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FLON Mégane FLON Laura L2 Chimie-Biologie

Expérimentation en biochimie Compte rendu final Sebastien Buchoux

Table des matières TP1 – Dosage de protéines

p.1

TP2 – Dosage HPLC et dosage enzymatique

p.19

TP3 – Dosage et séparation des sucres

p.34

TP4 – Séparation de protéines par exclusion stérique

p.40

TP5 – Séparation d'acides gras par CPG

A noter : tous les graphiques et tableaux de valeurs présents dans ce document ont été créés avec Open Office Calc. Ces fichiers de valeurs seront joint à ce document.

TP1 - Dosage de protéines Introduction : Le but de ce TP est de comparer différentes méthodes de dosage de protéines : la méthode de Folin-Lowry, la méthode de Bradford et la méthode UV (spectrophotométrique) ; tout en déterminant la teneur en protéine de différents produits ou tissus (jambon, pomme, yaourt et pain de mie). Nous déterminerons également la concentration en protéine d'une solution X afin de comparer les résultats avec les différentes méthodes.

Manipulation : Tout d'abord il est nécessaire de connaître la concentration en protéines de notre gamme étalon. Pour cela nous utilisons le calcul suivant : Cfinale=

Cinitiale x Vinitial Vfinal

Avec Cinitiale = 1,0 g/L (solution de sérum albumine BSA) Vinitial = volume de solution de sérum albumine prélevé (en mL) Vfinal = le volume final de la solution fille (en mL) Cfinale = la concentration de la solution fille (en g/L) Exemple : calcul pour 1,5 mL de protéines et 2,5 mL

Cfinale=

1,0 × 1,5 1,5 = =0,375 g / L (1,5+2,5) 4

On obtient les valeurs suivantes : Solution de protéine Standard (mL)

NaCl 9 (mL)

Concentration en protéines (g/L)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 4,0

4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,0

0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

De plus, il nous faut noter la masse des différents extrait. On a : m(jambon) = 1,00 g m(PDM) = 1,00 g m(pomme) = 1,00 g m(yaourt) = 1,00 g 1

Dosage UV → Données propres On réalise un balayage spectrale de la solution la plus concentrée de notre gamme afin d'obtenir la valeur de λmax, qui sera notre la longueur d'onde à laquelle nous lirons l'absorbance de notre gamme et des échantillons. On a λmax = λobs = 280 nm On lis l'absorbance de notre gamme afin de pouvoir tracer une courbe d'étalonnage, on obtient les valeurs et la courbe d'étalonnage suivantes : Concentration en protéines (g/L) Absorbance 0,000

0,000

0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

0,056 0,112 0,169 0,257 0,302 0,378 0,503

Courbe d'étalonnage de la méthode UV 0,6

f(x) = 0,518x - 0,014 R² = 0,997

Abs orbance

0,5 0,4

Absorbance UV

0,3

Linéaire (Absorbance UV)

0,2 0,1 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en protéines (g/L)

Afin de déterminer la concentration en protéines de la solution X et de nos échantillons, nous lisons l'absorbance de ceux-ci. Les échantillons doivent être dilués afin que la valeur de l'absorbance lue soit comprise dans notre gamme étalon ci-dessus. (dilution : par 40 du jambon / par 9 de la pomme / par 10 du yaourt / par 30 du pain de mie)

2

Nous obtenons les valeurs suivantes : Solution

Absorbance

Solution X Jambon dilué x40 Pomme dilué x9 Yaourt dilué x10 Pain de mie dilué x30

0,231 0,499 0,454 0,477 0,488

►Calculs Avec ces valeurs d'absorbance et l'équation de la droite de régression nous pouvons déterminer la concentration en protéine de nos échantillons dilués (et ainsi connaître celle de nos échantillons purs) et la concentration de la solution X. Absorbance =0,518×Concentration−0,014 →

Concentration(solution X )=

Concentration=

Absorbance+0,014 0,518

0,231+0,014 =0,473 g / L 0,518

Concentration( Jambon dilué X40)=

0,499+0,014 =0,990 g / L 0,518

Concentration( Jambon)=Concentration (Jambon dilué X40 )×40=0,990×40=39,600 g / L

Concentration(Pomme dilué X9)=

0,454+0,014 =0,903 g / L 0,518

Concentration( Pomme )=Concentration(Pomme dilué X9)×9=0,903×9 =8,127 g / L

Concentration(Yaourt dilué X10)=

0,477 +0,014 =0,948 g / L 0,518

Concentration(Yaourt )=Concentration(Yaourt dilué X10 )×10=9,480 g / L

Concentration(PDM dilué X30)=

0,488+0,014 =0,969 g / L 0,518

Concentration(PDM )=Concentration(PDM X30 )×30=0,969×30=29,07 g / L

3

→ Données brutes

Concentration en protéines (g/L)

Absorbance

0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

0,000 0,090 0,176 0,203 0,301 0,339 0,383 0,533

Courbe d'étalonnage de la méthode UV 0,6

f(x) = 0,487x + 0,037 R² = 0,988

0,5

Abs orbance

0,4

Absorbance UV

0,3

Linéaire (Absorbance UV)

0,2 0,1 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en protéines (g/L)

L'échantillon doit être dilué afin que la valeur de l'absorbance lue soit comprise dans notre gamme étalon ci-dessus. Une dilution par 20 paraît suffisante. Nous obtenons les valeurs suivantes :

Solution Échantillon Solution X Échantillon dilué x10 Échantillon dilué x20

Absorbance 3,000 0,171 0,739 0,443

HORS GAMME HORS GAMME

4

►Calculs Absorbance =0,487×Concentration+0,037 Concentration( solution X )=

→ Concentration=

Absorbance−0,037 0,487

0,171−0,037 =0,275 g / L 0,487

Concentration(échantillon dilué X20 )=

0,443−0,037 =0,834 g / L 0,487

Concentration( échantillon )=Concentration(échantillon dilué X20 )×20=0,834×20=16,680 g / L

Comparaison des données propres et des données brutes : Pour la solution X nous obtenons avec les données propres une concentration en protéines égale à 0,473 g/L alors qu'avec nos données brutes nous avons une concentration égale à 0,275 g/L. Pour notre échantillon, c'est-à-dire le jambon, nous obtenons avec les données propres une concentration en protéines égale à 39,600 g/L alors qu'avec nos données brutes nous avons une concentration égale à 16,680 g/L. Il y a une énormes différence entre ces valeurs (rapport d'environ 2 entre les valeurs brutes et les valeurs propres). Celles-ci peuvent être dues à la qualité de notre échantillon, à des pertes lors de la manipulation ou encore à la dilution utilisée.

5

Dosage Folin-Lowry → Données propres Concentration en protéines (g/L) 0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

Absorbance Lowry 0,000 0,426 0,607 0,739 0,824 0,912 0,988 1,114

Courbe d'étalonnage de la méthode Lowry 1,2

f(x) = 0,760x + 0,408 R² = 0,960

Abs orbance

1 0,8

Absorbance Lowry

0,6

Linéaire (Absorbance Lowry)

0,4 0,2 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en protéines (g/L)

Solution

Absorbance

Solution X Jambon dilué x5 Pomme dilué x6 Yaourt dilué x5 Pain de mie dilué x3

0,798 1,077 1,060 1,103 1,04

6

►Calculs Absorbance =0,760×Concentration +0,408 →

Concentration(Solution X )=

Concentration=

Absorbance−0,408 0,760

0,798−0,408 =0,513 g / L 0,760

Concentration( Jambon dilué X5)=

1,077−0,408 =0,880 g / L 0,760

Concentration ( Jambon)=Concentration (Jambon dilué X5 )×5=0,880×5=4,400 g / L

Concentration(Pomme dilué X6 )=

1,060−0,408 =0,858 g / L 0,760

Concentration( Pomme )=Concentration(Pomme dilué X6 )×6=0,858×6 =5,148 g / L

Concentration(Yaourt dilué X5)=

1,103−0,408 =0,914 g / L 0,760

Concentration(Yaourt )=Concentration(Yaourt dilué X5)×5=0,914×5=4,570 g / L

Concentration(PDM dilué X3)=

1,040−0,408 =0,832 g / L 0,760

Concentration(PDM )=Concentration(PDM dilué X3 )×3=0,832×3=2,496 g / L

7

→ Données brutes

Concentration en protéines (g/L)

Absorbance

0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

0,000 0,517 0,700 0,793 0,873 0,969 1,062 0,944

Courbe d'étalonnage de la méthode Lowry 1,2

f(x) = 0,826x + 0,458 R² = 0,978

1

Abs orbance

0,8

Absorbance Lowry

0,6

Linéaire (Absorbance Lowry)

0,4 0,2 0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Concentration en protéines (g/L)

Solution Solution X Échantillon dilué x10 Échantillon dilué x20 Échantillon dilué x40

Absorbance 0,759 0,773 0,585 0,439

HORS GAMME

8

►Calculs Absorbance =0,826×Concentration +0,458 →

Concentration(Solution X )=

Concentration=

Absorbance−0,458 0,826

0,759−0,458 =0,364 g / L 0,826

Concentration(échantillon dilué X10)=

0,773−0,458 =0,381 g / L 0,826

Concentration( échantillon)=Concentration (échantillon dilué X10 )×10=0,381×10=3,810 g / L

Concentration(échantillon dilué X20)=

0,585−0,458 =0,154 g / L 0,826

Concentration( échantillon)=Concentration (échantillon dilué X20 )×20=0,154×20=3,080 g / L

Comparaison des données propres et des données brutes : Pour la solution X nous obtenons une concentration en protéine de 0,513 g/L avec les données propres et de 0,364 g/L avec nos données brutes. Pour notre échantillon (jambon) nous obtenons une concentration en protéine de 4,400 g/L avec les données propres et de 3,810 g/L avec nos données brutes. Nous observons une légère différence entre les valeurs propres et les valeurs brutes, mais nous restons dans le même ordre de grandeur. On peut donc en conclure que nos valeurs sont cohérentes.

9

Dosage Bradford → Données propres Concentration en protéines (g/L) 0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

Absorbance Bradfort 0,000 0,102 0,172 0,261 0,317 0,404 0,490 0,625

Courbe d'étalonnage de la méthode Bradfort f(x) = 0,605x + 0,026 R² = 0,998

0,7 0,6 Abs orbance

0,5

Absorbance Bradfort

0,4

Linéaire (Absorbance Bradfort)

0,3 0,2 0,1 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en protéines (g/L)

Solution Solution X Jambon dilué x27 Pomme dilué x3 Yaourt dilué x17 Pain de mie dilué x14

Absorbance Bradfort 0,468 0,571 0,518 0,583 0,553

10

►Calculs Absorbance =0,605×Concentration+0,026 →

Concentration(Solution X )=

Concentration=

Absorbance−0,026 0,605

0,468−0,026 =0,731 g / L 0,605

Concentration( Jambon dilué X17 )=

0,571−0,026 =0,901 g / L 0,605

Concentration( Jambon)=Concentration ( Jambon dilué X17 )×17=0,901×17=15,317 g / L

Concentration( Pomme diluée X3)=

0,518−0,026 =0,813 g / L 0,605

Concentration( Pomme )=Concentration (Pomme diluée X3)×3=0,813×3=2,439 g / L Concentration(Yaourt dilué X17)=

0,583−0,026 =0,921 g / L 0,605

Concentration(Yaourt )=Concentration(Yaourt dilué X17 )×17=0,921×17=15,657 g / L Concentration( PDM dilué X14)=

0,553−0,026 =0,871 g / L 0,605

Concentration( PDM )=Concentration (PDM dilué X14 )×14=0,871×14=12,194 g /L

11

→ Données brutes

Concentration en protéines (g/L)

Absorbance

0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 0,625 0,750 1,000

0,000 0,048 0,145 0,180 0,262 0,286 0,427 0,548

Courbe d'étalonnage de la méthode Bradfort 0,6

f(x) = 0,562x - 0,020 R² = 0,980

0,5

Abs orbance

0,4

Absorbance Bradfort

0,3

Linéaire (Absorbance Bradfort)

0,2 0,1 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en protéines (g/L)

Solution Échantillon Solution X Échantillon dilué x10 Échantillon dilué x20 Échantillon dilué x40

Absorbance 0,461 0,251 0,085 0,097 0,183

HORS GAMME Valeurs non cohérentes

12

►Calculs Absorbance =0,562×Concentration−0,020 → Concentration= Concentration(Solution X )=

0,251+0,020 =0,482 g / L 0,562

Concentration ( échantillon )=

0,461+0,020 =0,856 g / L 0,562

Absorbance+0,020 0,562

Comparaison des données propres et des données brutes : Pour la solution X nous obtenons une concentration en protéine de 0,731 g/L avec les données propres et de 0,482 g/L avec nos données brutes. Pour notre échantillon (jambon) nous obtenons une concentration en protéine de 15,317 g/L avec les données propres et de 0,856 g/L avec nos données brutes.

Nous observons une grosse différence entre les valeurs propres et les valeurs brutes. Cela peut être dû à la pollution de l'échantillon, des erreurs de manipulation notamment lors de la mesure d'absorbance, le fait que les différents groupes ont eu des échantillons différents et donc la moyenne n'est pas propre à notre échantillon.On peut donc en conclure que nos valeurs ne sont pas vraiment cohérentes.

13

Calculs des teneurs en protéine à partir des concentrations de nos échantillons Solution X

Jambon

Pomme

Yaourt

Pain de mie

Méthode UV

0,473

39,600

8,127

9,480

29,700

Méthode Lowry

0,513

4,400

5,150

4,570

2,496

Méthode Bradford

0,731

15,317

2,439

15,657

12,194

►Jambon → Méthode UV Masse de protéine( g) 39,600 = → 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g )=

39,600×5 =0,198 g 1000

Masse de protéine (g ) 0,198 ×100=19,8 %de protéines ×100= 1,00 Masse de l ' échantillon

→ Méthode Lowry Masse de protéine( g) 4,400 4,400×5 =0,022 g = → Masse de protéine (g )= 1000 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,022 ×100=2,2 %de protéines ×100= 1,00 Masse de l ' échantillon

→ Méthode Bradford Masse de protéine( g) 15,317 = → 5 mL 1000 Teneur en protéines=

Masse de protéine(g )=

15,317×5 =0,077 g 1000

Masse de protéine (g ) 0,077 ×100= ×100= 7,7 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

14

►Pomme → Méthode UV Masse de protéine( g) 8,127 8,127×5 =0,041 g = → Masse de protéine(g )= 1000 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,041 ×100= ×100=4,1 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

→ Méthode Lowry 5,150×5 Masse de protéine( g) 5,150 =0,026 g = → Masse de protéine(g )= 1000 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,026 ×100= ×100=2,6 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

→ Méthode Bradford Masse de protéine( g) 2,439 2,439×5 =0,012 g = → Masse de protéine(g )= 1000 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,012 ×100 =1,2 %de protéines ×100= 1,00 Masse de l ' échantillon

►Yaourt → Méthode UV Masse de protéine( g) 9,480 9,480×5 =0,047 g = → Masse de protéine(g )= 1000 5 mL 1000 Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,047 ×100= ×100=4,7 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

→ Méthode Lowry Masse de protéine( g) 4,570 4,570×5 =0,023 g = → Masse de protéine(g )= 1000 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,023 ×100= ×100= 2,3 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

15

→ Méthode Bradford Masse de protéine( g) 15,657 = → 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine(g )=

15,657×5 =0,078 g 1000

Masse de protéine (g ) 0,078 ×100= ×100= 7,8 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

►Pain de mie → Méthode UV Masse de protéine( g) 29,700 = → 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine (g )=

29,700×5 =0,149 g 1000

Masse de protéine (g ) 0,149 ×100= ×100 =14,9 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

→ Méthode Lowry Masse de protéine( g) 2,496 2,496×5 =0,012 g = → Masse de protéine(g )= 1000 5 mL 1000 Teneur en protéines=

Masse de protéine (g ) 0,012 ×100 =1,2 %de protéines ×100= 1,00 Masse de l ' échantillon

→ Méthode Bradford Masse de protéine( g) 12,194 = → 1000 5 mL Teneur en protéines=

Masse de protéine(g )=

12,194×5 =0,061 g 1000

Masse de protéine (g ) 0,061 ×100= ×100= 6,1 %de protéines Masse de l ' échantillon 1,00

16

Conclusion / Discussion : Tableau récapitulatif des teneurs en protéine (en %) avec les différentes méthodes et les valeurs de la littérature (valeurs théoriques) : Jambon

Pomme

Yaourt

Pain de mie

Méthode UV

19,8

4,1

4,7

14,9

Méthode Lowry

2,2

2,6

2,3

1,2

Méthode Bradford

7,7

1,2

7,8

6,1

Valeurs théoriques

18,0

0,4

4,0

8,2

Sources pour les valeurs théoriques : http://www.infocalories.fr/

Comparaison des différents méthodes de dosages : Les résultats avec les différentes méthodes sont très différents, mis à part pour la solution X où l'on retrouve presque la même valeur de concentration en protéines. Nous pensons que cela est due à la forme physique de nos échantillons (solides / liquide). Il est aussi probable que ce soit due aux pertes durant les différentes manipulations : ► Pour la méthode spectrophotométrique (méthode UV) : nous dosons directement nos échantillons après les avoir broyé et mis en solution, et nous réalisons si besoin une dilution. Il y a donc de très faibles chances pour qu'il y ait des pertes lors de cette manipulation, c'est sûrement pourquoi nous obtenons des valeurs importantes. ► Pour la méthode de Folin-Lowry : nous effectuons différents prélèvements à partir des extraits bruts et il est également nécessaire de faire des dilutions. Nous utilisons des réactifs qui peuvent agir sur nos produits. ► Pour la méthode de Bradford : nous effectuons également différents prélèvements à partir des extraits bruts et de plus, il est nécessaire de manipuler rapidement car le mélange de nos échantillons avec le réactif de Bradford n'est pas stable. On peut donc penser que si les lectures d'absorbance n'ont pas été faites assez rapidement, les absorbance relevées sont faussées. En conclusion, nous pensons que la meilleur méthode afin de doser les protéines d'une substance quelconque reste la méthode UV. Elle est rapi...