Alkohol-Dehydrogenase-Reaktion: Enzymatisch-optischer Test- Sommersemester 21/22 PDF

Preview

Summary

Protokoll für die Experiment "ADH" -Proteinchemisches Grundpraktikum...

Description

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung..........................................................................................................2 2. Durchführung................................................................................................3-5 2.1. Aufnahme von Absorptionsspektren von NAD+ und NADH.....................................3 2.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration..............3-4 2.3. Bestimmung der Gleichgewichtkonstanten für die ADH-Reaktion.........................4 2.4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber...................5 verschiedenen Alkoholen

3. Ergebnis.......................................................................................................6-12 3.1. Aufnahme von Absorptionsspektren von NAD+ und NADH.................................6-7 3.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration..............8-9 3.2.1. Bestimmung der Ethanol-Konzentration...............................................8-9 3.2.2. Bestimmung der NAD+-Konzentration......................................................9 3.3. Bestimmung der Gleichgewichtkonstanten für die ADH-Reaktion..................10-11 3.4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber.................12 verschiedenen Alkoholen

4.Diskussion...................................................................................................13-16 4.1. Aufnahme von Absorptionsspektren von NAD+ und NADH.............................13-14 4.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration...............15 4.3. Bestimmung der Gleichgewichtkonstanten für die ADH-Reaktion.......................16 4.4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber.................16 verschiedenen Alkoholen

5. Literatur..........................................................................................................17

1

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

1. Einleitung Bestimmte Enzyme katalysieren bestimmte spezifische Reaktionen und setzen dadurch nur bestimmte Substrate um. Diese Eigenschaft der Enzyme kann man verwenden, indem man in einem Stoffgemisch selektiv eine Substanz umsetzt und durch eine enzymatische Analyse eine quantitative Bestimmung macht. Um zu verfolgen, wie die enzymatische Reaktion verläuft, kann man optische Methoden, bei diesem Fall spektralphotometrische Methoden, verwenden. Was für diese Methode entscheidend ist, dass Substrat und Produkt sich in ihren spektralen Eigenschaften unterscheiden, damit die Reaktion photometrisch verfolgt werden kann. Meistens wird dafür das Coenzym NAD + bzw. NADH betrachtet, die als Redoxüberträger in vielen Reaktionen fungiert. Dieses Molekül hat seine Absoprtionsmaxima bei 264 nm und 339 nm. Dagegen absorbiert NAD + bei 264 nm, welche die Unterscheidung ermöglicht und dadurch photometrische Bestimmung ermöglicht. Bei diesem Versuch erzielt man, der enzymatische optische Test für die Reaktion durchzuführen, die von dem Enzym Alkoholdehydrogenase katalysiert wird: H3C-CH2OH + NAD+  H3C-CHO + NADH + H+ Um den Versuch die Endwertmethode anwenden zu können, wird die enzymkatalysierte Reaktion mit einer nicht-enzymatischen Reaktion katalysiert. Dabei wird das in der enzymkatalysierten Reaktion entstandene Ethanal gelassen, mit Semicarbazid zu Ethanalsemicarbazon reagieren. Dadurch wird das Ethanal von dem Gleichgewicht entzogen, welche zur vollständigen Umsetzung des Substrates verursacht. Die Alkoholdehydrogenase setzt nur kurzkettige primäre und sekundäre Alkohole um. Am besten wird die Reaktion katalysiert, bei der der primäre Alkohol Ethanol zu Ethanal katalysiert wird. Diese Spezifität des ADH gegenüber dem Substrat und entsprechende Cosubstrat erklärt man mit dem Phänomen “Prochiralität”. Im ersten Versuchsteil wird die Messung von Absorptionsspektren der Cosubstrate durchgeführt. Diese gemessenen Spektren sollen dazu dienen, um die molare Extinktionskoeffizient zu bestimmen. Schließlich sollen die Konzentration einer unbekannten NAD+ und einer Ethanol Lösung durch vielen Messungen bestimmt werden. Diese Berechnung kann durch die Messung der Konzentration des entstandenen NADH in der Probe erfolgen. In dem nächsten Versuchsteil ist das Ziel, die Gleichgewichtskonstante von Alkoholdehydrogenase zu bestimmen. Dazu bestimmt man bei unterschiedlichen Konzentrationen und pH-Werten die jeweilige Gleichgewichtskonzentration der Reaktanten, indem man ständig photometrische Messungen durchführt. Und in dem letzten Teil berechnet man hauptsächlich die spezifische Aktivität von Alkoholdehydrogenase gegenüber den primären Alkoholen Methanol, Ethanol, n-Propanol und n-Butanol. Das findet dadurch statt, indem man die Absorptionsänderung mit der Zeit notiert.

2

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

2. Durchführung 2.1. Aufnahme von Absorptionsspektren von NAD+ und NADH 1,95 ml von 50 mM Natriumdiphosphatpuffer mit Semicarbazid (pH=8,8) und 0,05 ml des absoluten Ethanols wurden in eine 1 cm Quarzküvette pipettiert und ein Referenzspektrum von 360 bis 240 nm wurde aufgenommen. Dann wurde die Küvette geleert und 1,9 ml von 50 mM Natriumdiphosphatpuffer mit Semicarbazid (pH=8,8), 0,05 ml von 5 mM NAD + und 0,05 ml des absoluten Ethanols wurden in die Küvette pipettiert und die Absorptionsspektrum wurde gemessen. Danach wurde 5 µl Hefe-ADH-Lösung in die Küvette pipettiert und für 15 Minuten gewartet. Am Ende der Wartezeit wurde die Absorptionsspektrum von NADH zwischen 320 und 240 nm gemessen. 2.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration Für die Ethanol-Bestimmung wurde der ein Ansatz mit Überschuss an Cosubstrat NAD + (5mM) in die Küvette pipettiert und für 90 Minuten inkubiert. Bei der NAD +-Bestimmung wird dieser Ansatz im Überschuss von absolutem Ethanol vorbereitet. Gleichzeitig wurden weitere Ansätze mit bekannter Substrat- bzw. Cosubstrat-Konzentrationen als Kontrolle hergestellt. Die Ansätze wurden in Küvetten vorbereitet und nach Zugabe der Hefe-ADH für 15 Minuten inkubiert. Nach der Wartezeit wurden die Extinktionswerten einzelner Ansätze gemessen. Die Pipettierschema für die Ansätze wurde in den folgenden Tabellen dargestellt :

Tabelle 1: Pipettierschema für die Bestimmung der Ethanol-Konzentration (Volumenangaben in ml) Pipettierschema I

Referenz

Küvetten Nr. 1 50 mM Na-Diphosphatpuffer 1,85 pH= 8,8 mit Semicarbazid 5 mM NAD+-Lösung 0,25

Kalibrierungswerte (6,25 mM Ethanol) 2,3 4,5 1,85 1,85

Unbekannte Ethanol-Lösung 6,7 8,9 1,85 1,85

0,25

0,25

0,25

0,25

6,25 mM Ethanol-Lösung

0,05

0,05

0,025

-

-

unbekannte Ethanol-Lösung destilliertes Wasser Hefe-ADH (500 U/ml) Verdünnungsfaktor

0,35 -

0,30 0,05 1:50

0,325 0,05 1:100

0,05 0,30 0,05 1:50

0,025 0,325 0,05 1:100

3

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

Tabelle 2: Pipettierschema für die Bestimmung der NAD + -Konzentration (Volumenangaben in ml) Pipettierschema II

Referenz

Küvetten Nr. 1 50 mM Na-Diphosphatpuffer 1,85 pH= 8,8 mit Semicarbazid 5 mM NAD+-Lösung 0,05

Kalibrierungswerte (5 mM NAD+) 2,3 4,5 1,85 1,85

Unbekannte NAD+-Lösung 6,7 8,9 1,85 1,85

0,05

0,025

-

-

unbekannte NAD+-Lösung

-

-

-

0,05

0,025

absolutes Ethanol destilliertes Wasser Hefe-ADH (500 U/ml) Verdünnungsfaktor

0,05 0,55 -

0,05 0,50 0,05 1:50

0,05 0,525 0,05 1:100

0,05 0,50 0,05 1:50

0,05 0,525 0,05 1:100

2.3. Bestimmung der Gleichgewichtkonstanten für die ADH-Reaktion In diesem Versuchsteil war das Ziel, die Gleichgewichtskonstante der ADH-Reaktion zu bestimmen. Dafür wurden die für die Reaktion benötigte Komponenten in die Küvetten pipettiert, wo 9 Ansätze mit unterschiedlichen NAD +-Anfangskonzentrationen vorbereitet wurden. Die Ansätze wurden für 15 Minuten inkubiert und mit Spektralphotometer wurde die Extinktionswerte der Ansätze bei 339 nm gemessen, wo die Referenzprobe fürs Nullabgleich verwendet wurde. Die Pipettierschema für die Ansätze wurde in der folgenden Tabelle dargestellt: Tabelle 3: Pipettierschema (Volumenangaben in ml) Küvetten Nr.

für

die

Bestimmung

1 (Referenz) -

2,3

4,5

-

2,25

2,30

2,25

5 mM NAD+-Lösung

0,10

6,25 mM Ethanol-Lösung

der

Gleichgewichtskonstante

6,7

8,9

-

2,15

2,15

0,10

0,10

0,10

0,20

0,10

0,10

0,10

0,20

0,10

ADH-Lösung (500 U/ml)

-

0,05

0,05

0,05

0,05

Verdünnungsfaktor

1:25

1:25

1:25

1:25

1:12,5

50 mM Na-Diphosphatpuffer pH= 9,8 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH= 8,8

4

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

2.4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen 10 µl der ADH-Stammlösung (500 U/µl) und 90 µl der bidestillierten H 2O wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert, wodurch 1:10 Verdünnung der ADH (50 U/µl) hergestellt wurde. In vier Küvetten wurden jeweils 1,85 ml 50 mM Na-Diphosphatpuffer pH 8,8 (ohne Semicarbazid), 0,1 ml von 5 mM NAD +-Lösung und 0,5 ml destilliertes Wasser pipettiert und gemischt. In den Küvetten wurde dann 0,05 ml von einer der folgenden absoluten Alkohole pipettiert: Ethanol, Methanol, n-Propanol, n-Butanol. Durch Zugabe von 5 µl der 1:10 verdünnten ADH-Lösung startete die Reaktion und die Referenzextinktion bei 339 nm zu dem Zeitpunkt t=0 wurde gemessen. Nach 2 Minuten wurden die Extinktionswerte bei 339 nm durch Spektralphotometrie gemessen. Die Messungen der Ansätze erfolgten nicht gleichzeitig, sondern hintereinander.

5

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

3. Ergebnis 3.1. Aufnahme von Absorptionsspektren von NAD+ und NADH

Abbildung 1: Die Absorptionsspektrum der NAD+ vor der Alkoholdehydrogenase-Reaktion

Abbildung 2: Die Absorptionsspektrum der NAD und NADH nach der Alkoholdehydrogenase-Reaktion

6

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

Molare Extinktionskoeffizienten der NAD+und NADH: Die Berechnung der molaren Extinktionskoeffizient erfolgte durch das Lambert Beer’sche Gesetz. Dieses Gesetz sagt aus: E: Extinktionswert ε : molarer Extinktionskoeffizient [L x mol-1 x cm-1] c: Stoffkonzentration [mol/L] d: Schichtdicke [cm]

E=ε ∙ c ∙ d

Nach Umformung der Gleichung nach berechnet werden:

ε konnte die molarer Extinktionskoeffizient

Für NAD+ bei 260 nm: n NAD, Küvette =c NAD, Stammlösung ∙ V NAD , Küvette =5 ∙ 10−3 mol / l∙ 0,05 ∙10−3 l ¿ 2,5 ∙10−7 mol c NAD , Küvette =n NAD, Küvette /V Küvette ,Gesamt =

ε NAD, 260nm=

E = c ∙d

2,5 ∙10−7 mol =1,25 ∙10−4 mol / l −3 2,0 ∙10 l

1,814 =¿ mol 1,25 ∙10−4 ∙ 1 cm l

14,5 x 103 L mol-1 cm-1

Für NADH bei 260 nm: In Anwesenheit der Semicarbazid findet die vollständige Umsetzung von NAD + in NADH statt, da die Rückreaktion durch ständigen Entzug von Ethanal verhindert wurde. Dabei konnte angenommen werden: n NAD, Küvette =n NADH , Küvette

c NADH , , Küvette =n NADH , Küvette/V Küvette ,Gesamt =

ε NADH ,260 nm=

E = c∙d

2,5 ∙ 10−7 mol =1,246 ∙ 10−4 mol / l −3 2,005 ∙ 10 l

1,570 3 −1 −1 =12,6 ∙10 L mol cm mol −4 1,246 ∙ 10 ∙1 cm l

3.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration 7

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

Die Bestimmung der Ethanol- bzw. NAD+-Konzentration erfolgte mithilfe Bestimmung der Extinktionswerte der Ethanol-/NAD+-Lösungen mit bekannten Konzentrationen und durch Vergleich der erhaltenen Werte: Die bekannten Konzentrationen ließen sich mit folgender Formel berechnen: c bekannt =

c Stammlösung Verdünnungsfaktor

Für die Konzentrationberechnung durch Spektralphotometrie wurde das Lambert Beer’sche Gesetz angewendet. (Siehe : S.7) Dabei beträgt die molare Extinktionskoeffizient von NADH bei 339 nm = 6,2 x 103 L mol-1 cm-1 Für die Ethanol bzw. NAD +-Lösungen unbekannter Konzentration wurde das Verhältnis zwischen die bekannte und photometrisch gemessene Konzentration berücksichtigt. Daraus folgte: cbekannt c spektral ,bekannt

=

c unbekannt c spektral ,unbekannt

3.2.1. Bestimmung der Ethanol-Konzentration Tabelle 4: Die Extinktionswerte und Konzentrationen der Ethanol-Lösungen mit vorher bekannten bzw. unbekannten Konzentrationen Ethanol-Bestimmung Küvette 2 Küvette 3 Küvette 4 Küvette 5 Küvette 6 Küvette 7 Küvette 8 Küvette 9

cbekannt bzw. Extinktion Mittelwert cunbekannt [M] ∆E ∆E

6,25 mM Lösung 1:50

1,25 x 10-4

6,25 mM Lösung 1:100

6,25 x 10-5

unbekannte Lösung 1:50

2,65 x 10-4

unbekannte Lösung 1:100

6,77 x 10-5

cspektral [M]

cProbe [M]

0,270

4,35 x 10-5

-

0,215

3,47 x 10-5

-

0,572

9,23 x 10-5

13,25 x 10-3

0,233

3,76 x 10-5

6,77 x 10-3

0,395 0,144 0,275 0,154 0,465 0,678 0,201 0,265

Für die endgültige Konzentration der Probe wurde der Mittelwert aus beider cprobe bestimmt: 8

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur c Ethanol , ϕ=

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

[ ]

13,25 ∙10−3+6,77 ∙10−3 mol −3 =10,01 ∙ 10 M l 2

3.2.2. Bestimmung der NAD+-Konzentration Tabelle 5: Die Extinktionswerte und Konzentrationen der NAD+-Lösungen mit vorher bekannten bzw. unbekannten Konzentrationen NAD+-Bestimmung Küvette 2 Küvette 3 Küvette 4 Küvette 5 Küvette 6 Küvette 7 Küvette 8 Küvette 9

cbekannt bzw. Extinktion Mittelwert cunbekannt [M] ∆E ∆E

5 mM Lösung 1:50

1 x 10

5 mM Lösung 1:100

5 x 10-5

unbekannte Lösung 1:50

1,53 x 10-4

cspektral [M]

cProbe [M]

0,700

1,13 x 10-4

-

0,345

5,56 x 10-5

-

1,073

1,73 x 10-4

7,65 x 10-3

0,626

1,01 x 10-4

9,08 x 10-3

0,676 -4

0,724 0,289 0,400 1,033

unbekannte Lösung 0,908 x 10-4 1:100

1,112 0,633 0,619

Für die endgültige Konzentration der Probe wurde der Mittelwert aus beider cprobe bestimmt: c NAD ,ϕ=

[ ]

7,65 ∙10−3+ 9,08 ∙ 10−3 mol −3 = 8,365 ∙ 10 M l 2

3.3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für die ADH-Reaktion

9

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

Anhand der eingesetzten Ethanol- und NAD+-Konzentrationen und photometrisch gemessenen NADH-Konzentrationen werden die Stoffkonzentrationen in der Gleichgewichtslage bestimmt. Dafür wurden die jeweiligen Berechnungen unter Verwendung der folgenden Formeln durchgeführt: Konzentration der NADH wurde unter Verwendung des Lambert Beer’schen Gesetz berechnet. (Siehe S.7) Da pro mol NADH auch 1 mol Ethanal gebildet wird, ist die EthanalKonzentration gleich zur NADH-Konzentration im Reaktionsansatz. Für die Konzentration der NAD+ in Gleichgewichtslage wurde zuerst die eingesetzte Konzentration und Menge an NAD+ bestimmt: +¿ ¿ NAD ¿ +¿ NAD¿ ¿ ¿GGW ¿ +¿ ¿ NAD ¿ +¿ ¿ NAD ¿ n¿ n¿ ¿ ¿ ¿ n ( NADH )GGW =c ( NADH )GGW ∙ V Gesamt +¿ ¿ NAD ¿ +¿ ¿ NAD ¿ +¿ ¿ NAD ¿ V¿ c¿ n¿ ¿ Da pro mol NADH 1 mol Ethanol in Ethanal umgewandelt wurde, konnte die EthanolKonzentration in der Gleichgewichtslage wie im Folgenden berechnet werden:

10

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

[Ethanol ]GGW =

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116 n ( Ethanol) GGW V Gesamt

n ( Ethanol ) GGW =n( Ethanol )eingesetzt −n ( NADH )GGW n ( Ethanol ) eingesetzt =c( Ethanol ) Stammlösung ∙ V ( Ethanol ) eingesetzt Da die Reaktion in Pufferbedingungen durchgeführt wurde, blieb die H +-Konzentration während der gesamten Reaktion konstant. Die H+-Konzentration wurde anhand der gegebenen pH-Werte der Puffer berechnet:

[H+] = 10-pH Die Berechnung der Gleichgewichtskonstante erfolgte mit dem auch im Skript gegebenen Formel : +¿ ¿ H ¿ +¿ ¿ NAD ¿ ¿ ¿ [ NADH ]GGW ∙[ Ethanal]GGW ∙¿ K =¿ Anhand der Messungen und durchgeführten Berechnungen wurde die folgende Tabelle erstellt.

Küvette

Tabelle 6: Die gemessene Extinktionswerte, daraus berechnete Konzentrationen und Gleichgewichtskonstanten für die ADH-Reaktion Eingesetzte Konzentration [M] [NAD+] 2

Extinktion ∆E

2 x 10-4

[Ethanol ] 2,5 x 10-4

-4

-4

2 x 10

2,5 x 10

-4

2 x 10

-4

5 x 10

0,132

9

11

[NADH] [Ethanal] 1,645 x 10-5

-4

4 x 10

-4

2,5 x 10

0,139 0,137

[NAD+]

[Ethanol]

[H+]

GGWKonst. K [M]

1,836 x 10-4

2,335 x 10-4

1,585 x 10-9

9,973 x 10-12

0,173

2,79 x 10-5

1,721 x 10-4

2,221 x 10-4

1,585 x 10-10

3,228 x 10-12

0,132

2,129 x 10-5

1,787 x 10-4

2,287 x 10-4

1,585 x 10-9

1,752 x 10-11

0,138

2,226 x 10-5

3,777 x 10-4

4,777 x 10-4

1,585 x 10-9

4,339 x 10-12

0,132

7 8

0,172

Berechnete Gleichgewichtskonzentrationen [M]

0,174

5 6

0,102

0,110

3 4

0,094

Ø(∆E)

Selcan Ciftsüren Emirhan Yagmur

Proteinchemisches Grundpraktikum 25.05.2021 SS 21 Praktikumsnummer 115/116

Aus den berechneten einzelnen Konzentrationen wurde der Mittelwert für die Gleichgewichtskonstante berechnet. Da die 3. Wert für Gleichgewichtskonstante sehr stark von anderen Werten abweicht, wurde es bei der Berechnung vernachlässigt.

∅K=

K 1+ K 2+ K 4 (9,973 + 3,228 + 4,339 )∙ 10−12 [ M ]=5,84 ∙10−12 M = 3 3

3.4....