VirologÍa - Apuntes 1-3 PDF

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Inés Canosa Pérez-Fragero...

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TEMA 1. INTRODUCCIÓN A LA VIROLOGÍA. HISTORIA, DEFINICIÓN DE VIRUS, MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE VIRUS La Virología es una ciencia muy nueva, antes era imposible trabajar con virus y manipularlos por su pequeño tamaño y porque tampoco se sabía de su existencia, esto fue posible a partir de 1950. Surgió sobre todo por la necesidad del conocimiento acerca de las pandemias (afectación de una enfermedad en un área extensa geográfica). Como no se sabía la razón de estas pandemias, se estudiaba su epidemiología. Sabemos además que los virus infectan a casi todos los tipos de formas de vida: eucariotas (vertebrados,

invertebrados,

plantas,

hongos…),

y

procariotas

(bacterias

y

arqueobacterias). Una vez que se ha conseguido conocer los ciclos de vida de los virus, se les ha dado aplicaciones:



Tipado de bacterias: Se usa la susceptibilidad de algunas bacterias de ser infectadas por virus, sirviendo este hecho como marcador o tipaje.



Fuente de obtención de enzimas: Muchas enzimas de modificación genética vienen de fagos, como las ligasas, polimerasas…



Pesticidas: Los virus infectan a insectos que producen plagas



Agentes anti-bacterianos: Infectan a bacterias patógenas



Agentes anticancerígenos: Se usan para dirigirse a células oncogénicas.



Vacunas



Producción a gran escala de proteínas



Terapia génica: Suplen la función de genes que no van bien en el organismo.

Contribuciones de los virus a la ciencia: Gracias a los virus, se descubrió que los genes están compuestos de DNA, o que la información genética está en el DNA (Hershey y Chase, 1952), con el estudio del Fago T2: El objetivo de este experimento era averiguar cuál era la molécula que contenía la información transmitida del fago a la célula. Finalmente, dicho experimento sirvió para determinar que esta información se encontraba recogida en el material genético (que marcaron con fósforo radiactivo) y no en las proteínas (que fueron marcadas con azufre radiactivo). Esta conclusión fue la más importante y rectificó el fallo de base de la época, ya que por entonces se pensaba que las proteínas eran las que transmitían la información.

Además, el experimento permitió obtener otras conclusiones: que la proteína de la cubierta viral no es necesaria para producir la infección debido a que no contiene la información genética y que sólo con el material genético del fago y la maquinaria celular es suficiente para producir copias del virus.

Tras la agitación con el agitador Waring, los virus se despegan de la superficie celular. De este modo, al realizar la centrifugación, la mayoría del azufre radiactivo (alrededor del 75%) se queda en el sobrenadante, debido a que no ha sido inyectado en las células y sigue formando parte de los virus. Sin embargo, en la fracción celular (pella) aparece una pequeña proporción de 35S (alrededor del 25%), que puede corresponderse con fracciones de cápsidas víricas que no se han despegado de las células con la agitación, y son arrastradas con éstas al fondo del tubo por precipitación.



El primer enhancer (secuencia potenciadora a la que se une un regulador para activar la transcripción de un gen completo), se describió en simian virus (SV40). Gracias a este virus, también se estudia la transcripción de sistemas de regulación en eucariotas.



Primer factor de transcripción caracterizado fue el antígeno T (AT) de SV40, que es un activador de la transcripción.



La primera señal de localización nuclear fue descrita con AT de SV40, ya que los genes se transcriben en el núcleo y luego van al citoplasma para traducirse a

proteínas. Estas señales de localización celular nos dicen que vuelven al núcleo para activar promotores. 

Descubrimiento de los intrones y splicing alternativo en adenovirus



Papel de la caperuza (cap) en 5’ del mRNA eucariota en virus vaccinia.



Primer IRES (internal ribosomal entry site) descrito en poliovirus. Gracias a este IRES, se pueden traducir proteínas sin la caperuza ni el poliA.

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Primer pseudonudo (pseudoknot) descrito en el virus del mosaico del tulipán. Los pseudonudos son estructuras secundarias de RNA de 1c que forman horquillas y sirven de regulación a distintos niveles: replicación, inicio de la traducción…

Historia -La primera prueba de una infección vírica data del 3700 AC del Egipto antiguo, que muestra a un curandero con síntomas de poliomielitis paralítica causada por un virus. -Desde Aristóteles en el I AC hasta la mitad del siglo XIX se seguía creyendo en la generación espontánea de la vida, y existían protocolos para crear la vida. -Antony van Leeuwenhoek XVII-XVIII, hizo el primer microscopio y descubrió a los “animáculos” o primeras formas de vida, no al virus. Era un físico que pulía lentes. Se empezó a cuestionar la generación espontánea. -Pasteur y Koch XIX demostraron definitivamente que no existía tal generación espontánea. Demuestran la existencia de microorganismos vivos en el aire, y desarrollaron la “teoría del germen”: Identificaban cuál era el agente causal de la enfermedad. Medio de cultivo hervido o estéril en un recipiente con un cuello de cisne, al mover el cuello, el medio de cultivo se contaminaba por los microorganismos del aire que estaban en el cuello. “Los Postulados de Koch y la Teoría del germen (1880)”: Vital para la caracterización de las enfermedades infecciosas. Introduce el método científico para la identificación de un patógeno. 1. El agente patógeno debe estar presente en los animales enfermos y ausente en animales sanos. 2. El agente patógeno debe poder ser aislado del organismo enfermo, y poder ser cultivado in Vitro. 3. Al inocular un cultivo puro del agente patógeno en un hospedador susceptible sano, la enfermedad debe reproducirse.

4. El mismo agente patógeno debe poder ser recuperado otra vez del hospedador infectado experimentalmente. -Edward Jenner XVIII-XIX desarrolló la primera vacuna contra el virus de la viruela vacuna mediante observaciones empíricas: los granjeros con vacas no eran tan susceptibles a la viruela. Inoculó virus de la vaca (pus) al humano y así quedaron inmunizados con la primera vacuna. -Los primeros en identificar a un virus como tal fueron Dimitri Iwanowski (1892) con el virus del Mosaico de Tabaco (TMV): Primera evidencia de que una enfermedad (en plantas de tabaco) puede ser transmitida por un virus. El ensayo consistió en pasa un extracto contaminado a través de un filtro de cerámica, que retiene las “partículas más pequeñas conocidas” que eran las bacterias, pero pasaban los virus, y seguían dando enfermedad. Ellos pensaban que podía deberse esto a la existencia de toxinas no de virus. Luego tenemos a Martinus Beijerinick (1898) con la Teoría del fluido y contagium vivum fluidum: instauró el término de germen soluble o contagium vivum fluidum, o de entidad que por sí sola produce una lesión. Siguió la investigación del anterior. Los virus atraviesan la porcelana y se multiplican en los tejidos de las plantas infectadas, y no son toxinas, ya que se multiplican, pero no in Vitro, sino dentro de las células huésped que necesitan para infectar. Cabe destacar a Karl Landsteiner & Erwin Popper (1909) con el agente filtrable: muestran que la poliomielitis era causada por un “agente filtrable”. Primera enfermedad humana caracterizada como causada por un virus. Renato Dulbecco (1952) fue Premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1975. Cuantifica la cantidad de virus mediante el ensayo de calvas . El ensayo de Dubelcco consiste en realizar diluciones seriadas de un cultivo puro de virus líticos y añadirlas a un césped bacteriano sensible a dicho virus. Al hacerlo, cada virus provocará la lisis de las bacterias cercanas, formando calvas en el césped bacteriano. Así, si contamos las calvas que se forman, podremos averiguar la cantidad de unidades formadoras de calvas. Con una única partícula viral es suficiente para formar una calva, ya que el virus infectará a una célula, se reproducirá y generará muchas copias de sí mismo. Estos

viriones podrán infectar a las células vecinas, y así sucesivamente hasta formar una calva.

Experimento de Gierer y Schramm (1956) con el Virus del mosaico del tabaco (TMV) El RNA y las proteínas son los componentes del virión infectivo. El RNA viral purificado podía ser infeccioso si se tomaban las precauciones

necesarias para

protegerlo de ser inactivado por la acción de enzimas capaces de degradar ácido ribonucleico, y por lo tanto llevaba la información. Las plantas infectadas dan origen a progenies virales que corresponden al tipo del RNA presente en el híbrido infectante. Desnaturalizan con urea a los viriones con proteínas y cápsidas distintas, las proteínas y el DNA lo separan por diferencial y se reconstituye al virus creando híbridos. Si A y B dan lesiones distintas, identifico que virus está afectando a cada planta. Miramos la progenie y vemos que son virus de aquel RNA que contenía. Si tienen RNA B con cápsida A, dan progenie de B silvestre, y si son RNA A y cápsida B, dan progenie de A silvestre.

¿Qué es un virus? - Se trata de entidades (elementos genéticos)

bioquímicamente

más

simples que una célula eucariota o procariota. - Son parásitos intracelulares: necesitan de las células para reproducirse y completar su ciclo de vida. - Carecen de la información genética necesaria para generar energía metabólica o síntesis de proteínas (ribosomas). Dependen de una célula huésped para obtener los metabolitos necesarios para expresar y replicar sus genomas y producir nuevas partículas infectivas.

- Se reproducen de manera diferente a la célula huésped utilizando una estrategia de ensamblaje en lugar de división celular. Con un ácido nucleico y proteínas de la cápsida, se reensamblan por separado y dan partículas virales infectivas. - ¿Son seres vivos? Estrictamente, en el interior de la célula huésped son seres vivos, mientras que por sí solos, son meros ensamblajes de compuestos químicos inertes. Los virus proponen un dilema en cuanto a su clasificación científica, debido a que se encuentran al límite de la definición de la vida. Se define como ser vivo aquél capaz de realizar las tres funciones vitales: nutrición, relación y reproducción. En el caso de los virus, no son capaces de realizarlas todas (no se nutren), sin embargo, son capaces de relacionarse y de reproducirse. Esta última función solamente la realizan parasitando a una célula viva. Es por ello que los virus podrían considerarse seres vivos en el interior celular y no vivos en el exterior. En cualquier caso, la clasificación de estos seres aún presenta una controversia importante en el ámbito científico.

Características de los virus: 1. Son extraordinariamente pequeños: 24nm (Fiebre aftosa)- 300 nm (Poxvirus). No se ven en microscopio óptico y atraviesan un filtro de esterilizar bacterias. 2. Cristalizables: W. Stanley (1935). 3. Tienen formas geométricas precisas y tienden a ordenarse en una pauta tridimensional regular, periódica. 4. No pueden cultivarse en medio artificial 5. Solo pueden cultivarse en un organismo huésped o en células animales in vitro. 6. Sin metabolismo 7. “Existe mayor diversidad biológica dentro de los virus que en el resto de los reinos bacteriano, animal y plantas juntos” ¿Cómo es posible que algunos virus tengan una capacidad de adaptación tan inmensa con unos genomas tan sumamente pequeños? Porque las polimerasas de los virus tienen una tasa de error muy elevada, lo que genera una gran cantidad de mutaciones al azar, de las cuales, por selección natural, prevalecen las más beneficiosas para cada ambiente. Esta rápida capacidad de adaptación es la causa de que las vacunas deban ser rediseñadas cada cierto tiempo, o de que aún no se haya encontrado un remedio eficaz para algunas enfermedades virales. Un ejemplo sorprendente de esto último es el resfriado común. Clasificación de los virus:

-Tipo de ácido nucleico (RNA o DNA) -Morfología de la cápsida -Relaciones filogenéticos (secuencia de ác. nucleico) -Criterios serológicos (composición de las proteínas, epítopos o sitios antigénicos) -Naturaleza del huésped que infectan (algas, arqueas, bacterias, hongos, invertebrados, plantas, protozoos, vertebrados) -Criterios epidemiológicos -Ciclos de infección -Criterios históricos… “la gripe intercambia fragmentos de DNA y así, la vacuna ha de cambiar cada año al tomar distintos epítopos” Clasificación de David Baltimore: Fue premio nobel en medicina en 1975. Se basa en la relación entre el genoma y el mensajero que se traduce. La clasificación de virus según esta nomenclatura es: -Clase I; dsDNA : El mRNA se sintetiza de forma tradicional usando el DNA de cadena negativa como molde. Ej: Herpesvirus, Adenovirus, Poliomavirus, Poxvirus. -Clase II; ssDNA: La síntesis de mRNA implica a un intermedio dsDNA. Necesita una polimerasa específica de DNA. Ej: Parvovirus -Clase III; dsRNA: Una de las cadenas es utilizada como mensajero. Ej: Reovirus -Clase IV; ssRNA (+) Esta molécula puede ser usada como mensajero. El propio genoma del virus se traduce al entrar al citoplasma de la célula sin necesitar caperuza. Ej: polio. Necesitan de un intermediario de RNA- para replicarse con una RNA polimerasa. Ej: Picornavirus, Togavirus… -Clase V; ssRNA (-) Molécula sirve de molde para sintetizar el mensajero. Necesita una RNA polimerasa. Ej: Rabdovirus, Mixovirus… -Clase VI; ssRNA (+) Aunque podría servir de mensajero, su replicación pasa por un intermediario dsDNA. Sirve para evadir al sistema inmune. Ej: Retrovirus. “Normalmente tienen un genoma parecido al de la célula que infectan, aprovechando la maquinaria que está en la célula.” “la molécula de mensajero es RNA+=RNAm”

Clasificación del ICTV 95(Comité Internacional para la Taxonomía viral) Basado en la clasificación de Baltimore, organiza a todos los virus en nueve grupos, en función del genoma que presenta la partícula viral. Todos los virus tienen que pasar por el mRNA (+) para poder traducirse a proteínas, a excepción de los retrovirus. 1. Virus DNA de doble cadena: pueden generar directamente +mRNA. 2. Virus DNA de cadena sencilla: son de +DNA. Tienen que generar –DNA para poder hacer +mRNA. 3. Virus RNA de cadena doble: directo. 4. Virus RNA de cadena negativa: directo. 5.

Virus

RNA

de

cadena

positiva: tienen dos opciones. Pueden

pasar

a

–RNA y

a

+mRNA, o pasar a –DNA, a dsDNA y a +RNA. 6. Virus RNA y DNA con transcripción inversa. 7. Agentes subvirales (viroides) 8. Agentes subvirales (satélites y priones) 9.

Virus

pendientes

de

clasificación, peculiares que nadie sabe clasificar.

Manipulación de virus animales: Es más fácil el manejo de virus de plantas o bacteriófagos que el manejo de virus de animales. Se hacen cultivos de células eucariotas, de líneas celulares establecidas, o bien con animales enteros, insectos o embriones de pollo. Estas líneas celulares necesitan unas condiciones determinadas, y son delicadas. Las propiedades o necesidades del medio de cultivo son: -

-una fuente de energía como la glucosa

-

-aminoácidos esenciales y vitaminas

-

-cofactores metálicos en trazas y lípidos

-

-una solución salina que le permite la ósmosis, ya que si hay pocas células en el medio, no funciona la ósmosis bien.

-

-una solución tampón (HCO3 25 mM equilibrado con CO2 5%)

-

-Antibióticos o antifúngicos

-

-Suero (2-10%)

Además aporta factores de crecimiento y hormonas necesarias para la proliferación celular y protege a las células de daños por rozamiento, incrementando así la viabilidad.

DETECCIÓN DEL VIRUS 1. Unidades formadoras de calvas (u.f.p.)=Plaque assay: Si el virus infecta, se produce ciclo lítico, si el virus no es lítico, se dan diferencias en el crecimiento de las calvas. Si se da lítico, se liberan los virus al medio, infectan a las células de alrededor y va haciendo calvas en el medio. 2. Lesiones foliares: Existen fenotipos con distintos colores que son el resultado de infecciones con virus. 3. Pústulas en Membrana corioalantoidea (MCA) de embriones de pollo: Producción de virus en embriones de pollo. Tras 14 días tras la fecundación, se inyecta el virus en el compartimiento adecuado para su replicación. Muy empleado para virus de la influenza. Herramienta muy potente en biotecnología. No es necesario el uso de líneas celulares establecidas.

4. Hemaglutinación (Hirst, 1941): Es la aglutinación de eritrocitos por proteínas virales, debido a la presencia de proteínas en la superficie de las partículas virales que reconocen a receptores presentes en la membrana del eritrocito. -

Mediante diluciones seriadas cuantifica partículas virales (no siempre infectivas)

-

Es exacto, rápido y barato, pero no muy sensible

-

Unidades de hemaglutinación por ml (UHA/mL) es el inverso de la dilución más alta que da un resultado positivo, dividido por el volumen ensayado.

-

También usado para medir cantidad de anticuerpos frente a un virus por inhibición de la aglutinación

-

Forma de titular la cantidad de virus: se precipita antes a más virus.

5. Microscopía electrónica, 1931 Puede visualizarse directamente el contenido en partículas virales de un preparado de virus. No permite discriminar entre partículas infectivas y no infectivas. Las preparaciones deben estar bastante purificadas. Se procede a sombrear con partículas de platino que dan sensación de relieve. Fijamos en una superficie a los virus y los teñimos con platino para dar contraste, dando sensación de relieve. La resolución es muy buena, más de 10000 aumentos. Sirve para la modelización de los distintos virus. 6. Microscopía de fluorescencia y confocal: Marcaje de anticuerpos con fluorocromos, para localizar el virus en las células que infecta. Comparación entre métodos: Los métodos de valoración de virus presentan distintas sensibilidades y miden propiedades fisicoquímicas y biológicas distintas:

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Inmunoensayo enzimático (ELISA) Basado en la determinación cuantitativa de antígenos virales contra los que se dispone de anticuerpos específicos. La muestra viral se dispone sobre un soporte sólido, en el que van a establecerse las reacciones antígeno-anticuerpo seguidas de un sistema de revelado y cuantificación visual. Según la intensidad del ensayo colorimétrico, calculo el número de virus que existen en la muestra. El anticuerpo secundario queda unido a un reactivo de color.

West er nBl ot : Separ amosport amañoel ect r of or ét i cament e,conmembr anadenyl onsefi j an.Es pec í ficopar a pr ot eí nases pecí fi casdel vi r us .

Inmunoprecipitación

Las células enteras (prot) se marcan con metioninas radioactivas, con fluorescencia... Rompemos a la célula y separamos por tamaño a las proteínas virales, quedando unidas las proteínas por los anticuerpos en bolas en una columna. Lo eluido no lo detecto y lo que ha quedado retenido, lo corro en un gel y lo detecto. DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Lo más común es usar la PCR por su gran sensibilidad y versatibilidad. Si quiero algo más burdo uso PCR semi-cuantitativa, si quiero algo más refinado (diagnostico) uso qRT-PCR. También se usa Southern Blot, inmovilizando el DNA total de la célula y del virus. La sonda hibrida con la molécula del virus que quiero que detecte. ¿Qué es una célula susceptible? ¿Y una célula resistente? ¿Y una célula permisiva? ¿...