Compte rendu TP Chaine respiratoire PDF

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Compte rendu TP...

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BOUFFIER Margaux GAUTHIER Maïlys

Séquence 5 Groupe B1

Compte Rendu Etude de la chaîne respiratoire I. Introduction

Au cours de ce TP, nous allons étudier la chaîne respiratoire, chaîne composée de quatre complexes couplé à l’ATP synthase, qui se situe dans la membrane interne des mitochondries. Les quatre premiers complexes (I, II, III et IV) sont des transporteurs d'électrons et permettent l'apport au complexe IV des électrons, provenant de la réoxydation des coenzymes NADH,H+ et du FADH2 (réduites lors du cycle de Krebs), nécessaires à la réaction : ½O2 + 2H+ → H2O (dernière étape de la respiration cellulaire). Le transport des électrons est progressif dans la chaîne respiratoire. Lors des transferts d'électrons, des H+ passent de la matrice à l'espace intermembranaire créant un gradient transmembranaire (acidification de l'espace intermembranaire = ΔpH) et une différence de potentiel membranaire (accumulation des charge postives dans l'espace intermembranaire = gradient de charges ΔΨ). La cellule va tendre vers un retour à l'équilibre entre les deux milieux et il va donc y avoir un retour des H+ dans la matrice par la sousunité F0 du complexe V et le flux de H+ engendré va activer la sous-unité F1 qui va permettre la réaction : ADP + Pi → ATP (ATP Synthase).

Phosphorylation oxydative dans la membrane interne de la mitochondrie

Lors de ce TP, nous allons étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire grâce à des mitochondries de foie de rat. Pour cela, nous étudierons la variation de la concentration en oxygène dans un milieu fermé contenant un tampon de respiration et des mitochondries suite à l'ajout de différentes solutions. Dans un premier temps, nous regarderons les effets du Succinate, de la Glutamate-malate et de l'ADP. Puis, dans un deuxième temps, nous tenterons de déterminer la nature de 4 effecteurs en observant leur effet sur la chaîne respiratoire.

II. Méthode choisie

La méthode utilisée durant ce TP est la méthode de l’oxygraphie. Elle permet, à l’aide d’un oxygraphe, de mesurer l’évolution de la concentration en oxygène du milieu en fonction du temps. Pour réaliser cette oxygraphie, nous aurons besoin de trois appareils qui sont: - une chambre à oxygraphie composée d’une cavité centrale qui comportera le tampon de respiration et les mitochondries et une autre cavité contenant de l’eau à 30 degrés qui permet aux enzymes de ne pas se dénaturer. Si l’eau était chauffée à 37 degrés (température du corps), les enzymes se dénatureraient trop rapidement et la manipulation ne serait pas fiable. - un bain marie chauffé à 37 degrés qui permettra de chauffer le tube falcon qui contient le tampon de respiration. Ce tampon a été choisi en fonction de sa pression osmotique, en effet le tampon doit avoir une pression osmotique équivalente à celle des mitochondries. L’eau pure, par exemple, qui a une pression osmotique supérieure à celle des mitochondries, les ferait explosées si on l’avait choisie comme tampon. - un traceur qui réalise des graphiques de l’évolution de la tension (100 mV pour 2 cm) en fonction du temps (1cm/min). La chambre de mesure est constituée d’un piston qui nous permettra d’injecter différents effecteurs sans mettre le milieu mesurée en présence d’oxygène (diminution de la surface de contact avec l’air). On sait que l’oxygène permet la réaction de la transformation de l’ADP en ATP, il est donc l’accepteur final de la chaîne respiratoire. Cette méthode nous permet de mesurer la consommation en oxygène et par conséquent d’observer les variations du fonctionnement de la chaîne respiratoire. Sur le traceur, plus la pente est forte, plus la consommation d’oxygène est élevée, et donc plus l’activité de la chaîne respiratoire est élevée. Les différents produits ajoutés et leurs effets théoriques sont: - Le succinate qui active le complexe II de la chaîne respiratoire. - Le glutamate-malate permettant la réoxydation du NADH et qui permet donc au complexe I de fonctionner. - L’ADP qui permet à la chaîne respiratoire de fonctionner grâce à sa transformation en ATP. On devrait donc observer, suite à l’ajout de ce produit, une consommation d’oxygène en présence de succinate ou de glutamate-malate.

- 4 effecteurs: • La roténone qui est un inhibiteur du complexe I. En théorie, si on ajoute du glutamate-malate, de la roténone et de l’ADP, la chaîne respiratoire ne devrait pas fonctionner et la consommation en oxygène devrait être nulle. • L’oligomycine qui inhibe l’ATP synthase. Si l’on met du succinate ou du glutamate-malate, de l’oligomycine et de l’ADP, la chaîne respiratoire ne devrait pas fonctionner et la consommation en oxygène devrait être nulle. • Le CICCP qui est un agent découplant, c’est-à-dire qu’il découple les quatre premiers complexes de la chaîne respiratoire de l’ATP synthase. Il permet aux protons de rentrer dans la mitochondrie sans production d’ATP. Si l’on ajoute de l’oligomycine, de l’ADP et du CICCP, la chaîne respiratoire fonctionne sans formation d’ATP et il y a donc bien consommation d’oxygène au niveau du complexe IV. • L’antimycine A est un inhibiteur d’un complexe de la chaîne respiratoire.

III. Résultats et interprétations

Pour chacun des tracés suivants (tracés 1 à 5), nous avons, avant l'ajout des différents produits, du tampon de respiration (1,5 mL) et une suspension de mitochondries (10 ou 15 μL ) dans la chambre à oxygraphie.

→ Première partie : effet de différents produits sur la chaîne respiratoire

a. Tracé 1 Pour ce tracé, nous avons ajouter 10 μL de succinate puis 2 x 8 μL d'ADP. → Analyse de la courbe Avant l'ajout de Succinate, on voit qu'il y a diminution du courant électrique, correspondant à une consommation de O2 et donc au fonctionnement de la chaîne respiratoire. Cet activation de la chaîne est possible par la consommation des métabolites endogènes du cycle de Krebs qui ont été apportés avec les mitochondries dans la chambre à oxygraphie. Après l'ajout du succinate, on voit qu'il y a augmentation de la consommation d'O2 et donc de l'activité de la respiration cellulaire (se traduisant sur le graphique par une pente plus élevée) : le succinate se transforme en furamate au niveau du complexe II, cette réaction est couplé à la réduction du FAD+en FADH2. Le complexe II va réoxyder le FADH2 en FAD+, il y aura ainsi libération de 2 électrons qui seront transmis par le billet des coenzymes et des complexes II et III au complexe IV où l'O 2 sera réduit. Le complexe I n'est, ici, pas utilisé. Quand on ajoute de l’ADP, la consommation d’oxygène augmente fortement car l’ATP synthase fonctionne (ADP est transformé en ATP). On sait que cette réaction est liée à l’entrée des protons dans la mitochondrie. Le gradient électrochimique diminue donc entre l’espace intermembranaire et la matrice. Les protons rentrent dans

la matrice et réoxydent le FADH2, par conséquent la chaîne respiratoire fonctionne (3 complexes + ATP synthase). On observe ensuite que la consommation d’oxygène redevient équivalente à celle d’avant l’ajout d’ADP, car tout l’ADP que l’on a ajouté a été consommé par la phosphorylation oxydative. On observe la même chose pour le 2ème ajout d'ATP. → Calcul de RCR et d'ADP/O Le RCR est le rapport entre la pente mesurée après l’addition d’ADP sur la pente après épuisement de l’ADP. RCR = pente A / pente B =(dA/dF)/(dB/dF) avec pente A = (yB1 – yA1) / (xB1-xA1) et pente B = (yB2 – yA2) / (xB2 – xB2) AN: RCR= ( (400-520)/(8-7) ) / ( (610-650)/(6-5) ) =3 Le rapport ADP/O correspond au nombre d’ATP synthétisés par atome d’oxygène réduit. On sait que l'ADP que l'on ajoute dans la chambre va être entièrement consommé, en calculant ninitial, on a donc nconsommé : n=cV Le volume est donné dans le fascicule (8 μL=8x10 L) ainsi que la concentration ( 20 mM=20x10-3 M ) AN: n = 20x10-3 * 8x10-6 = 1,6x10-7 mol d’ADP consommée. -6

Pour l'oxygène consommé, nous allons calculer l'O2 initial puis l'O2 final et nous allons les soustraire afin d'avoir la quantité d'oxygène consommé. ✗ Quantité d’O2 initiale: A 30 degrés, il y a 460x10-9 moles d’oxygène dissous par mL de tampon.Pour ce tracé, on ajoute 1,5 mL de tampon de respiration, 10 µL de suspension de mitochondries et 10 µL de succinate on a donc 1,52 mL de solution. Par un produit en croix, on obtient : nO2 initial = 460x10-9 * 1.52/ 1 = 6,992*10-7 mol. ✗ Quantité d’O2 finale: pour définir la quantité d’O2 finale, nous avons tout d'abord défini sur l'axe des ordonnées la quantité d'O2 en pourcentage (en rouge) et le pourcentage d'O2 restant correspond à l’intersection entre la tangente à la courbe après l’ajout d’ADP n°2 et celle lorsque la consommation d’O 2 redevient la même

qu’avant l’ajout d’ADP n°2. On admet que le 0% de la courbe correspond au 0 de la feuille car nous n’avons pas la courbe nécessaire pour le déterminer. D’après la courbe, la quantité d’O2 finale est de 38,51%, par rapport au 100% initial. Par un produit en croix, nous pouvons définir la quantité finale d’O 2 en moles: nO2 final = 6,992x10-7 * 38.51 / 100 = 2,69x10-7 mol D’où la quantité d’O2 consommée suivante (quantité initiale – quantité finale) AN: nO2 consommée = 6.992x10-7 – 2.69x10-7 = 4,302x10-7 mol On peut alors définir le rapport ADP/0 : AN: ADP/O = 1.6x10-7 / 4.302x10-7 = 0.37 Pour notre tracé 1, on a donc 0.37 ATP synthétisé pour un atome d’oxygène.

b. Tracé 2 Pour ce tracé, nous avons ajouter 10 μL de glutamate-malate puis 2 x 8 μL d'ADP. → Analyse de la courbe Avant l’ajout de glutamate-malate, on observe une augmentation de la consommation d’oxygène, ce qui s’explique par la consommation des métabolites endogènes du cycle de Krebs qui ont été apportés avec les mitochondries dans la chambre à oxygraphie.. Quand on ajoute du glutamate-malate, il y a une augmentation de la consommation d’oxygène, on a donc une activation de la chaîne respiratoire : le complexe I s’active. En effet, dans le cycle de Krebs, le malate permet la réduction du NAD+ en NADH, car c’est une coenzyme qui agit dans sa transformation en oxaloacétate. Le NADH formé est ensuite amener au niveau de la membrane interne de la mitochondrie grâce au glutamate, qui a le rôle, ici, de navette entre le cycle de Krebs et la respiration. Le NADH sera ensuite réoxydé en NAD+ au niveau du complexe I et libérera ainsi 2 électrons qui permettront la consommation d'O2. L’ajout d’ADP provoque une augmentation plus forte de la consommation d’oxygène car l’ATP synthase fonctionne. Les protons rentrent donc dans la matrice pour réoxyder le NADH , la chaîne respiratoire fonctionne (3 complexes + ATP synthase). La consommation d’oxygène redevient ensuite équivalente à celle d’avant l’ajout d’ADP, car tout l’ADP que l’on a ajouté a été

consommé par la chaîne respiratoire. Nous obtenons les mêmes observations pour le 2ème ajout d'ADP. → Calcul de RCR et ADP/O Le RCR est le rapport entre la pente mesurée après l’addition d’ADP sur la pente après épuisement de l’ADP. RCR = pente A / pente B avec pente A = (yB1 – yA1) / (xB1-xA1) et pente B = (yB2 – yA2) / (xB2 – xB2) AN: RCR = ((560-660) / (5,8-4,8)) / ((720-750) / (3,8-2,8)) = 3,33 Le rapport ADP/O correspond au nombre d’ATP synthétisés par atome d’oxygène réduit. On sait que l'ADP que l'on ajoute dans la chambre va être entièrement consommé, en calculant ninitial, on a donc nconsommé : n=cV Le volume est donné dans le fascicule (10 μL=8x10 L) ainsi que la concentration ( 20 mM=20x10-3 M ) AN: n = 20x10-3 * 10x10-6 = 2 x10-7 mol d’ADP consommée. -6

Pour l'oxygène consommé, nous allons calculer l'O2 initial puis l'O2 final et nous allons les soustraire afin d'avoir la quantité d'oxygène consommé. ✗ Quantité d’O2 initiale: A 30 degrés, il y a 460x10-9 moles d’oxygène dissous par mL de tampon.Pour ce tracé, on ajoute 1,5 mL de tampon de respiration, 15 µL de suspension de mitochondries et 10 µL de succinate on a donc 1,52 mL de solution. Par un produit en croix, on obtient : nO2 initial = 460x10-9 * 1.525 / 1 = 7,01x10-7 mol. ✗ Quantité d’O2 finale: pour définir la quantité d’O2 finale, nous avons, comme pour le tracé 1, tout d'abord défini sur l'axe des ordonnées la quantité d'O2 en pourcentage (en rouge) et le pourcentage d'O2 restant correspond à l’intersection entre la tangente à la courbe après l’ajout d’ADP n°2 et celle lorsque la consommation d’O2 redevient la même qu’avant l’ajout d’ADP n°2. On admet que le 0% de la courbe correspond au 0 de la feuille car nous n’avons pas la courbe nécessaire pour le déterminer. D’après la courbe, la quantité d’O2 finale est de 63,35%, par rapport au 100% initial. Par un produit en croix, nous pouvons définir la quantité finale d’O 2 en moles: nO2 final = 7,01x10-7 * 63.35 / 100 = 4,44x10-7 mol D’où la quantité d’O2 consommée suivante (quantité initiale – quantité finale) AN: nO2 consommée = 7,01x10-7 – 4,44x10-7 = 2,57*x10-7 mol On peut alors définir le rapport ADP/0 : AN: ADP/O = 2x10-7 / 4,44x10-7 = 0.78

Pour notre tracé 2, on a donc 0.78 ATP synthétisé pour un atome d’oxygène. c. Comparaison des résultats Les deux RCR sont similaires (3 et 3,33). Le RCR indique l’intensité du couplage entre la respiration et la phosphorylation. Plus le RCR est élevé, plus le couplage entre la respiration et la phosphorylation est grand. Nos RCR sont faibles, cela peut s’expliquer par des dommages mécaniques lors de l’isolement des mitochondries. Les rapports d’ADP/O sont différents avec celui du tracé n°2 supérieur à celui du tracé n°1 (0.78 > 0.37). On peut donc dire que l’utilisation du complexe II, donc du succinate, par la chaîne respiratoire produit plus d’ATP que lorsqu’elle utilise le complexe I par l’intermédiaire de la réduction du NADH. → Deuxième partie : Identification des différents effecteurs a. Tracé 3 Grâce à ce tracé, nous allons pouvoir déterminer la nature des inhibiteurs Jaune et Vert. L'ajout de Succinate (10 μL) permet la mise en marche de la chaîne respiratoire (par l'intermédiaire du complexe II). Comme pour le tracé 1, le complexe I n'est pas ici mis en jeu. On ajoute ensuite l'effecteur jaune et il n'y a pas de modification de la pente, la consommation d'O2 reste la même : l'effecteur jaune n'a donc pas bloqué la transformation de succinate en furamate, il n'a donc pas d'effet sur le complexe II. Par contre, lorsque l'on ajoute de l'ADP (8 μL) , la consommation d' O2 n'accélère pas comme précedemment (cf tracé n°1 de "Première partie a.") : l'effecteur a donc un effet sur la transformation d'ADP en ATP : c'est un inhibiteur de l'ATP Synthaxe, l'Oligomycine. On ajoute ensuite 8 μL d'effecteur vert : la consommation d'O2 accélère, signifiant que l'activité de la chaîne respiratoire augmente : l'effecteur vert a permis aux complexes transporteurs d'électrons de se passer du complexe V (toujours inactivé par l'oligomycine): il s'agit donc d'un agent découplant qui permet de découpler l'action de la chaîne des transporteurs d'électrons de l'ATP synthase par la création de canaux H+, il s'agit donc du CICCP.

b. Tracé 4 Ce tracé va permettre d'identifier les deux derniers effecteurs : les agents Rouge et Bleu.

Nous commençons l'expérience par l'ajout de Glutamate-Malate (10 μL) dans la suspension de mitochondries, qui va donc activer la chaîne respiratoire à partir du complexe I (pas d'implication du complexe II). Après l'ajout de l'effecteur rouge (2 μL), il y a une diminution de la consommation d'O 2 : l'effecteur à donc un effet inhibiteur sur le complexe I, le complexe III ou le complexe IV (car les réactions en chaîne aboutissant à la réduction de l'O2 nécessite ces trois complexes). L'ajout d'ADP (10 μL) n'apporte aucun changement au

graphique, ce qui est normal car un complexe de la chaîne étant bloqué, l'ajout d'ADP ne change rien à la consommation d'O2 . Afin de savoir sur quel complexe agit l'effecteur rouge, on ajoute du succinate (10 μL ; permettant l'activation du complexe II) : si il y a respiration, les complexes III et IV fonctionnent (car ils sont utilisés dans le transfert des électrons du complexe II au complexe IV), sinon le complexe I fonctionne normalement et l'effecteur rouge agit sur le complexe III ou IV. Sur le graphique, on voit qu'après l'ajout de succinate la respiration a lieu : les complexes III et IV fonctionnent donc normalement et c'était donc le complexe I qui a été inhibé par l'effecteur rouge : la Roténone. On ajoute ensuite l'effecteur bleu dans la chambre à oxygraphie (4 μL) : l'activité de la chaîne respiratoire diminue, l'effecteur a donc un effet inhibiteur sur le complexe II, III ou IV : c'est l'Antimycine A. Le TMPD est un agent permettant de donner des électrons directement au complexe IV (pas besoin de passer par les autres complexes de la chaîne respiratoire). L'Ascorbate va nous permettre de réduire le TMPD afin qu'il reste sous sa forme oxydé, il va ainsi fournir au complexe IV des électrons sans quantité limité. On va alors pouvoir tester si l'effecteur bleu agit sur le complexe IV. En effet, si c'est le complexe IV qui est inhibé, l'ajout de TMPD et d'Ascorbate n'aura pas d'influence sur l'allure de la courbe car le complexe IV, inhibé, ne pourra pas utiliser les électrons fournis par le TMPD. Au contraire, si la respiration se remet en route, cela signifie que le complexe IV fonctionne. D'après le graphique, il est très net que la pente augmente après l'ajout de TMPD + Ascorbate (10 μL de chaque), on a donc reprise de la respiration : le complexe IV fonctionne, on en déduit donc que l'effecteur agit sur le complexe II ou III, sans pour autant pouvoir définir lequel spécifiquement. Nous allons donc établir une expérience afin de déterminer clairement quel complexe est inhibé. c. Tracé 5 Nous avons établi la démarche suivante afin de déterminer sur quel complexe agit l'effecteur bleu : - On va d'abord ajouter 10 μL de Glutamate-Malate dans la chambre avec tampon de respiration + mitochondries. L'apport du GlutamateMalate va permettre l'activation de la chaîne respiratoire par le complexe I. - Ensuite, on ajoute 4 μL d'effecteur bleu. Si on observe une consommation d'O2 , c'est que le transfert d'électrons du complexe I au complexe IV a eu lieu, c'est-à-dire que les électrons sont passés par le complexe III et que ce dernier est fonctionnel. Si, à l'inverse, on ne voit pas d'augmentation de la valeur de la pente, il n'y a pas activation de la chaîne car le complexe III, inhibé, n'a pas pu transmettre les électrons au complexe IV et donc l'effecteur serait un inhibiteur du complexe II. Même si la variation de consommation d'O2 est faible, on voit sur le graphique que la pente après l'ajout de l'antimycine A est plus faible que la valeur de la pente avant son ajout : il y a donc une diminution de l'activité de la chaîne respiratoire, l'antimycine A est donc un inhibiteur

du complexe III. - Afin de vérifier et confirmer l'action de l'inhibiteur sur le complexe III, on ajoute 10 μL de succinate au milieu. Nous n'observons aucune variation de la consommation d'O2 , notre conclusion quant à la fonction de l'effecteur est confirmée car le complexe II fonctionne mais le complexe III ne transmet pas les électrons. On peut, grâce à cette expérience, montrer que l'Antimycine A est l'inhibiteur du complexe III.

IV.Conclusion

Ce TP nous a permis de comprendre le fonctionnement de la phosphorylation oxydative grâce à des expériences simples. Nous avons donc vu qu'il existe 2 voies pour le transfert des électrons dans la chaîne des transporteurs d'électrons et que celle passant par le complexe II est plus efficace que la première (ADP/O plus élevée). La respiration est également couplé avec la synthèse d'ATP qui permet le bon fonctionnement de la chaîne respiratoire : l'intensité de ce couplage est équivalent quelle que soit la voie d'électrons empruntée. Nous avons aussi déterminer facilement la nature des effecteurs inconnus en observant les variations qu'ils engendrent sur la consommation d'ATP, en présence de tel ou tel substrat....