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Trabajo sobre los criptocromos. Seminario de segundo cuatrimestre....

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Trabajo sobre criptocromos

Alicia Gil González Departamento de Fisiología Vegetal 3º Grado en Biología Universidad de Córdoba

Índice 1. 2. 3. 4.

Introducción Fotoliasas y criptocromos Fotoliasas reparadoras de ADN Estructura 4.1. La región homóloga a fotoliasas (PHR) 4.2. La extensión CRY C-terminal (CCE) 4.3. Cambios conformacionales inducidos por la luz 5. Funciones 5.1. Expresión y localización subcelular de criptocromos 5.2. Desetiolación  Inhibición de la elongación del hipocótilo con luz azul  Estimulación de la expansión del cotiledón con luz azul  Estimulación de la expansión de cloroplastos con luz azul 5.3. Control fotoperiódico del tiempo de floración 5.4. Arrastre del reloj circadiano 5.5. Magnetorrecepción 5.6. Fototropismo 5.7. Otras 6. Bibliografía

1. Introducción Las plantas poseen dos tipos de fotorreceptores: los pigmentos fotosintéticos que recogen la energía de la luz para la fotosíntesis y los receptores fotosensoriales que median las respuestas de luz no fotosintética. En 1980, se identificó el h4y mutante de Arabidopsis, que mostraba hipocótilos alargados cuando se cultivaba con luz azul pero no en otras longitudes de onda de luz o en la oscuridad. Una década más tarde, los científicos Ahmad y Cashmore, aislaron otro alelo del mutante h4y y clonaron el gen HY4. El gen HY4 codificaba una proteína que se asemejaba a una fotoliasa de ADN. Debido a que la ADN fotoliasa es una flavoproteína que cataliza la reparación de las lesiones por luz azul o UV en el ADN, inmediatamente se sospechó que HY4 era el criptocromo buscado durante mucho tiempo. Más tarde, se descubrió que la proteína HY4 se unía al dinucleótido flavina adenina (FAD) y que carecía de actividad de fotoliasa reparadora de ADN. Estos resultados llevaron a concluir que HY4 era un criptocromo y por eso se cambió el nombre a 1 o CRY1. Por otro lado, los estudios de cry2 demostraron que CRY2 regula principalmente la promoción fotoperiódica de la iniciación floral. La mayor diferencia entre CRY1 y CRY2 es que CRY2 se degrada rápidamente en la luz, mientras que CRY1 es estable en plantas crecidas con luz. El tercer miembro de la familia de criptocromos es una proteína CRY-DASH que es detectable en cloroplastos y mitocondrias. Aunque algunos CRY-DASH poseen actividad de criptocromo en la regulación de la transcripción o el desarrollo, también se descubrió que catalizan la reparación de los dímeros de ciclobutano pirimidina del ADN monocatenario in vitro. CRY3 y otras proteínas pueden actuar como fotoliasas de ADN monocatenario o fotorreceptores de doble actividad que tienen actividades de fotoliasa y criptocromo. El criptocromo se ha encontrado en organismos que van desde bacterias hasta humanos. Todos los criptocromos comparten similitud de secuencia en sus dominios N-terminales PHR con fotoliasas de ADN, y actúan como fotorreceptores en plantas, bacterias, insectos, corales, pez cebra, pollo y mamíferos.

2. Fotoliasas y criptocromos En esta familia de fotoliasas/criptocromo hay tres categorías principales: dos fotoliasas (el ciclobutano del dímero de pirimidina (CPD) y el (6-4) pirimidinapirimidona (6-4 fotoproductos)) y los criptocromos. Las fotoliasas son enzimas que utilizan la energía de la luz para la reparación del ADN dañado por luz UV, ya sea de (6-4) fotoproductos o de dímeros de ciclobutano pirimidina. Los criptocromos por el contrario funcionan en otro tipo de respuestas biológica, y solo el criptocromo CRY-DASH comparte esta función de reparación del ADN con las fotoliasas. Las fotoliasas se encuentran en casi todas las especies de procariotas y eucariotas, incluso están

codificadas en ciertos ADN virales, sin embargo, los criptocromos no están tan extendidos como estas. Estructuralmente, como ya hablaremos en los siguientes apartados, son muy similares, y comparten dominios fotoactivos. Tales similitudes junto con otros estudios realizados, nos lleva a concluir que las fotoliasas son más antiguas que los criptocromos, es decir, criptocromos y fotoliasas provienen de un ancestro común, del que, por último, se diferenciaron los criptocromos de las fotoliasas. De hecho, hay artículos que definen a los criptocromos como una proteína con similitud a las fotoliasas que ha perdido su actividad de reparación del ADN (o está reducida). Con la evolución, han surgido dos subfamilias principales de criptocromos: los criptocromos clásicos de las plantas (CRY1 Y CRY2) y de animales (insectos tipo I y mamífero tipo II), además están los criptocromos CRY-DASH (CRY3) en plantas y otros organismos que tienen propiedades fotoquímicas más similares a las fotoliasas, siendo este el criptocromo más parecido a estas.

3. Fotoliasas reparadoras de ADN Las fotoliasas son enzimas que llevan a cabo la reparación del ADN dañado por luz UV. Se unen de forma no covalente a dos cofactores: un cromóforo situado cerca de la superficie en la región N-terminal de la molécula, y un segundo cromóforo, el dinucleótido de flavina adenina (FAD), ubicado en una cavidad en el C-terminal de la molécula. La energía lumínica se absorbe principalmente a través del cromóforo N-terminal, ya que el flavin reducido (FADH-) muestra poca absorción en el espectro visible. Esta antena de recolección de luz del extremo N-terminal es un folato o un derivado de flavina, dependiendo del tipo de fotoliasa. Después de la absorción de luz por el cromóforo primario de absorción de luz, la energía se transfiere a la flavina completamente reducida. Un electrón luego es transferido desde el FADH- + directamente al dímero de pirimidina, con la posterior división en dos monómeros de pirimidina, lo que termina con la reparación del ADN. El electrón luego vuelve al radical FADH para restaurar la forma reducida de la enzima. En los criptocromos, la reparación del ADN inducida por luz por transferencia de electrones la lleva a cabo solo el criptocromo CRY-DASH.

4. Estructura Los criptocromos están compuestos por dos dominios principales, el dominio PHR N-terminal de aproximadamente 500 residuos, y el dominio CCE de extensión C-terminal de varias longitudes. Los CCE de CRY1 y CRY2 tienen aproximadamente 180 y 110 residuos de longitud respectivamente. El dominio PHR es necesario para la unión a cromóforos y homodimerización de CRY1 y CYR2, mientras que CCE es un dominio efector de criptocromo.

La estructura tridimensional del dominio PHR de CRY1 es muy similar a la de las fotoliasas, lo que sugiere una fotoquímica similar a la fotoliasa en la fotoexcitación de criptocromo. Actualmente no hay una estructura cristalográfica disponible para un criptocromo de longitud completa. La dificultad en la cristalización del criptocromo de longitud completa puede deberse a la naturaleza intrínsecamente no estructurada del dominio CCE de los criptocromos. 4.1.

La región homóloga a fotoliasas (PHR)

El dominio PHR es el dominio de unión a cromóforos de los criptocromos. Este dominio está presente en criptocromos y fotoliasas y muestra gran similitud entre ambas familias. En el primer cristal de la estructura de una fotoliasa de clase I bacteriana, el dominio fotoliasa tiene una arquitectura bilobular, se subdivide en dos dominios. Esta estructura se mantiene en todas las fotoliasas estructuralmente conocidas de ADN de clase I, fotoliasas y criptocromos de plantas, así como CRY-DASH, aunque pueden tener pequeñas variaciones dentro de los subdominios. La similitud estructural entre fotoliasa y criptocromos sugiere que todos los criptocromos como las fotoliasas pueden tener capacidad para unir cofactores captadores de luz. 4.2.

La extensión CRY C-terminal (CCE)

Se ha formulado la hipótesis de que la superfamilia de fotoliasa/criptocromo pasó por varias rondas de duplicación de genes durante la evolución. Es concebible que copias duplicadas en diferentes linajes evolutivos puedan fusionarse a diferentes secuencias para convertirse en dominios CCE de los criptocromos progenitores en diferentes linajes. Aunque los dominios CCE de criptocromos vegetales no comparten similitud de secuencia con los dominios CCE de criptocromos animales, los criptocromos vegetales de diferentes especies comparten un dominio de secuencia común DAS en sus CCE. Los criptocromos de musgos, hepáticas y helechos poseen varias versiones del dominio DAS. Sin embargo, Chlamydomonas, el alga verde celular derivada del último ancestro común de los linajes vegetal y animal tiene un criptocromo tipo planta (CPH1). Este es idéntico al dominio CCE. Algunos criptocromos encontrados en otras algas tampoco poseen dominios DAS, y parecen estar más estrechamente relacionados con criptocromos animales que con criptocromos vegetales. 4.3.

Cambios conformacionales inducidos por la luz

Los cambios conformacionales inducidos por la luz son fundamentales para la transducción de señales y la regulación de todos los fotorreceptores, que permiten la alteración del fotorreceptor con socios de señalización o la modificación de enzimas en respuesta a la luz. No se informó ningún cambio conformacional significativo para la estructura cristalina del dominio PHR de CRY1. Sin embargo, una disociación entre los dominios PHR y CCE de un criptocromo puede representar un cambio conformacional esperado de criptocromos, pero dicho cambio no puede detectarse en el dominio PHR solo.

Se encontró que la sensibilidad a la tripsina del dominio PHR de CRY1 no se alteró por la luz. Por el contrario, el dominio CCE de CRY1 aumentó su susceptibilidad a tripsina en 5-10 veces en respuesta a la luz. La susceptibilidad a tripsina aumentada sugiere que las regiones específicas del dominio de CCE se desordenan tras la fotoexcitación.

5. Funciones Los criptocromos CRY1 y CRY2 median la estimulación con luz azul de la desetiolación y el control fotoperiódico del tiempo de floración, también median otras respuestas. La función de CRY3 no está clara, se cultivó en diferentes condiciones de luz y no mostró cambios ni alteraciones. Pero dada su actividad bioquímica en la reparación de ADN, es probable que CRY3 participe en la protección de genomas contra el daño de los rayos UV. 5.1.

Expresión y localización subcelular de criptocromos.

Los genes CRY1 y CRY2 se expresan en todos los tipos de células y órganos examinados. El análisis del reportero de luciferasa impulsado por el promotor CRY indica que la expresión de ARNm de CRY no se ve muy afectado por la luz azul, sino que los promotores de CRY1 y CRY2 están bajo el control del reloj circadiano, con picos en la fase de luz y depresiones en la fase oscura. El nivel celular de la proteína CRY1 no se ve afectado significativamente por la luz, pero el nivel de la proteína CRY2 está regulado negativamente por la luz azul. Además, CRY1 y CRY2 son proteínas solubles que se acumulan en el núcleo. CRY1 también se detecta en el citosol de plantas cultivadas tanto en condiciones oscuras como livianas sin un cambio drástico de la concentración subcelular relativa. Se ha demostrado que CRY1 nuclear es responsable de la inhibición de la luz de la elongación del hipocotilo, mientras que la CRY1 localizada en el citosol media la estimulación de la luz azul de la expansión del cotiledón y el alargamiento de la raíz. Por el contrario, CRY2 nuclear media la inducción floral y la inhibición del hipocotilo. 5.2.

Desetiolación.

La desetiolación es el principal cambio que sufren las plantas jóvenes en su desarrollo cuando emergen de la oscuridad de encontrarse bajo el suelo y se exponen a la luz. Este proceso se caracteriza por varios cambios morfológicos, como son la detención del crecimiento del hipocotilo, la expansión de los cotiledones y el desarrollo de los cloroplastos, pasando de etioplastos a cloroplastos. La función de los criptocromos en la desetiolación depende tanto de la regulación transcripcional como de la regulación posterior a la transcripción de la expresión génica.

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5.3.

Inhibición de la elongación del hipocotilo con luz azul. La sobreexpresión de CRY1 hace que la luz azul inhiba el alargamiento del hipocotilo, dando como resultados hipocotilos más cortos y plantas enanas. CRY2 también inhibe la elongación del hipocotilo pero a intensidades de luz mucho más bajas que el CRY1. Más tarde se propuso que los criptocromos activan los canales aniónicos, es decir, despolarizan la membrana plasmática. Se descubrió que CRY1 nuclear, es responsable tanto de la inhibición del alargamiento del hipocotilo como de la despolarización de la membrana. Esta despolarización ocurre segundos después de la iluminación. Estimulación de la expansión del cotiledón con luz azul. Contrariamente a la función anterior, los criptocromos median la estimulación con luz azul de la expansión celular en cotiledones. Tanto CRY1 como CRY2 actúan estimulando la expansión del cotiledón en presencia de luz azul, y al igual que en la inhibición del cotiledón, CRY1 estimula la expansión en irradiancia alta y baja, mientras que CRY2 solo lo hace con baja irradiancia. Estas dos funciones se deben a diferentes mecanismos de señalización. Estimulación de la expansión de cloroplastos con luz azul. El cambio de la expresión génica en genomas nucleares y plastídicos es probablemente parte del mecanismo de desarrollo de plastidios durante la desetiolación. Los criptocromos median los cambios en la expresión génica a través de mecanismos transcripcionales y postranscripcionales. Median la inducción de los genes nucleares que codifican las proteínas plastídicas necesarias tanto para la fotosíntesis como para otras funciones. Por lo que la regulación de los criptocromos de las proteínas nucleares codificadas que se requieren para los mecanismos de transcripción de plastos controlado por la ARN polimerasa codificada por plástidos, puede desempeñar papeles críticos en el desarrollo de cloroplastos durante la desetiolación.

Control fotoperiódico del tiempo de floración.

Arabidopsis es una planta de días largos (LD) que florece antes en LD que en días cortos (SD). Los fitocromos median el control fotoperiódico del tiempo de floración en las plantas, pero la función del criptocromo en la respuesta fotoperiódica es diferente. En un estudio realizado en las plantas transgénicas que sobreexpresan CRY2, se observó que tenían longitudes del hipocotilo intermedias entre las plantas de tipo salvaje y las que sobreexpresan CRY1, por lo que se concluyó que CRY2 desempeñaba un papel menor en la desetiolación y se diseñó un experimento para aislar el mutante cry2. Dos alelos mutantes de cry2 se aislaron por último, y ambos florecieron significativamente más tarde que el tipo silvestre en LD, pero no

en SD, lo que indica que CRY2 juega un papel en el control de la floración fotoperiódica.

5.4.

Arrastre del reloj circadiano.

El reloj circadiano es el oscilador molecular que impulsa diversos ritmos circadianos en la mayoría de los organismos, lo que permite a los organismos anticiparse y adaptarse a los cambios ambientales dominados por el ciclo de luz/oscuridad de 24 horas, así como el ciclo anual de fotoperiodo en la Tierra. El mutante cry1 tiene un periodo alargado de los ritmos circadianos en las tasas de fluencia alta y baja de luces azules, mientras que el mutante cry2 tiene un periodo ligeramente acortado en bajas tasas de fluencia de luz azul. El doble mutante cry1cry2 exhibió un periodo más largo bajo todas las tasas de fluencia de la luz probada, lo que sugiere que CRY1 y CRY2 actúan de forma redundante para arrastrar el reloj circadiano. El doble mutante cry1cry2 conserva ritmicidad, esto indica que los criptocromos no son componentes intrínsecos del oscilador circadiano.

5.5.

Magnetorrecepción.

La magnetorrecepción consiste en la capacidad que tienen algunos seres vivos, sobre todo aves e insectos, para detectar la dirección y sentido del campo magnético, utilizándola en periodos de migración. Recientemente, se demostró que los criptocromos median la magnetorrecepción dependiente de la luz en Drosophila, pero esta función del criptocromo depende de una nueva fotoquímica no relacionada con la fotorreducción de FAD. Las posibles respuestas al campo magnético o fotorrecepción también se han estudiado en plantas. Se afirmó que el campo magnético aumenta la inhibición de la luz azul mediada por CRY1 de la elongación del hipocótilo, la acumulación de antocianinas y la degradación de CRY2 dependiente de la luz azul en Arabidopsis. 5.6.

Fototropismo.

La función de CRY1 en el fototropismo es compleja. Se realizó un estudio donde el doble mutante cry1cry2 carecía de fototropismo azul dependiente de la luz, mientras que la sobreexpresión de CRY1 potenciaba el fototropismo. Sin embargo, posteriormente se descubrió que el principal receptor de luz azul responsable del fototropismo eran las fototropinas en lugar de los criptocromos. Otro estudio, mostró que, aunque los mutantes cry1cry2 y phyAphyB tienen una amplitud reducida en el primer fototropismo positivo, ninguno alteró otros parámetros importantes del fototropismo, por lo que ninguno de los dos fotorreceptores (criptocromos y fitocromos) median el fototropismo. Por otro lado, un informe más reciente confirmó que

el doble mutante cry1cry2 posee un fototropismo casi normal en respuesta a la luz azul, aunque la respuesta está alterada en el triple mutante cry1cry2phyA. Sumando todos los resultados obtenidos en los diferentes estudios relacionados con los fotorreceptores y el fototropismo, se concluyó que las fototropinas son los receptores de luz azul que median el fototropismo y la mayoría de las otras respuestas del movimiento dependientes de la luz azul, como la apertura de los estomas y el movimiento de los cloroplastos. Los criptocromos y fitocromos sin embargo pueden actuar juntos para regular funciones de las fototropinas en muchas de las respuestas de la luz azul mediadas por fototropinas.

5.7.

Se ha demostrado también que los criptocromos tienen otras funciones como regular la altura de las plantas, el desarrollo de frutos y óvulos, latencia de semillas, la respuesta al estrés con luz alta, respuesta al estrés osmótico, crecimiento trópico y muerte celular programada.

6. Bibliografía - Lincoln Taiz, Eduardo Zeiger. (2006) Plant physiology . - Joaquín Azcón-Bieto, Manuel Talón. (2000) Fundamentos de Fisiología Vegetal. - Xuhong Yu, Hongtao Liu, John Klejnot, Chentao Lin. (23 septiembre 2010) The Arabidopsis Book: The Cryptochrome Blue Light Receptors. , American Society of Plant Biologists - Inês Chaves, Richard Pokorny, Martin Byrdin, Nathalie Hoang, Thorsten Ritz, Klaus Brettel, Lars-Oliver Essen, Gijsbertus T. J. van der Horst, Alfred Batschauer, Margaret Ahmad. (2011) The Annual Review of Plant Biology: The Cryptochromes, Blue Light Photoreceptors in Plants and Animals....