7) Batteriofagi_ Appunti Lezione e Libro PDF

Preview

Summary

Download 7) Batteriofagi_ Appunti Lezione e Libro PDF

Description

BATTERIOFAGI Virus parassiti dei batteri, hanno come spetro d’ospite i procarioti. I virus dei batteri sono costituiti da acido nucleico racchiuso da un rivestimento proteico. I virus parassiti dei batteri sono in natura molto abbondanti> 1031 ; la dimensione, forma, composizione macromolecolare e capacità genetica molto diverse tra loro. C’è un’enorme variabilità del comportamento e della forma di questi virus. I virus batterici si distinguono in -

Fagi virulenti: modello T4 (porta a lisi la cellula ospite, ciclo litico) Fagi temperati: modello λ (queste possono infettare le cellule batteriche senza portarle alla lisi, integrandosi mediante ciclo lisogenico)

La morfologia più tipica è caratterizzata da una complessa simmetria: -

Testa ecosaedrica che racchiude il gene virale Coda più o meno grande Piastra basale o una struttura filiforme ad estremità della coda che poi permetterà l’inserimento del DNA nella cellula ospite Il genoma può essere o RNA o DNA a singola o a doppia elica

Ci sono anche fagi più semplici:

Fagi filamentosi Batteriofago φX174 di E.Coli DNA a singola elica ha un genoma molto piccolo con geni embricati cioè la stessa sequenza codifica per più prodotti, cambia solo la sequenza d’inizio. Si ha la sovrapposizione di sequenze codificanti Fago sfi21 di streptococco Prende contatto con la superficie della cellula ospite e in seguito dell’infezioni si ha la lisi della cellula, la parete della cellula non si rompe molto facilmente per questo motivo i virus sintetizzano dei fattori che permettono la lisi della membrana con conseguente liberazione della progenie dei virus. Si può andare incontro ad un ciclo litico o lisogenico. Batteriofago M4 E’ un trasposone travestito da fago, infatti ha tutte le caratteristiche fenotipiche di un fago, per replicare il proprio genoma inserisce le copie nell’ospite (cromosoma batterico) prima che questo si disintegri. Virus degli archea Hanno il DNA circolare a doppio filamento e una morfologia fusiforme. Nei termofili e metanogeni.

Fagi virulenti T4 Il virione di T4 presenta una testa icosaedrica contenente l’acido nucleico, tra la testa e l’inizio della coda una sorte di collare (colletto) raggruppa 6 piccole fibre, la coda è costituita da una doppia struttura tubulare caratterizzata dall’essere circondata da una guaina contrattile, la coda termina con una piastra esagonale a cui sono attaccate le lunghe fibre caudali e spine caudali. La coda è una struttura importante che durante l’infezione cambia conformazione, comportando la contrazione della sua guaina esterna e la penetrazione del tubo interno nella cellula per il trasferimento del DNA. T4 ha un genoma che codifica per tutte le proprie strutture, coda, testa, collo e regioni che codificano per enzimi, per la replica del genoma e i T4 possono anche attuare sistemi di modificazioni del DNA in modo da distruggere, mediante nucleasi, il DNA cellulare non modificato e non distruggere il DNA proprio del T4 che è stato modificato. Se abbiamo una piastra petri con un terreno nutritivo con cellule di E.Coli e fago virale T4 incubato a 37°, al termine dell’incubazione la patina batterica che si osserva sarà disseminata di aree circolari trasparenti dove i batteri non sono cresciuti perché lisati dai batteriofagi. Se ci fosse stata invece una crescita batterica avremmo avuto una patina torbida. Le fibre caudali toccano il batterio, poi si attaccano le spine: prima collisione casuale; Poi si ha il legame recettore-antirecettore, con un meccanismo a siringa il DNA viene iniettato, entra così l’acido nucleico. L’acido nucleico esprime i propri geni soggetti ad un raffinato controllo dell’espressione genica e si avranno tutti gli step che portano alla costruzione del virus, con successivo autoassemblaggio, nella testa entra il genoma. Quando i fagi sono pieni viene secreto lisozima che porta alla rottura delle cellule, formazione delle placche di lisi. Le placche di lisi contengono particelle fagiche che sono state prodotte dalla cellula batterica inizialmente infettata e che sono state propagate alle cellule adiacenti compiendo un certo numero di cicli successivi di infezione-produzione di nuovi fagi-lisi. La placca è osservabile ad occhio nudo perchè il suo diametro è nell’ordine del mm. Dopo circa 30 min dall’infezione viene liberata la progenie virale.

Ciclo litico dei fagi virulenti 1) attacco, il virus atterra sulla parete della cellula batterica. adsorbimento 2) Interazione specifica tra virus e recettore di superficie (quest’ultimi sono proteine, polisaccaridi

lipopolisaccaridi), nei T4 queste sono proteine della membrana esterna. 3) Penetrazione, si ha la contrazione della guaina e l’acido nucleico entra nel citoplasma della cellula ospite, si ha anche un attacco più stabile con le spicole e il DNA attraversa tutti gli strati 4) Moltiplicazione, ci sono geni precoci e geni tardivi.

ADSORBIMENTO È la fase iniziale del ciclo riproduttivo virale. Avviene in 2 stadi: -

Reversibile che segue un evento di collisione casuale tra fago e batterio Irreversibile dovuto ad interazione specifiche (adsorbimento) tra componenti specializzate del virione e strutture di superficie della cellula ospite (recettori)

Molti batteriofagi dei gram- possono riconoscere componenti diverse del lipopolissaccaride o proteine specifiche della membrana esterna, mentre fagi che infettano batteri gram+ possono riconoscere componenti del peptidoglicano o acidi tecoici, proteine di superficie o componenti della stessa membrana plasmatico; altri fagi riconoscono componenti della capsula polisaccaridica. Anche le proteine dei pili possono essere utilizzate come recettori dai fagi filamentosi e dai fagi a RNA. Le strutture del virione specializzate per l’assorbimento possono essere le fibre o altre proteine della coda, estroflessioni presenti su un vertice specializzato del capside o anche lipidi del capside. L’assorbimento può richiedere ioni o altri fattori ambientali. PENETRAZIONE Quasi tutti i batteriofagi noti infettano il batterio mediante iniezione del proprio acido nucleico. In DNA adsorbito entra nella cellula in modo ordinato; per alcuni fagi l’ingresso del genoma fagico nella cellula non avviene in modo continuo ma graduale, dopo l’ingresso di una porzione del DNA vi è una pausa tale da permettere l’espressione dei geni, definiti precoci, in essa presenti, e solo successivamente viene iniettato il genoma restante. Una volta che l’informazione genetica del fago è stata iniettata nel citoplasma batterico, essa viene espressa per attuare la moltiplicazione virale nella quale possiamo riconoscere 4 processi modulari che si svolgono sequenzialmente in modo coordinato: replicazione genoma virale, produzione proteine morfogenetiche, assemblaggio del virione (morfogenesi) e infine la lisi della cellula ospite con rilascio nell’ambiente di nuove particelle virali.

Batteriofago T4 ciclo litico Questo fago rappresenta uno dei sistemi genetici maggiormente studiato. La particolarità del sistema T4 è legata alla capacità di modificare il nucleo dell’RNA polimerasi batterica e alla peculiare strategia per il controllo temporale dell’espressione genica durante il ciclo litico. Il ciclo di sviluppo di T4 presenta le seguenti fasi: 1. Adsorbimento a livello del recettore del batterio e iniezione del DNA di T4. La guaina della coda si contrae e avvicina la testa del fago verso la piastra basale. Il cilindro interno viene spinto attraverso la parete del batterio, digerita da un enzima contenuto nella coda. 2. Trascrizione dei geni precoci del fago, in meno di un min vengono spente le sintesi macromolecolari dell’ospite e iniziano quelle del fago. In questa fase vengono sintetizzate 3 tipi di proteine che permettono l’arresto della sintesi di RNA batterico, degradazione del nucleoide batterico e inibizione della sintesi proteica dell’ospite. 3. Sintesi di un secondo gruppo di proteine intermedie che intervengono nella replicazione del DNA di T4. 4. Sintesi del DNA, con tasso di replicazione 10 volte maggiore rispetto al DNA batterico

5. Sintesi di proteine tardive per la morfogenesi virale 6. Morfogenesi: assemblaggio indipendente dei procapsidi, code e fibre, impaccamento del DNA nelle teste e assemblaggio del virione 7. Lisi delle cellule e rilascio di nuovi virioni

Il T4 sintetizza proteine precoci immediate , proteine precoci ritardate e proteine tardive. Le proteine precoci immediate: sono enzimi che permettono la trascrizione solo di geni fagici. nucleasi, enzimi che adenilano la trascrittasi batterica che non riconosce più i promotori dell’ospite e trascrive solo i geni fagici ritardati. Proteine precoci ritardate: Dopo 5 minuti finisce questa fase. -enzimi che modificano la citosina in 5-idrossimetilcitosina glicosilata -nucleasi che degradano il DNA non modificato -polimerasi e ligasi per la replica del DNA fagico -RNApol modificata che trascrive solo i geni tardivi Proteine tardive: con il nuovo genoma si sintetizzano le proteine tardive che permettono la costruzione di strutture ed enzimi come lisozima. Il lisozima si lega al legame β1-4 tra i 2 zuccheri della parete per poi romperla. I batteriofagi possono presentare un genoma a ssDNA o ssRNA e di conseguenza avranno modalità replicative differenti

Nella fase di moltiplicazione si ha la semplice replicazione del genoma: nel Leviviridae, i batteriofagi più studiati sono MS2 e Qβ, che infettano E. Coli

ssRNA genico -> RNApol virale -> dsRNA ->RNApol virale -> ssRNA (genoma e messaggero) l’acido nucleico è un RNA a catena singola che funge da materiale ereditario sia, direttamente, da messaggero. Schema di replicazione-RNA a singola catena con polarità di RNA messaggero: (+)RNA - Può funzionare subito come mRNA. -Il genoma virale ha due funzioni essenziali: 1) Agisce come mRNA 2) Serve da stampo ad una molecola complementare di (-)(RNA) e l’ RNA- sua volta serve come stampo per la sintesi di (+)RNA identica al genoma virale

-Le nuove molecole (+)RNA possono a loro volta servire come: 1)mRNA per altre proteine 2)genoma per i virus neoformati

nel φx174 si ha:

ssDNA -> dsDNA (RF) -> ssDNA (genoma), mRNA, RF questi tipi di fagi contengono una molecola di DNA circolare covalentemente chiusa a singola elica. Questi fagi nella prima fase della loro replicazione hanno il passaggio dalla forma ssDNA circolare alla forma dsDNA circolare; in questo passaggio utilizzano differenti combinazioni di enzimi replicativi dell’ospite. Essendo l’ssDNA circolare privo di estremità 3’-OH questi virus hanno costituito un sistema modello ideale per l’inizio della replicazione mediante produzione degli inneschi a RNA da parte dell’RNA polimerasi o della DNA primasi. Nel processo di replicazione sono implicati 3 stadi: 1. Conversione dell’ssDNA + (filamenti di DNA positivi) virale circolare chiuso covalentemente in una forma a doppio filamento ( SS -> RF). Dopo la formazione del dsDNA (RF) inizia la fase di trascrizione. 2. La moltiplicazione della forma replicativa (RF-> RF). Nei 20 min successivi allo stadio 1 si forma una progenie di 60 copie di RF, a 25 min viene bloccata la moltiplicazione di RF e la sintesi del DNA dell’ospite. La replicazione avviene attraverso il meccanismo rolling circle (cerchio rotante). 3. Le copie di DNA RF sono convertite in ss (doppio filamento). Il filamento ss generato dal rolling circle (che si innesca nei 10 min successivi alla replicazione )viene circolarizzato (si chiudono le estremità) e impacchettato nei procapsidi. Nel caso di φx174 la lisi del batterio avviene 40 minuti dopo l’inizio del ciclo.

all’interno del capside fagico può essere inglobato qualsiasi genoma delle stesse dimensioni, anche se in genere i frammenti di DNA cromosomico vengono polverizzati, se questo non avviene si forma un fago trasducente 5) Maturazione 6) Liberazione, cioè il rilascio della progenie matura. In gene escono per lisi, alcuni fagi escono senza lisi tramite gemmazione Tutti questi passaggi avvengono in meno di 30 min Il DNA all’interno del capside deve essere superavvolto Incapsidamente del ssDNA dei fagi filamentosi: tramite meccanismo a cerchio rotante si formano filamenti positivi della progenie. Il fago si accosta prima alla membrana interna, poi allo spazio intermembrana e poi attraversa la membrana esterna, e così viene ricoperto da una guaina contrattile e il fago maturo fuoriesce, all’estremità ha recettori che poi si andranno a legare ad antirecettori. Struttura batteriofago ϕ 6 Genoma a dsRNA provvisto di envelope, tutto il nucelocapside entra nella cellula dopo la fusione del peplos con le MC

FAGI TEMPERATI Hanno 2 fasi nel proprio ciclo vitale: -

Ciclo lisogenico Ciclo litico

Ci sono dei fattori ambientali che determinano quale via seguire.

La scelta tra ciclo litico e ciclo lisogenico è determinate da: -condizioni fisiologiche della singola cellula -fattori ambientali, posso essere ad esempio le sostanze nutritive, se sono poche i fagi rimangono latenti nell’ospite fino a quanto non hanno un maggior apporto nutritivo per poter attivate il ciclo litico. -Ciclo lisogeno è più frequente in carenza di nutrienti e elevata MOI. -Ciclo litico durante la crescita rapida dell’ospite a temperature >30°C

Lisogenia Particolare relazione tra il fago e il suo ospite cartterizzata dalla presenza del genoma virale (profago) integrato nel genoma dell’ospite (batteri lisogeni). Il genoma del profago può mantenersi libero nel citoplasma sotto forma di plasmide, a basso numero di copie, oppure integrato nel cromosoma batterico, come il fago λ e la maggior parte dei fagi temperati noti. In generale impedisce l’espressione dei geni litici e permette l’espressione di geni per il profago. In particolari condizioni il virus può essere “indotto” secondo un processo di induzione, generare una progrenie fagica e determinare la lisi della cellula ospite. È probabilmente favorita dalla carenza di nutrienti, da agenti che danneggiano il DNA. Si verifica nel caso di un’alta molteplicità d’infezione cioè se un batterio viene attaccato contemporaneamente da molte particelle virali (fagi), siccome tante cellule andranno incontro a lisi, si creano cicli lisogenici per preservare la progenie fagica (Il profago: i frammenti del DNA hanno in sé tutte le informazioni per produrre un virus completo. Il profago rimane latente nel ciclo lisogenico e si replica con il batterio)

Fago λ: isolato da Lederberg nel 1951 Ha una testa, una coda senza piastra e spicole basali, ha solo fibre caudali. Si può replicare in 2 modi: o a cerchio rotante o replicazione bidirezionale Dopo aver inglobato il genoma scelgo una via o l’altra Cultura litogena: continiene genoma λ integrato. Il suo genoma è costituito da una molecola di dsDNA codificante per 50 geni. Nel virione il DNA si trova in forma lineare ma immediatamente dopo l’infezione il DNA del fago circolarizza grazie ad estremità coesive dette cos. Partendo dal sito cos e procedendo in senso orario troviamo: 1. Modulo dei geni morfogenetici 2. Regione dispensabile 3. Modulo per la ricombinazione: contiene il sito at e i geni int e xist necessari per la ricombinazione sito specifica tra il genoma di lambda e quello batterico, e i geni exo, bet e gam

4. Regione regolativa: contenente geni N, cI, cro, cII che regolano l’espressione dei geni virali, la scelta tra ciclo litico e lisogenico e la loro esecuzione 5. Modulo replicativo: si trova i geni O e P e l’origine di replicazione ori 6. Regione tardiva: contiene il gene regolatore Q che controlla l’espressione dei geni tardivi, responsabile della lisi dell’ospite

Il DNA lineare di λ iniettato nella cellula immediatamente circolarizza sfruttando l’estremità cos in grado di appaiarsi spontaneamente; la chiusura covalente del DNA è assicurata dalla DNA ligasi batterica. In seguito il super avvolgimento negativo indotto dalla DNA girasi prepara il DNA fagico per i processi di trascrizione, replicazione, ricombinazione e integrazione. Il destino del DNA è dicotomico: può replicare e compiere ciclo litico, o integrarsi nel cromosoma batterico e instaurare la lisogenia. La RNA polimerasi batterica trascrive il genoma di λ in 5 unità principali a partire dai seguenti promotori: 1. Promotori divergenti: PR e PL che non richiedono attivatori trascrizionali e controllano 2 operoni di destra e di sinistra 2. Il promotore PR2 controlla l’espressione della sintesi tardiva di un operone di tarde dimensioni che contiene dei geni strutturali 3. Promotore PRE che richiede il regolatore positivo CII controlla inizialmente l’espressione di cI (il ene= che codifica per il repressore di PR e PL 4. Il promotore PRM che richiede CI (il repressore) come regolatore positivo, controlla l’espressione del repressore nella condizione di lisogenia

La cinetica della sintesi degli mRNA di lambda prevede:

1. Fase precoce: trascrizione dai promotori PR PL termina in corrispondenza di terminatori situati dopo il gene N (a sx) e cro (destra). La proteina N è un’antiterminatore in quanto interagisce con l’RNA polimerasi rendendola insensibile ai segnali di terminazione 2. Fase ritardata: trascrizione di PR PL continua coprendo l’intero operone di sinistra fino a int e di destra fino a Q. inclusi O e P. infine viene attivata la trascrizione dei geni tardivi a partire da P R2. Gli operoni di sinistra e di destra comprendono sia i geni necessari per la via litica che lisogenica.

Tutto questo permette al fago di temporeggiare nella scelta tra i due cicli. cI e cro sono trascritti a partire rispettivamente da PRM e PR. i due promotori condividono l’operatore OR costituito da 3 siti di legame per le 2 proteine regolatrici CI e Cro: O R1 OR2 OR3. A causa dell’ingombro sterico l’RNA polimerasi non può legarsi simultaneamente a 2 promotori. Inoltre la trascrizione di cI da P RM richiede un regolatore positivo che è la stessa proteina CI ed è repressa da Cro, mentre la trascrizione di cro da P R non richiede attivazione ed è repressa da CI. In che modo Cro e CI regolano il ciclo replicativo del fago λ? → per l’induzione del ciclo litico (B) un dimero di Cro si lega a OR3 che si sovrappone a PRM → l’espressione di CI è bloccata da Cro, mentre OR2 e OR1 sono liberi e l’RNA polimerasi può legarsi in corrispondenza di PR e trascrivere i geni che determinano l’istaurarsi del ciclo litico. Per il completo istaurarsi del ciclo litico (e del ciclo lisogenico visto che queste fasi sono comuni ad entrambi) è necessario che l’RNA polimerasi si leghi a PL → i 2 promotori vengono regolati alla stessa maniera da Cro e CI → l’affinità di legame di Cro e CI è identica per gli operatori di destra e per quelli di sinistra → quando viene attivato 1 promotore si attiva anche l’altro (e PRM viene represso)

Induzione -Fattori che danneggiano il DNA (UV, mutageni chimici) -Intervento di RecAche determina il taglio di cItra i due domini -Escissionasidetermina la liberazione del profago che va incontro al ciclo litico Impacchettamento del DNA del fago λ Per l’impacchettamento del DNA in un capside sono necessari e sufficienti 2 siti costra cui deve essere presente una quantità di DNA virale ≥75% e ≤105% TITOLAZIONE FAGICA Si effettua con una tecnica di soft agar e serve per determinare la quantità/numero di fagi in una sosprensione. Si prendono piastra con un terreno nutritivo e nella provetta una certa quantità di batteri (circa 100μl di E. Coli e 10 μl di fago λ) questa soluzione unita all’agar molle viene versata nella piastra formando un TOP

AGAR, incubando tale piastra a 37° i microrganismi si moltiplicano ed ogni placca di lisi corrisponde ad una singola infezione fagica. ESPERIMENTO DI ELLIS E DELBRUK È stato il primo esperimento a dimostrare che il ciclo replicativo virale si compone di tre fasi: 1) l'inizio dell'infezione; 2) la replicazione ed espressione del genoma; 3) il rilascio dei virioni maturi dalla cellula infetta. In questo esperimento i batteriofagi erano aggiunti a una coltura di batteri in fase di replicazione esponenziale, e dopo pochi minuti le cellule erano diluite, così da prevenire ulteriori interazioni tra fagi e le cellule. Quest...