9- Epigenetica - Appunti di lezione 10 PDF

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Sbobine lezione epigenetica prof Carnevali...

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EPIGENETICA Nel momento in cui si ha il processo di fecondazione vediamo che tutto il dna del nostro embrione viene demetilato, quindi abbiamo cellule che possono differenziarsi in qualsiasi tipo di popolazione in futuro. Quindi questo processo di demetilazione accompagna tutta la fase di segmentazione, mentre con la gastrulazione abbiamo il differenziamento cellulare e quindi il dna verrà di nuovo metilato. Da questo processo vediamo che fuggono solo una tipologia di cellule ovvero le PGD le quali tornano ad essere demetilate e quindi solo successivamente, quando ci sarà un differenziamento sessuale vedremo che torneranno ad essere metilate. Questo processo avviene normalmente durante lo sviluppo embrionale e segue la vista del nostro individuo, normalmente durante le diverse fasi. Noi avevamo del tutto accantonato le teorie di La Mark (storia della giraffa che aveva il collo lungo non era molto accettata perché eravamo tutti darwiniani per cui per noi l’evoluzione passava attraverso delle mutazioni). In realtà La Mark è stato riscoperto grazie a Conrad che nel 1942 coniò questo termine EPIGENETICO. Egli capi che era molto importante tenere in considerazione le interazioni dei geni con l’ambiente perché queste interazioni possono portare a una modificazione del fenotipo. Quindi il concetto di epigenetica che abbiamo oggi è il seguente: sono cambiamenti del fenotipo che sono ereditati ma che non coinvolgono mutazioni genetiche. Quindi abbiamo cambiamenti del fenotipo che possiamo osservare da una generazione all’altra ma queste differenze non sono associate a mutazioni del DNA. Nell’era post-genomica, è molto chiaro che non sono solo le mutazioni a creare queste differenze perché se noi facciamo un raffronto tra due diversi individui vediamo che questi differiscono tra loro per ben meno dell’1% del DNA però quindi questo ci porta a sostenere che la genetica gioca un piccolo ruolo nelle differenze fenotipiche e quindi molta enfasi è stata data all’epigenetica che al contrario ha un ruolo significativo. E sempre questo ricercatore ci ha anche detto che i fattori molecolari dei processi che regolano l’attività del dna spesso è indipendente dalle sequenze e questi processi sono ereditati quindi quando una cellula si divide mitoticamente queste differenze sono stabili e noi continuiamo a vedere lo stesso fenotipo. Quindi l’epigenetica è l’arte di come si interpreta il DNA, e questo sulla base dei processi che organizzano la cromatina. Quindi il dna pur essendo di base lo stesso può essere interpretato in modo diverso. Quindi l’epigenetica, parola che deriva dal greco, è un qualche cosa che va sopra la genetica è un controllo che va sopra la genetica e questo controllo è molto complesso, vedremo poi dei dati di laboratorio, viene regolato da processi molto diversi tra loro. Intanto noi abbiamo parlato più volte dell’organizzazione della cromatina e abbiamo detto che è molto importante il dna ma questo non è da solo in quanto è associato agli istoni che nell’interpretazione del dna sono molto importanti quindi giocano un ruolo decisivo e quindi le modifiche al livello istonico possono contribuire alla trascrizione di dna. Poi abbiamo tutta una serie di molecole piuttosto nuove, parliamo da poche di microRNA, importanti i quali agiscono sull’RNA regolandone la traduzione. Quindi il dna viene regolarmente trascritto ma gli Mrna non vengono tradotti quindi abbiamo questa inibizione della sintesi proteica e il tutto avrà un effetto al livello di morfologia dell’organismo. Infine questo è un processo noto che conosciamo, perché parlando di differenziamento abbiamo detto più volte che lo spartito è lo stesso ma viene poi suonato in maniera diversa, perché parte dei geni sono silenziati mediante processi come per esempio la metilazione. Quindi la presenza di gruppi metili al livello dei promotori sono responsabili del blocco a seconda se ci troviamo nel promotore o di un attivazione della trascrizione se la metilazione avviene al livello di un repressero. Se la metilazione avviene nel dna questo in maniera selettiva sceglie di metilare una regione ben precisa che corrisponde alle isole cpG quindi questo controllo epigenetico passa sopra meccanismi molto complessi. Le isole cpG cosa sono? Abbiamo una serie di C e G legate tra loro mediante un legame fosfodiesterico che normalmente sono tra le 200 ma possono arrivare anche a 3000, e queste possono essere anche metilate. Se tali isole capitano al livello del promotore avranno un effetto sulla trascrizione del gene che segue. La metilazione che avviene al livello della citosina vicina alla guanina e questa metilazione avviene al livello del carbonio 5, quindi abbiamo la necessità di trasferire il gruppo CH3 e questo viene fatto grazie

all’attivazione di un enzima, la dimetil traferasi, che utilizzerà il gruppo metile presente sulla SAM, ovvero sadenosin metionina, questo gruppo metile viene trasferito dalla SAM al carbonio 5 della citosina e quindi avremo la metilazione. Adesso abbiamo parlato di un gruppo ma ci può essere più di un gruppo metile apposto in quella sequenza. Abbiamo detto che per il trasferimento del gruppo metile l’enzima coinvolto è la dimetiltransferasi anche se in realtà è una famiglia di enzimi che si dividono in dnmt1 coinvolta nel mantenimento della metilazione, quindi una cellula si divide grazie alla sua presenza si avrà il mantenimento e la metilazione cosi come nella cellula madre; oppure avremo una metilazione de novo, le quali sono quelle da noi più temute perché si avrà l’interazione con l’ambiente che può fare la differenza in quanto in alcuni casi si ha un aumento della metilazione proprio grazie alla presenza di tutta una serie di inquinanti dell’ambiente, e questo per esempio è legato alla presenza di due diverse dimetiltransferasi ovvero la dnmt3a e la dnmt3b nei mammiferi. Utilizzando però come modello sperimentale lo zebra fish, molto utilizzato negli studi di epigenetica, vediamo che il numero di isoforme è piu elevato. La 1 e la 2 sono le stesse, nel caso della 3 a dei mammiferi avevamo due equivalenti ovvero la 6 e la 8 mentre nel caso della 3b dei mammiferi abbiamo la 3-4-5-7. Le dnmt possono metilare anche l’RNA e questo viene effettuato dall’isoforma 2 sia nei pesci che nei mammiferi. Adesso vediamo cosa succede al livello degli istoni, dove possiamo avere sia processi di metilazione ma abbiamo anche la possibilità che il nostro istone venga acetilato e l’acetilazione fa l’azione contraria della metilazione in quanto stimola la trascrizione genica. Non solo, si ha anche la sumoilazione, la citrulizzazione, e la adp-ribosilazione oppure la fosforilazione. Quindi le modificazioni al livello degli istoni possono essere tante. Vediamo 4 istoni presenti e coinvolti nella formazione del nucleosoma e tutti questi processi avvengono su amminoacidi precisi, per esempio abbiamo parlato di metilazione e vediamo che questa avviene nell’arginina, nella lisina e quindi la posizione per esempio della lisina viene data dal numero che segue poi l’istone h3, e la lisina k9. La posizione è importante. Se noi andiamo a studiare la cromatina possiamo dire subito come prima cosa che può essere divisa in eucromatica ed eterocromatina. La differenza in cosa consiste? Nel caso dell’eucromatina è quella che viene normalmente trascritta, quindi l’organizzazione cambia a seconda che abbiamo un dna facilmente trascrivibile oppure no. Qui vediamo che la differenza tra le due è anche legata a un diverso processo di metilazione ed acetilazione. Se noi infatti andiamo a studiare in generale l’eterocromatina troveremo che al livello dell’istone H3, la lisina K9 è metilata e anche la K27 e, quando abbiamo un assetto di questo tipo il nostro dna non ha attività trascrizionale. Se vediamo invece a vedere i marcatori dell’eucromatina troveremo che l’istone H3K4 è metilato, al contrario l’istone H3K9 e K8 sono acetilati e in queste condizioni il dna sarà trascritto. Quindi abbiamo marcatori dell’ eu e dell’etero cromatina basata sulla differenza al livello degli istoni, esattamente l’aa in quella posizione che può essere metilato o acetilato. L’acetilazione di per se favorisce la trascrizione del dna la stessa cosa per la fosforilazione. L’acetilazione è sotto il controllo di un enzima che si chiama acetil trasferasi ed è responsabile dell’aggiunta di gruppi acetili, come sempre accade avremo anche un enzima che mi toglie il gruppo aggiunto quindi avremo la deacetilasi. Anche la fosforilazione ha un ruolo positivo al livello del nostro dna, qui sono coinvolti aa come tirosine serine e lisine e treonine e vediamo che c’è la chinasi che aggiunge il gruppo fosfato e la fosfatasi che lo rimuove. Anche la fosforilazione è un segnale positivo associato con la trascrizione del dna. La metilazione può avvenire mediante aggiunta di un singolo gruppo metile o mediante l’aggiunto di più gruppi metili 2 o 3 gruppi quindi il grado di metilazione può essere diverso. Le lisine possono essere metilate fino a 3 gruppi mentre le arginine possiamo avere due gruppi quindi possono essere mono o di metilate. Ci sono anche altre molecole che intervengono nel processo epigenetico: NON CODING RNA, noi troviamo all’interno del citoplasma delle nostre cellule degli rna che non codificano per le nostre proteine ma hanno un ruolo molto importante nel regolare la traduzione di rna messaggeri presenti all’interno delle nostre cellule. Si dividono in :

1) Mirna: sono generalmente tra i 18 e i 22 nt e fanno parte di questa famiglia e hanno un ruolo nel silenziare gli RNA quindi o inibiscono la traduzione o degradano direttamente gli rna messaggeri. Questi non daranno origine a proteine. 2) Small RNA da 20 a 300 nt, possono anche silenziare un gene 3) Medium and large RNA , tra i 300 e i 10.000 nt e sono precursori dei mirna e quindi anche questi interagiscono poi con la cromatina. Per quanto riguarda la modificazione al livello del DNA intervengono diversi fattori. Ci sono una serie di azioni che possono interferire sia con delle modificazioni al livello istonico i pitwi che intervengono nella metilazione del DNA, la metilazione del dna lo stesso è importante per l’azione di trascrizione. Diciamo in maniera semplicistica che focalizzandoci sulla metilazione, nel caso dell’eucromatina abbiamo una forma rilassata e quindi il nostro dna sarà trascritto mentre nel caso dell’eterocromatina abbiamo una forma compattata e dunque non potrà essere trascritta. Se noi non abbiamo il genoma sequenziato è difficile effettuare degli studi di epigenetica. Vediamo che la metilazione è stata fatta in tanti diversi tessuti e questo viene ad essere rappresentato dall’utilizzo di diversi colori. Vediamo come cambia la metilazione, la scala della metilazione è blu altamente metilato mentre giallo non è metilato. Abbiamo detto prima che durante lo sviluppo embrionale la metilazione varia, quindi abbiamo processi di metilazione e processi di de-metilazione. Nel genoma prenatale, le PGC sono demetilate quindi durante lo sviluppo dei gonociti avremo una metilazione de novo in maniera sesso-specifica per cui la metilazione del sesso maschile è diversa da quella femminile. Questo noi lo conosciamo già perché Noi sappiamo che al livello dell’embrione abbiamo un forte imprinting e nelle fasi iniziali noi abbiamo bisogno sia del genoma materno che di quello paterno perché non sono metilate allo stesso modo, quindi non trascrivono gli stessi geni. Esempio dei fattori di crescita IGF2, fattore di crescita fetale che viene trascritto in maniera diverssa come anche il suo recettore. Quindi in una certa fase di sviluppo embrionale il genoma paterno trascrive il recettore mentre il genoma materno il segnale, comunque uno trascrive segnale e uno recettore. Per cui se noi avessimo un dna proveniente da due femmine lo sviluppo embrionale non andrebbe avanti perché in questa fase si avrebbe tanto segnale ma alcun recettore. Quindi questi gonociti subiscono un de metilazione de novo che è sesso specifica. A seguito della fecondazione, quindi nelle prime fasi dello s. embrionale, ad esempio al livello della blastocisti noi avremo un processo di demetilazione verso la fine della segmentazione e poi con la gastrulazione di nuovo avremo un processo di metilazione di cui ne restano fuori la PCG. Quindi abbiamo una fase di determinazione sessuale che è molto importante perché abbiamo una determinazione sesso specifica e quindi una seconda metilazione durante l’embriogenesi. Noi non siamo solo ciò che abbiamo fatto noi, ma siamo anche ciò che hanno fatto le nostre mamme, nonne, bisnonne. Noi esprimiamo tutta una serie di geni che sono stati modulati tre generazioni prima. Quindi questo gene agouti, che porta una diversa colorazione del mantello, se espresso il mantello del topo è giallo, al contrario quando ne è inibita l’espressione il mantello è marrone. In madri che hanno assunto attraverso la dieta sostanze in grado di indurre una forte metilazione, il gene agouti non si esprime quindi la madre con una dieta di un certo tipo ha indotto la metilazione del dna del proprio figlio che non esprimerà quel gene e il topo nascerà con il mantello marrone. Questo noi possiamo andare indietro nel tempo, e se si tratta di una mutazione genetica stabile perché di stabili ne vediamo poche, noi possiamo osservare queste mutazioni anche nelle generazioni precedenti ovvero anche nella madre ad esempio chiamata f0 oppure analizzare il nostro f1 e vedere se la f2 e la f3 presentano ancora le mutazioni. Quest’ultimo è l’approccio che utilizziamo oggi per dire se una determinata sostanza ha un azione epigenetica transgenerazionale perché potrebbe essere anche un azione epigenetica che interessa solo quella generazione.

Vediamo insieme qual è l’effetto di additivi che vengono utilizzati nelle plastiche al livello epigenetico e transgenerazionale. Ci sono tanti plastificanti qui ne vediamo alcuni oltre anche ai plastificanti ci sono anche alchinfenoli che troviamo nei detergenti. Focalizziamo la nostra attenzione sul BPA quello prodotto in quantità maggiori e con un forte impatto ambientale. Diciamo subito che serve per rendere la plastica malleabile ma il problema di questi additivi è che non legano in maniera covalente queste sostanze le quali nel tempo le ritroviamo ovunque. E quindi la presenza di BPA è significativa nell’ambiente e altera il sistema endocrino quindi a partire diciamo dalla gonade, ma non è l’unica ghiandola alterata nella sua funzione da questa sostanza o anche un alterazione della tiroide alterandone il metabolismo e alterazione del metabolismo significa anche spesso alterazioni del s. circolatorio e quindi il fatto che questo possa passare attraverso processi epigenetici transgenerazionali ci spaventa molto. Vediamo intanto che succede nello zebra fish, dove abbiamo dosi ambientali e fino a 20 microgrammi litro li troviamo normalmente nell’ambiente. In questo primo studio ci siamo occupati di cosa succede nell’ovario. L’ame di questo studio era se l’esposizione di queste dosi ambientali potesse interferire con il processo di ovogenesi e soprattutto siamo andati a vedere se al livello dell’ovario insorgessero problemi di morte cellulare programmata. Se questo era presente abbiamo anche indagato se poteva passare attraverso un processo epigenetico. Quando andiamo ad esporre la femmina cosa succede al livello dell’asse? Abbiamo le diverse dosi con il numero di uova che vengono ovulate dopo un esposizione cronica ovvero di almeno 3 settimane e si vede che la dose peggiore alla riproduzione è quella più bassa (5). L’effetto paradosso o effetto non monotomico cioè non abbiamo un effetto dose risposta, ma vanno testate dosi diverse per capire cosa fa ogni singola dose. E questo l’industria chimica lo sa benissimo perché quando si testano i prodotti che vengono utilizzati all’interno di queste aziende che producono plastiche ci chiedono di dosare livelli alti perché sotto certi aspetti sappiamo che mimano gli estrogeni questi plastificanti per cui uno dei target è la fisiologia riproduttiva se viene o meno alterata. Gli studi di psicologia prevedono invece 5 dosi diverse fatte in maniera scalare per capire chi fa che cosa. Se andiamo a vedere l’ovario lo fissiamo, lo sezioniamo vediamo che si ha un alterazione dei trattati rappresentati dalle barre scure, della frequenza di grandezza degli ovociti ma soprattutto il numero di follicoli atresici ovvero in apoptosi e si vede come è più alta la % di atresia nei pesci esposti a 5 microgrammi di PBA e sono quei pesci che non ovulano più. L’aumento di atresia è impressionante ed è supportato anche da studi diversi, non solo di osservazione, ma utilizzando il metodo tunnel si può mettere in evidenza la presenza di apoptosi che viene vista in maniera molto spiccata al livello delle cellule della granulosa. Questo dato di morte cellulare è assolutamente in accordo con l’espressione di alcuni geni coinvolti nell’induzione della morte cellulare, come il gene della caspase 3, enzima coinvolto nel processo apoptotico, caspase effettrice e un aumento di espressione di questo gene ci permette di ipotizzare che la caspase va ad attivare la endonucleasi. Quindi abbiamo un puzzle di geni che ci dicono che al livello dell’ovario il processo apoptotico è significativamente aumentato ed è più evidente nei trattati con 5 microgrammi. Invece altra tipologia di morte cellulare è l’atrofagia che nell’ovario è in alternativa all’apoptosi, serve a migliorare le perfomance, i marker autofagici non cambiano in quanto sono gialli per cui i livelli restano quelli. Adesso ci allarghiamo nell’orizzonte dei segnali coinvolti nella riproduzione e vediamo che ci sono tutta una serie di segnali che sono coinvolti in diverse fasi come: -

Sviluppo del follicolo Accrescimento del follicolo: Per la crescita dell’ovocita sono stati presi in esame i recettori degli estrogeni e diminuiscono con i 5 microgrammi.

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Maturazione del follicolo: legato alla presenza del recettore del Lh e del recettore del progesterone

La domanda è: tutti questi cambiamenti che vediamo, avvengono perché si ha un controllo epigenetico o perché ci sono altri processi che portano a queste variazioni? Qui si ha una copertina del times che

dice perché il tuo dna non è il tuo destino perché la funzionalità del dna dipende anche dall’interazione dell’organismo con l’ambiente. Come prima cosa dobbiamo vedere se la trascrizione dei geni che codificano per la metilazione del dna è diversa quando abbiamo l’esposizione a BPA. Abbiamo ancora come nostro target i 5 microgrammi perché è quello che ha subito di più da un punto di vista fisiologico. DMNT1 è il mantenimento del dna mentre dnmt3 è de novo. Sia l’1 che il 3 aumentano in presenza di BPA e questa differenza è statisticamente significativa e possiamo avere o l’asterisco o lettere diverse ovvero la differenza tra controllo e trattato e significativa se avessimo invece avuto aa avevamo dei piccoli cambiamenti ma non statisticamente significativi. Il fatto che ci sia un aumento di enzimi responsabili della metilazione ci porta ad ipotizzare che ci sia una metilazione al livello della citosina. Cosa succede al livello degli istoni? Qui vediamo dati relativi ai geni visti prima, questo sta a testimoniare il fatto che per fare lo studio epigenetico si deve avere un modello di cui s conosce il genoma perché dobbiamo identificare le transcripition site e in questo caso ne sono state identificate 5 nei diversi geni: star, recettore fsh, lh, sono stati studiati precipitando l’istone h3k4 metilato con un anticorpo specifico, o precipitando un istone h3k27 metilato. Quindi si ha una precipitazione con un anticorpo specifico di questi geni. Noi sappiamo che h3k4 è un promotore, mentre h3k27 è un inibitore di trascrizione e vediamo che succede nei diversi geni. Per quanto riguarda star ed fsh receptor diciamo che non abbiamo avuto grandi differenze, quello che ci ha incuriosito di più è l’lh receptor perchè da una parte si ha una riduzione della k4 m3 associata ad un aumento di metilazione dell’inibitore in alcuni siti e questo ci ha portato ad ipotizzare che il gene che codifica per il recettore dell’fsh sia meno espresso ed è esattamente quello che diciamo poi abbiamo pubblicato. Se non abbiamo espressione del recettore dell’lh abbiamo problemi nell’ovulazione. Dopo questo primo studio ci siamo chiesti se il...