADH ou encore le centre fer-soufre qui se trouve dans les 2 complexes (FADH2 appartient au complexe II). Ensuite, les électrons sont récupérés par une ubiquinone (coenzyme Q) provenant des complexes I et II. Afin d’être transporté dans le complexe III où ils seront pris en charges par des cytochromes (c et b). Ces derniers seront réduits dans le but d’aussi transporter les électrons jusqu’au complexe IV. Tout ce déroulement fait fonctionner notre chaine respiratoire donc on peut déduire que les 2 substrats, vus lors de ce TP, sont nécessaires pour le fonctionnement de la chaine. Concernant, les résultats que nous avons obtenus, nous pouvons affirmer que le NADH et le succinate sont des éléments importants pour le bon fonctionnement de la CRM. De plus, lors de la comparaison des pentes pour l’expérience 2 et 3, nous avons pu constater que l’une était plus efficace que l’autre. Le NADH avait une pente plus prononcée que le succinate. Cela est dû, au couple redox de NAD+/NADH qui est moins élevé que celui de FAD/FADH2. On peut traduire cela par le fait que le NADH aura plus de capacité à céder les électrons que FADH2. En effet, nous savons que lorsque le potentiel redox est bas, cela signifie que le couple redox est réducteur, et donc apte à céder des électrons. A l’inverse, ce sera un couple redox oxydant apte à capter des électrons comme par exemple le complexe IV (E’°=0,29 -> 0,35). Ainsi, nous pouvons dire que ces deux coenzymes sont des couples redox réducteurs. Cependant, l’un est plus efficace que l’autre, ceci est prouvé par la vitesse de la réaction lors des expériences avec une différence au niveau des pentes. Ceci peut aussi expliquer la couleur de notre réactif à la fin de nos expériences, en effet celui du NADH était incolore alors que celui de succinate ne l’était pas totalement.

CONCLUSION : Ainsi, nous affirmons que les substrats vus lors de ce TP sont indispensables pour le fonctionnement de notre CRM et qu’ils ont chacun leur propre mécanisme. En effet, il ne passe pas par le même complexe et ils n’ont pas le même potentiel redox, ceci influence l’efficacité du fonctionnement de la CRM. Tout ceci a été mis en évidence grâce à la réduction du DCPIP à travers les différentes de couleurs (de bleu à incolore)....