Zellkompartimente und Proteinsortierung PDF

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Aus der Vorlesung "Molekular- und Zellbiologie für medizinische Biologen"

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Zellkompartimente und Proteinsortierung Zellorganellen o o o

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jedes Organell verfügt über einen spezifischen Satz an Proteinen spezialisierte Verteilungssysteme nötig charakteristische strukturelle und funktionelle Eigenschaften Proteine  Katalysatoren organellspezifischer Reaktionen  Transport (hinein/hinaus)  Oberflächenmarker (Proteine/Lipide)  Erkennung des korrekten Organells 10 Milliarden Proteinmoleküle je tierischer Zelle mit etwa 10000 unterschiedlichen Proteinen Proteinbiosynthese startet im Cytosol  Transport in weiter-prozessierende Organellen oder in Zielorganell intrazellulärer Molekültransport vom Cytosol zum Zellkern, zu den Mitochondrien, Peroxisomen oder dem Endoplasmatischen Retikulum möglich Endosom: Endocytose, Aufnahme extrazellulärer Makromoleküle/Partikel Peroxisom: oxidative Reaktionen Cytosol: Cytoplasma (Proteinaufbau/-abbau, Intermediärstoffwechsel) Lysosom: Abbau Makromoleküle/Organellen Golgi-Apparat: Lipid-Proteinmodifizierung nach ER, Weiterleitung zum Zielorganell Mitochondrium: ATP-Produktion Endoplasmatisches Retikulum mit membrangebundenen Polyribosomen: Proteinsynthese, Lipidsynthese, Calciumspeicher Zellkern: Genom (Hauptsyntheseort von RNA und DNA) Zelltyp-spezifische Funktionen resultieren in variierenden Zusammensetzungen der Kompartimente (ERPlasmamembran-Ratio in sezernierenden Zellen 25 bzw. 12-fach erhöht) Evolution von membranumschlossenen Organellen (hypothetisch) Vergrößerung der Reaktionsräume und Schutz Membran-umschlossener Inhalte wie z.B. Chromosomen Genom hat sich aus urzeitlichem Archaeon entwickelt Kernhülle ist durch Einstülpung der Plasmamembran entstanden  abgetrenntes Kernkompartiment mit Doppelmembran durch Evolution haben sich verschiedene Transportwege entwickelt die Lumina der Organellen haben sich durch wiederholtes Abschnüren und Fusionieren von Transportvesikeln gebildet Mitochondrien und Plastiden nehmen nicht am Vesikeltransport teil jede Art des Proteintransfers wird von Sortiersignalen am Protein geleitet – Erkennung durch komplementäre Sortierrezeptoren  Sortiersignal lenkt Verbleiben oder Verlassen aus Kompartiment Transport zwischen Zellkern und Cytosol: gerichteter Transport über Kernporenkomplex, Protein muss am Rezeptor erkannt werden Transport zwischen Cytosol und Mitochondrien/ER/Plastiden/Peroxisomen: Transmembrantransport (ProteinTransmembran-Translokatoren)  (ungefaltete) Proteinstrukturen durch/in Membranen Transport zwischen ER und Golgi-Apparat: vesikulärer Transport (lösliche Proteine in Transportvesikeln)  Verpackung eines Proteins in Transportvesikel benötigt Sortiersignal, das mit komplementärem Rezeptor in der Vesikel-bildenden Membran interagiert zwei Arten von Sortiersignalen (einzeln oder Signalfleck/-Tasche)  H3N-, N-Terminus; -COO, -C-Terminus; genaue Aminosäuren-Abfolge ist weniger entscheidend als die physikalische Eigenschaft  Aufnahme in den Zellkern und in Mitochondrien mit positiver Sequenz  Export aus dem Kern und Import in ER mit hydrophober Sequenz  Zellteilung  Weitergabe entsprechender Sortiersignale Zusammenfassung Zellkompartimentierung eukaryotische Zellen enthalten intrazelluläre Membranen (beinhalten ca. 50% des Zellvolumens)

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Hauptorganellen sind Zellkern, Mitochondrien, Peroxisomen, ER, Golgi-Apparat, Lysosomen, Endosomen)  jedes von ihnen beinhaltet funktionsspezifische Proteine neu synthetisierte Organellproteine werden selektiv von Ribosomen (im Cytosol) zum Zielorganell transportiert (spezifische Sortiersignale, Signalsequenz- oder -Fleck)  Erkennung erfolgt durch komplementäre Rezeptoren  Anschließend Transport zum Zielorganell cytosolische Proteine haben kein Sortiersignal und verbleiben nach Synthese dort während der Zellteilung werden ER und Mitochondrien auf Tochterzellen verteilt, keine de novo Synthese möglich!

Molekültransport Zellkern – Cytosol o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

bidirektionaler, selektiver Transport Histone, DNA- und RNA-Polymerasen, genregulierende Proteine etc. (Cytosol  Kern) mRNAs, tRNAs, miRNAs, snRNAs (Kern  Cytosol) Kernlamina = faseriges Proteingeflecht, das der inneren Kernmembran anliegt Kernhülle umfasst die innere und äußere Kernmembran äußere Membran des Kerns geht kontinuierlich in ER über, ist mit Ribosomen versehen  Weitertransport in perinukleären Raum/ER innere Kernmembran hat Proteine als Ankerstellen für das Chromatin NPC = Nulear pore complex  Doppelmembranhülle ist von Poren durchzogen, in denen Kernporenkomplexe sitzen Perinukleäre Proteine verbinden den Kern mit Chromosomen und Cytosol durchspannen die Membran dienen als Verankerungspunkte interagieren mit dem Cytoskelet NPCs perforieren die Zellkernhülle Nucleoporine mit achtzähliger Rotationssymmetrie  hochsymmetrischer Aufbau aus 500-1000 mehrfach kopierten Poteinen  etwa 30 verschiedene Proteine sind beteiligt pro Kern ca. 3000-4000 NPCs (variierend zwischen Zelltypen: wenige 100 in Gliazellen, bis zu 20000 in PurkinjeNeuronen) ca. 1000 Makromoleküle können ein NPC pro Sekunde passieren (bidirektionell) sind auf der cytosolischen Seite genauso aufgebaut, wie auf der dem Kern zugewandten Seite Transmembran-Ringproteine verankern die NPCs in der Kernhülle Gerüstnucleoporine sind membranbiegende Proteine und dienen der Stabilisierung NLS (Nuclear localisation signal) steuert Kernproteine zum Kern – Kernimportrezeptoren binden NLS- und NPCProteine Kernexport ähnlich über Kernexportsignale (NES), Interaktion mit entsprechenden NER (Kernexportrezeptoren) Frachtproteine mit Kernlokalisationssignalen binden an Kernimportrezeptoren manche Frachtproteine benötigen ein Kernimport-Adapterprotein, um an einen Kernimportrezeptor binden zu können Richtungssinn durch die GTPase Ran für Transportprozess notwendige Energie aus GTP-Hydrolyse GTPasen sind molekulare Schalter (je nach Bindung haben sie eine unterschiedliche Konformation) Wechsel zwischen beiden Zuständen durch Ran-spezifische regulatorische Proteine cytosolisches Ran-GAF (GTPase activating protein) bewirkt hydrolytische Spaltung  Ran-GDP liegt vor nucleäres Ran-GEF (Guanin nucleotide exchange factor)  Ran-GTP liegt vor es kommt zu einem Gradienten an Ran-GDP (Cytosol) und Ran-GTP (Kern, Interaktion mit Chromatin)  Richtungssinn Durchtrit beladener Kerntransportrezeptoren durch den NPC geschieht entlang der FG-Wiederholungen, die von bestimmten NPC-Proteinen präsentiert werden differentielle Lokalisation von Ran-GTP im Zellkern und von Ran-GDP im Cytosol der Zelle gibt Kernimport und -export seinen Richtungssinn GTP-Hydrolyse, die zu Ran-GDP führt, wird auf der cytosolischen Seite des NPC von Ran-GAP stimuliert

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Zugang zum Kern durch Modulation der Lesbarkeit von NIS Regulation auch durch Bindung an das Cytoskelet oder anderes Organell Kontrolle des Kernimports während T-Zell-Aktivierung  nucleärer Faktor aktivierter T-Zellen (NF-AT) ist ein Transkriptionsregulatorprotein, das in ruhenden T-Zellen in phosphorylierter Form im Cytosol vorkommt T-Zellen werden durch Fremd-Gene aktiviert  dabei steigt intrazellulär die Calcium-Konzentration an die Proteinphosphatase Calcineurin bindet an NF-AT und dephosphoryliert es  das dephosphorylierte NF-AT kann in den Zellkern importiert werden, wo es die Gentranskription bestimmter Gene aktiviert bei niedriger Calcium-Konzentration wird NF-AT wieder phosphoryliert und verlässt den Zellkern, die Gentranskription wird gehemmt Immunsuppressiva hemmen die Fähigkeit des Calcineurins, NF-AT zu dephosphorylieren  blockieren Ansammlung von NF-AT im Zellkern und somit die T-Zell-Aktivität Herstellung von Transkriptionsfaktor, der die Expression der Enzyme für Cholesterinbiosynthese steuert wenn genügend Cholesterin in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums vorhanden ist, ist es mit SCAP verankert, welches Cholesterin bindet wenn die Cholesterinbindestelle auf SCAP frei ist, kommt es zu einer Konformationsänderung  ein Transportvesikel bringt SCAP zusammen mit SCREBP (Sterol Response Element Binding Protein) zum GolgiApparat Golgi-interne Proteasen spalten SREBP  cytosolische Domäne aus der Membran wandert in den Zellkern, bindet an Promotoren von Genen, die für die Cholesterin-Synthese da sind  Transkription von Cholesterin wird erhöht Die Kernhülle zerfällt während der Mitose Kernlamina (bildet 2D-Flächengiter) verbunden mit NPCs und Transmembranproteinen  Stabilität  Interaktion mit an Membranproteinen wechselwirkendem Chromatin Depolymerisation der Kernlamina durch Phosphorylierung der Lamine und Proteine der inneren Kernmembran während der Mitose  Kernporenkomplexe gehen kaput im Verlauf der Mitose werden dann die Zellkernhülle und die Kernlamina neu gebildet Bei allen Metazoen wird die Zellkernhülle im Verlauf der Mitose fragmentiert, in anderen Spezies bleibt sie intakt (Zellkern teilt sich durch Spaltung) Ran-GTPase/Ran-GEF an Chromatin gebunden (Ran-GTP-Wolke um Chromatin) Reimport der Proteine durch NLS Phosphorylierung der Lamina führt zu Abbau, Dephosphorylierung führt zu Aufbau Kernhülle erst um einzelne dekondensierte Tochterchromosomen  Strukturen fusionieren  Zellkern bildet sich aus Zusammenfassung Transport Zellkern – Cytosol Zellkernhülle = innere + äußere Membran (äußere setzt sich im ER fort) bidirektionaler Transport vom Kern ins Cytosol und umgekehrt durch NPCs (kleine Moleküle diffundieren passiv, größere müssen aktiv transportiert werden) Proteine mit NLS – aktiver Transport nach innen Moleküle mit NES (RNA, Ribosomenuntereinheiten) – aktiver Transport ins Cytosol GTPase Ran liefert durch Ran-GEF sowohl freie Energie ala auch Richtungssinn für Transport Zellen regulieren Transport von Kernproteinen durch NPCs, indem NLS maskiert/unzugänglich gemacht wird NLS werden nicht entfernt, somit können Zellkernproteine wiederholt importiert werden (Zellteilung)

Proteintransport in Mitochondrien -

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doppelte Membran, spezialisiert auf ATP-Synthese eigene DNA, eigene Ribosomen und andere Komponenten der Proteinbiosynthese – Import der meisten Proteine (Kern – Cytosol) in spezielle Subkompartimente (Proteintranslokation: Matrixraum, Intermembranraum mit jeweils spezifischer Proteinausstatung) neue Mitochondrien entstehen durch Wachstum, nachfolgende Teilung (Wachstum abhängig vom Proteinimport/Proteintranslokation durch entsprechende Membran) Translokation in Mitochondrien

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abhängig von Signalsequenzen und Proteintranslokatoren Import innerhalb von Sekunden bis Minuten nach Freisetzung vom Ribosom werden als Präproteine im Cytosol synthetisiert und durch postranslationalen Mechanismus transloziert (Signalsequenz) Proteine der Matrix (dauerhafte Entfernung der Sequenz) Proteine der Außen-, Innenmembran und Intermembranraum (keine Entfernung der Signalsequenz; Lokalisation und Verankerung in entsprechendem Subkompartiment die Signalsequenz für den Matrixraum ist eine amphiphatische Alpha-Helix, die an einen Importrezeptor gebunden ist  sowohl positive, als auch apolare und ungeladene Aminosäure-Reste zeigen nach außen Proteintranslokatoren in Mitochondrien sind Transmembrankomplexe  multimere Aggregate verschiedener Membranproteine, die die Translokation von Proteinen durch Membranen des Mitochondriums vermitelt  TOM (Translocase of the Outer Mitochondrial membrane)  Transport durch die Außenmembran  TIM (Translocase of the Inner Mitochondrial membrane)  Transport durch die Innenmembran/TMProteine)  TIM22 und TIM23-Komplexe kleiden den Importkanal aus  auf der Matrixseite ist TIM23 in einem Proteinkomplex gebunden, der Hsp70 enthält  arbeitet als Import-ATPase und setzt ATP-Hydrolyse ein, um Proteine zu bewegen  in tierischen Zellen kann die Zusammensetzung der Untereinheiten variieren  SAM (Sorting and Assembly Machinery) hilft TOM bei Insertion von TM-Proteinen  OXA (cytochrome Oxidase Activity)  Insertion im Organell synthetisierter Proteine, Membraninsertion von Matrixproteinen  N-terminale Signalsequenz des mitochondrialen Vorläuferproteins wird durch Rezeptor des TOM-Komplexes erkannt  Protein wird durch TIM23-Komplex transloziert  durchspannt vorübergehend beide Mitochondrienmembranen  Signalsequenz wird in Matrixraum von Signalpeptidase hydrolytisch abgespalten und man erhält das reife Protein  das Signalpeptid wird dann abgebaut Proteinimport in Mitochondrien-Matrix Proteine sind ungefaltet und binden deshalb an Chaperone ATP-Hydrolyse (Chaperone) und Membranpotential treiben Import an gebundenes cytosolisches Hsp70-Chaperon wird im ATP-abhängigen Schrit vom Vorläuferprotein abgelöst nach initialer Insertion der Signalsequenz und benachbarter Bereiche der Polypeptidkete in den Translokationskanal des TOM-Komplexes trit die Signalsequenz mit TIM in Wechselwirkung Signalsequenz wird in den Matrixraum transloziert und nutzt die Energie aus dem Membranpotential mitochondriales Hsp70 (Teil des Import-ATPase-Komplexes) bindet an die Polypeptidkete in dem Maße, wie sie nach und nach im Matrixraum zugänglich wird und zieht dabei mithilfe der Energie aus der ATP-Hydrolyse das Protein durch den Translokationskanal Proteintransport in innere Mitochondrienmembran und Intermembranraum durch mehrere Wege durch TOM und TIMs:  N-terminale Signalsequenz (im Matrixraum)  TIM zieht Protein komplet in die Matrix  nach Abtrennung der Signalsequenz gibt es ein neues N-terminales Ende  2. Signalsequenz lenkt Protein zum OXA-Komplex (Einbau in innere Membran) durch TOM und TIMs:  N-terminale Signalsequenz wird im Matrixraum abgespalten  es folgt eine Transferstoppsequenz  TOM zieht das restliche Protein in den Intermembranraum und die Transferstoppsequenz verbleibt nach Freigabe von TIM23 im Intermembranraum durch TOM und Intermembranraum  Chaperone des Intermembranraums binden das Protein und leiten es zu TIM22  TIM22 baut Proteine ohne Zuhilfenahme von ATP oder Hsp70 unter Hinzunahme des Membranpotentials in den Intermembranraum ein und ermöglicht den Metabolitransport in der Matrix

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lösliche Proteine des Intermembranraums nehmen einen der genannten Wege, bevor sie im Membranzwischenraum durch eine zweite Signalpeptidase, die ihr Aktivitätszentrum im Intermembranraum hat und die hydrophile Signalsequenz entfernt, freigesetzt werden Mia = Mitochondrial intermembrane space assembly = Intermembranaufbau  Oxidation, Reduktion von importierten Proteinen  lösliche Intermembranproteine werden während des Transports durch das Protein Mia40 oxidiert  Mia40 bildet kovalenten Übergangszustand über zwischenmolekulare Disulfidbindung  hilft beim Durchziehen des zu transportierenden Proteins durch TOM Porenbildende Proteine der äußeren Mitochondrienmembran porenbildende Proteine (Porine, Beta-Fassproteine) sind für Ionen und Metabolite durchlässig (nicht für Proteine) Import durch TOM-Komplex in Intermembranraum  Faltungsinhibition durch Chaperone  Bindung an SAMKomplex und Einbau in die äußere Membran Zusammenfassung Transport Cytosol – Mitochondrien Mitochondrien besitzen ein eigenes genetisches System, synthetisieren nur in geringem Ausmaß selbst Proteine, da der Großteil aus dem Cytosol importiert wird Proteine werden ungefaltet in die Matrix transportiert (ATP-Hydrolyse, Membranpotential) cytosolische Chaperone der Hsp70-Familie halten Proteine ungefaltet zweiter Satz Hsp70-Proteine (mitochondrial) zieht Proteine in Matrixraum Signal-spezifische Translokation N-terminal verankerte Signalsequenz, die abgespalten wird oder intern liegende Signalsequenz, die beibehalten wird Einbau in den Intermembranraum erfolgt mitunter durch eine zweite hydrophobe Signalsequenz, die nach proteolytischer Spaltung der ersten amphiphilen Signalsequenz freigelegt wird

Peroxisomen -

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eine Membran, keine DNA, Ribosomen  alle Proteine sind zellkern-kodiert hohe Mengen an Redoxenzymen (Catalase, Urat-Oxidase) als kristalline Einschlüsse Organellen mit hohem Sauerstoffumsatz (Rudimente, haben hypothetisch in urtümlichen Organellen gesamten oxidativen Stoffwechsel übernommen und toxischen Sauerstoff im Organell herabgesetzt und chemische Energie erzeugt  Energieerzeugung wurde dann von Mitochondrien übernommen) benutzen molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid zur Durchführung oxidativer Reaktionen 60 Monooxygenasen und Oxidasen, oxidativer Abbau von Fetsäuren, Beta-Oxidation, Alkohol etc. kurze Signalsequenz lenkt Proteinimport Peroxisomen entstehen aus vorhandenen und neu gebildeten Vorläufern  peroxisomale Vorläufervesikel knospen vom ER ab  der Mechanismus hängt von Pex19 ab  peroxisomale Vorläufervesikel fusionieren miteinander und mit bereits vorhandenen Vesikeln  Peroxisomen-Membran enthält Importrezeptoren und Proteintranslokatoren für den Import peroxisomaler Proteine 6 von 23 verschiedenen Peroxinen (Pex) bilden einen Translatorkomplex auch gefaltete Proteine werden importiert Pex5 ist ein löslicher Importrezeptor, begleitet Cargo-Protein Relevanz von peroxisomalen Störungen (fehlgeleitete Lipidsynthese) wesentliche biosynthetische Funktion von Peroxisomen ist die Katalyse der ersten Reaktionen zu Plasmamlogenen Plasmalogene sind die häufigsten Phospholipide (80-90%) in Myelinscheiden Fehlfunktionen von Peroxisomen: neurologische Störungen Zellweger-Syndrom: Mutation im Pex2-Gen, gekennzeichnet „leere“ Peroxisomen  Störung der peroxisomalen Biogenese Verlust entsprechender Leber-, Nieren- und Gehirnfunktion  postnatal lethal Zusammenfassung Peroxisomen:

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spezialisiert auf Redoxreaktionen von molekularem Sauerstoff, Bildung von Wasserstoffperoxid für weitere Oxidationsprozesse überschüssiges H2O2 wird von Catalase abgebaut Proteine werden im Cytosol synthetisiert kurze Aminosäuresequenz aus drei Aminosäuren bildet das Importsignal Importkomplexe können gefaltene Proteine importieren

Endoplasmatisches Retikulum o o o o o

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ER-Membran stellt mehr als 50% des Gesamtbestandes netzartiges Labyrinth (etwa 10% des Zellvolumens) zentrale Funktion in Lipid-, Proteinbiosynthese, intrazellulärer Calcium-Speicher an ER-Membran Produktion von Transmembranproteinen, Membranlipide (ER, Golgi, Lysosomen, Endosomen, Transportvesikel, Plasmamembran) membranverankerte Ribosomen überziehen die Oberfläche des rauen ER, dient z.B. der Herstellung und Sezernierung von Verdauungsenzymen glates ER ist stärker ausgeprägt in Zellen mit Lipid-Metabolismus und Synthese von Steroidhormonen, z.B. Leydig-Zellen in den Hoden, die Testosteron bilden Cotranslationale Translokationen werden durch am ER haftende Ribosomen durchgeführt (raues ER)  dabei binden Ribosomen an ER-Membran Transmembranproteine werden nur teilweise durch ER-Membran geschleust lösliche Proteine gelangen durch die Membran in den ER-Innenraum Protein wird durch ER-Signalsequenz ins ER geleitet bei der Postranslationalen Translokation wird das Protein erst fertig synthetisiert und dann erst vom Ribosom zur Translokation freigesetzt  bei Transport in Mitochondrien, Zellkern oder Peroxisomen ER-Translokation ist Zusammenspiel aus Signal-Sequenz, Signalerkennungspartikel (SRP) und spezifischem SRPRezeptor SRP pendelt zwischen Cytosol und ER-Membran, bindet Signalsequenz  Anlagerung an SRP-Rezeptor in der ER-Membran SRP wickelt sich um große Ribosomenuntereinheit  sobald Signalsequenz aus dem Ribosom auftaucht, bindet SRP und verursacht eine Blockade der Elongationsfaktorbindungsstelle zwischen kleiner und großer Untereinheit des Ribosoms  die Translation wird gestoppt, bis SRP an die Polypeptidkete gebunden hat der SRP-Rezeptor in der ER-Membran bindet den SRP-Ribosomen-Komplex  der Komplex wird dann auf einen Translokator in der ER-Membran übertragen, SRP und der SRP-Rezeptor lösen sich und die Translation kann fortgesetzt werden  auch die Translokation ins Innere des ER wird fortgesetzt Cotranslationaler Transfer erzeugt zwei Ribosomenpopulationen membranverankerte und freie Ribosomen sind strukturell und f...