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Compte rendu TP...

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Mathieu DESCOMBES Chloé DIDIER

Groupe B Année 2013/2014

Enzymologie et métabolisme ETUDE CINETIQUE ET DETERMINATION DU pH OPTIMUM DE LA PHOSPHATASE ALCALINE But du TP: Le but de ce TP est d'étudier l'activité de la phosphatase alcaline lorsque l'on fait varier différents facteurs comme la concentration en substrat et le pH.

Principes : La phosphatase alcaline est une enzyme catalysant l’hydrolyse des monoesters phosphoriques pour former un phosphate minéral et un alcool ou un phénol en fonction de la réaction. La réaction de la phosphatase alcaline est la suivante : R-O-PO3²- + H2O => R-OH + HPO4²Au cours de ce TP, nous étudions l’influence de plusieurs facteurs sur la réaction enzymatique. On suit la réaction en dosant les produits qui apparaissent dans le milieu lorsque l’enzyme est mise en présence de substrat. Le substrat, p-nitrophényl phosphate (PNPP), est incolore et donne, lorsqu’il est hydrolysé, du p-nitrophénol (pNP), jaune en milieu alcalin, dosable directement par spectrophotométrie à 410 nm. On fait alors une gamme étalon qui nous permet de connaître la relation entre la quantité de pNP et la DO, puis on fait une dilution qui nous sert à déterminer l’évolution de la concentration au cours du temps lorsque l'on met ses différentes solutions dans des milieux d’incubations identiques. Pour finir, on met des solutions de Tris-HCL à 0.1 M à différents pH dans des milieux d’incubation identiques pour déterminer le pH optimum de la phosphatase alcaline.

Méthode : 1. Une gamme étalon à pH8.3 : Le zéro optique est fait avec l’air, et on mesure ensuite l’absorbance des six tubes (G1 à G6) contenant des volumes croissants de pNP à 0,5 mM ( 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,15 et 0,2 mL). Le changement d’absorbance est directement proportionnel à la quantité de PNP dans la cuve. On y ajoute aussi du tampon Tris-HCL pH 8,3 servant à maintenir l’enzyme à un pH optimal pour son fonctionnement, du ZnCl2 0,6 mM, l’ion Zn2+ étant un co-facteur important pour le bon fonctionnement de l’enzyme, et de l’eau. Cette gamme étalon permet de tracer la droite Abs410nm= f([pNP]) et de déterminer le coefficient d’extinction molaire.

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2. Solutions à différentes concentration en substrat : A partir d'une solution mère de PNPP à 5 mM, on souhaite réaliser des solutions de plus en plus diluées. On veut 6 solutions filles contenant des concentrations différentes en PNPP: 2.5 mM, 1 mM, 0.5 mM, 0.25 mM et 0.125 mM. On procède par des dilutions en cascade. Ensuite on prépare 7 tubes numérotés de S1 à S7 contenant tous 1,5 mL de tampon Tris-HCL pH 8.3, 0.5 mL de ZnCl2 à 0.6 mM et 1 mL d'eau distillée. On ajoute ensuite 0.5 mL du tube 0.125 mM dans le tube S1 en allant jusqu'à 5mM dans le tube S7. On fait alors incuber les tubes à 37°C pendant 5 minutes. On prélève ensuite 1.75 mL de cette solution pour la placer dans une cuve spéciale pour spectrophotomètre. Au dernier moment, on ajoute 0.25 mL de solution enzymatique et on mélange rapidement avant de mesurer les variations de DO à 410 nm toutes les 10 secondes durant 3 minutes à l’aide du spectrophotomètre. Ces mesures permettent de tracer les cinétiques sous la forme Abs410nm=f(temps) et de déterminer les vitesses initiales des 7 réactions. 3. Solutions à différents pH On a besoin 4 milieu réactionnel contenant l’eau, ZNCl2 et le tampon tris-HCl à 0.1M comme précédemment mais avec 4 pH différents : 7,0 ; 7,5 ; 8,3 et 9,0. On réalise de nouveaux des cinétiques en mesurant la DO à 410nm toutes les 10 secondes. Ces mesures permettent de tracer les cinétiques sous la forme Abs410nm=f(temps) et de déterminer les vitesses initiales des 4 réactions.

Calculs : 1. Gamme étalon et coefficient d’extinction molaire. Calcul de la quantité de pNP dans les tubes de la courbe étalon, pour le tube G2 : nPNP = Vprélevé x [PNP]prélevé = 0,025.10-3 x 0,5.10-3 = 1,25 x 10-8 moles [PNP]dans la cuve = nPNP/Vcuve = 1,25.10-8/2.10-3 = 6,25 x 10-6 M = 6,25 ϤM Les autres résultats se trouvent dans le tableau 1 de la feuille annexe. Le coefficient d'extinction molaire (ε) est le rapport entre l'absorbance et la concentration d'une entité chimique absorbante dans ce milieu. ε = D.O / l × c avec D.O l’absorbance lue, l le trajet optique (1cm) et c la concentration en pNP On a ε = ΔDO / Δ [PNP] D’où ε = (0,85 – 0,43) /( 50 - 25)= 0.0168 ϤM-1.cm-1

2. Vitesse initiales de réaction en fonction des concentrations en pNPP Calcul des concentrations de pNPP, pour le tube S1 : [PNPP]i = 5mM Vprélevé = 0,5 mL Vtotal = 3,5 mL [PNPP] tube S1 = ([PNPP]i x Vprélevé)/ Vtotal = (5 x 0,5) / 3,5 = 0,71 mM Puis, on calcule la concentration de pNPP finale dans la cuve de spectrophotomètre.

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Vprélevé = 1,75 ml Vtotal cuve = Vprélevé + Venzyme = 1,75 + 0,25 = 2 mL [PNPP]finale dans cuve S1 =([PNPP]tube s1 x Vprélevé) / Vtotal cuve=(0,71 x 1,75) / 2 = 0,62 mM Et d’après la Loi de Beer-Lambert : Δ DO = ε x l x Δ C Si l’on divise les termes par Δt nous obtenons : pente = ε x 1 x ΔC/Δt Ainsi ΔC/Δt = pente / ε = 0.0083/0.0168 = 0.49 ϤM / min = v Pour le tube S1, on a v =0.49 ϤM.min-1 Le milieu réactionnel est de 2 mL, on peut donc calculer la vitesse en Ϥmol.min-1 On a donc v= 0.49 x 2 = 0.98 Ϥmol.min-1 Les autres résultats se trouvent dans le tableau 2 de la feuille annexe.

3. Michaelis Menten Grâce aux tangentes des différentes courbes d’apparition du pNP en fonction des différentes concentrations de PNPP et du temps (voir courbe n°2) on a pu remplir le tableau 2 de la feuille annexe grâce aux calculs présentés précédemment. On a donc pu tracer la courbe n°3 de cinétique de Michaelis et Menten représentant les vitesses initiales en fonction des différentes concentrations de substrat. Grâce à cette courbe on peut estimer de manière peu précise les valeurs de Km et Vm. Vmax ≈ 1 Ϥmol.min-1 (asymptote de l’hyperbole) Km = 0.042 ϤM (Correspondance en abscisse de Vmax/2) La difficulté vient du fait que la détermination graphique d'une asymptote est une chose imprécise, entachant d'erreur la détermination de la Vmax et du Km. Pour vérifier et préciser ces estimations on utilisera 2 méthodes de linéarisation 4. Linéarisation : Afin d’obtenir des paramètres cinétiques le plus précis possibles : -Lineweaver Burk ou double inverse Dans le tableau 2 en annexe on a calculé les valeurs inverses 1/[PNPP] et 1/v On a pu donc tracer en annexe 4 la courbe de Lineweaver Burk représentant 1/v = f(1/[PNPP]) On a représenté sur la courbe les points important afin de déterminer Km et Vm. Ici -1/Km = 46,37 on a donc Km=0,021 ϤM Et 1/Vm=1,17 on a donc Vm=0,85 Ϥmol.min-1 -Hanes Woolf Dans le tableau 2 en annexe on a calculé les valeurs de [PNPP]/v On a pu donc tracer en annexe 4 la courbe de Hanes Woolf représentant [PNPP]/v = f([PNPP]) On a représenté sur la courbe les points important afin de déterminer Km et Vm. Ici -Km= -0,035 ϤM on a donc Km= 0,035 ϤM 3

Grâce à la pente de la droite on détermine 1/Vm=1.15 on a donc Vm=0,86 Ϥmol.min-1 Les valeurs de Vm sont extrêmement proche, on fera la moyenne des deux valeurs de linéarisation pour la valeur de Vm soit Vm = 0,855 Ϥmol.min-1 Les valeurs de Km sont sensiblement plus éloignées on utilisera donc aussi la moyenne soit Km= 0,028 ϤM 5. Activité de la phosphatase Alcaline Nous avons prélevé 0,25 mL de solution enzymatique de concentration 0,10 mg/mL. La masse d’enzyme prélevée est donc mPA = 0,25 x 0,10 = 2,5 x 10-2 mg L'activité spécifique est la quantité de substrat transformée par minute et par mg d'enzyme: As = Vm / mPA = 0,855/2,5 x 10-2 = 34,2 Ϥmol.min-1.mg-1 = 34,2 U.mg-1 Activité spécifique moléculaire : le Kcat On sait que la masse molaire de l’enzyme est de MPA =80 kDa = 80000 Da = 80000 g.mol-1 Donc nPA=mPA / MPA = 2,5 x 10-2 /80000 = 3,125 . 10-7mol On peut donc calculer la concentration en enzyme dans la cuve [PA]= nPA / Vtotal = 3,125 . 10-7 / 2.10-3 = 1,56 . 10-4 mol.L-1 On sait que Vmax = kcat x [PA] donc, Kcat = (Vmax ) / [PA]= 0,855 / 1,56 . 10-4 = 5,47.10-3 s-1

6. Détermination du pH optimum On a mesuré l’absorbance pour 4 tampons à 4pH différents. Les résultats sont représentés dans le graphique n°5 de l’absorbance à 410nm en fonction du temps selon les 4 pH. On a pu calculer grâce aux pentes des courbes à l’origine, les vitesses initiales selon tous les pH comme on a pu le faire précédemment durant ce TP. (voir point 2) On utilise le même ɛ que précédemment. Les résultats sont compilés dans le point 3 de la fiche annexe. Avec ces résultats on a pu tracer la courbe de la vitesse en fonction du pH. Ici la vitesse de réaction semble augmenter avec le pH.

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Interprétations : 1. Gamme étalon : Les courbes obtenues possèdent toutes la même forme : elles débutent linéairement puis elles s'affaissent petit à petit avec le temps : c’est une forme hyperbolique. On peut remarquer que plus la concentration en substrat augmente et plus la pente de la courbe à l’origine augmente. Ce qui signifie que la concentration en substrat à un effet sur la vitesse de réaction. En effet, un nombre important de molécules de substrat va induire une saturation plus rapide des sites de fixation de l’enzyme. 2. Courbe des 7 concentrations de substrat : On a la variation d’absorbance en fonction du temps ce qui correspond à la vitesse d’apparition du produit pNP. Toutes ces courbes ont une partie linéaire et les valeurs des pentes nous donnent la vitesse initiale de la réaction. On remarque que plus on augmente la concentration en substrat, plus la pente augmente. On peut en déduire qu’on a une augmentation de la vitesse initiale. Cela peut être du au fait que plus la concentration en substrat est élevé, plus l’enzyme a de chance de rencontrer le substrat. On n’atteint pas ici de concentration de substrat saturante. On peut faire l’hypothèse que si on augmente encore la concentration en substrat la vitesse de réaction continuerait à croitre. 3. Michaelis Menten : Les déterminations ne sont pas précises : Vm se lit en théorie pour des valeurs infinies de substrat (la courbe doit être linéaire ce qui est rarement le cas en conditions expérimentales). Comme Vm n’est pas déterminée avec précision, donc Km ne peut pas l’être non plus. On a tout de même pu estimer les deux valeurs. (voir tableau ci-dessous) 4. Lineweaver Burk et Hanes Woolf : Une droite est préférable car elle est plus facile à manipuler qu'une hyperbole. Elle nous donne une estimation plus directe et plus précise de la valeur de Vmax et Km comparé à la relation de Michaelis-Menten, très approximative. Cependant les valeurs sont tout de même non précises car on prolonge la droite et on utilise une courbe moyenne trop subjective autour des points expérimentaux. Il faudrait utiliser un logiciel informatique pour avoir la tendance moyenne exacte et une pente plus précise. On a pu grâce à ces linéarisations observer Km et Vm (voir tableau ci-dessous) Les valeurs ne sont pas exactes car elles sont le fruit de plusieurs approximations lors de la mesure de l’absorbance, lors du traçage des droites ou encore lors du calcul des pentes. Elles sont tout de même du même ordre de grandeur ce qui est rassurant. Michaelis menten Lineweaver Burk Hanes Woolf Valeur choisie Vmax (Ϥmol.min-1) 1 0.85 0.86 0.855 Km (ϤM) 0.042 0.021 0.035 0.028

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5. Dépendance au pH : La vitesse de réaction semble croitre avec le pH de la solution. Plus le pH est basique et plus la vitesse augmente. Il aurait peut être été alors préférable d’utiliser un tampon à pH=9 plutôt que 8,3 pour l’expérience précédente. Il faudrait tenter l'expérience avec un pH supérieur à 9 afin de voir si 9 est le pH optimal ou s’il en est un autre.

Conclusion : L’activité enzymatique dépend de plusieurs facteurs, comme la nature de l’enzyme, du substrat, la constante d’affinité, la concentration initiale de substrat, la concentration de l’enzyme, le pH... Ce dernier facteur de pH est une des causes de la compartimentation cellulaire: à l’intérieur des compartiments cellulaires règne en général un pH qui leurs est propre, ils sont en général le siège d'activités enzymatiques différentes impliquant des enzymes différentes et qui fonctionnent à un certain pH idéal, comme expliqué précédemment. La concentration initiale en substrat est également un facteur faisant varier l’activité enzymatique: à une certaine concentration dite «saturante» de PNPP, toutes les phosphatases sont actives et l’activité enzymatique est alors à son maximum.

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