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TECNICHE ISTOLOGICHE Sezione istologica colorata con EMATOSSILINA-EOSINA: • molecole ricche in gruppi acidi reagiscono con il colorante basico ematossilina: tali molecole si dicono basofile • molecole ricche in gruppi basici reagiscono con il colorante acido eosina tali molecole si dicono acidofile L’affinità per l’ematossilina o per l’eosina poco dice circa la natura chimica dei substrati cellulari affini l’uno o all’altro colorante, per cui si rendono spesso necessarie altre colorazioni: ALTRE COLORAZIONI: • istochimica • enzimoistochimica (non effettuato normalmente: si ricercano enzimi specifici) • immunoistochimica (enzima viene utilizzato per far avvenire una certa reazione) • ibridazione in situ (metodica complessa, utilizzo di sonde che possono essere marcate sia con sostanze cromogeniche come nel caso dell’immunoistochimica (ha il vantaggio di essere visibile al microscopio ottico, oppure utilizzare una sostanza fluorescente→ utilizzare microscopio a fluorescenza; o con sostanze a base di sali di argento; eseguibile anche una PCR ma procedura poco usata in anatomia patologica: solo per studio del linfonodo sentinella (RT-PCR)→ si ricerca la presenza di metastasi, metodo OSNA) • polymerase chain reaction

ISTOCHIMICA Insieme di metodiche atte ad identificare, localizzare e quantificare, mediante reazioni chimiche o fisiche delle specifiche sostanze, gruppi reattivi e prodotti di reazioni enzimatiche. Tutte le procedure istochimiche si basano sul fatto di ottenere, dalla reazione tra i costituenti tissutali ed un opportuno reagente, dei prodotti colorati ed insolubili, la cui quantità e localizzazione può essere valutata nel contesto delle cellule e dei tessuti. → colorante si incontra direttamente con la sostanza che si sta cercando e il contatto ne determina la colorazione. Questi prodotti colorati devono essere insolubili per evitare che venga persa la colorazione durante i passaggi successivi (passaggio in alcol, xilolo o balsamo). Le sostanze presenti nelle cellule e nei tessuti che possono essere svelate con metodiche istochimiche sono riconducibili a 5 gruppi: • acidi nucleici • proteine e peptidi • glucidi e mucopolisaccaridi • lipidi (sarebbe meglio cercarli in sezioni effettuate al criostato per evitare la loro perdita) • ioni inorganici (Ca, melanina, rame ecc..) PROTEINE • fibre collagene - Van Gieson - Tricromica di Masson - Tricromica di Mallory • fibre reticolari - Impregnazione argentica secondo Gomori • fibre elastiche (in presenza ad esempio di un elastofibroma: neoplasia che presenta fibre elastiche) - Metodo dell’Orceina - Metodo di Weigert

Colorazioni per le fibre collagene Rappresentano i costituenti fondamentali del connettivo. Il collagene è la principale proteina del tessuto connettivo. Sono costituite da filamenti di spessore variabile tra 1 e 100 micron. Questi filamenti sono a loro volta costituiti da strutture fibrillai più piccole (tropocollagene). Il tropocollagene è a sua volta costituito da molecole filamentose che formano una triplice eliche: ciascuna di queste molecole è formata da lunghe catene polipeptidiche (glicina, prolina, idrossiprolina). Con le colorazioni viene sfruttata una differente capacità di penetrazione dei diversi coloranti. Le colorazioni che meglio evidenziano le f. collagene sono dette tricromiche: • colorante per i nuclei: in genere si usa una ematossilina ferrica (Weigert) che meglio resiste all’ambiente acido dove agiscono gli altri 2 coloranti. Le ematossiline vengono classificate in base al sale cui reagiscono, quelle più utilizzate sono le alluminiche che però non possono essere utilizzate perché non resistono agli ambienti acidi nucleari, mentre questa ferrica resiste maggiormente a coloranti acidi. • 2 coloranti acidi differenti dal punto di vista fisico-chimico: - finemente dispersi (acido picrico, orange G): penetrano nelle più fini strutture tissutali, in profondità dentro le strutture molecolari del tropocollagene - grossolonamente dispersi (fucsina): penetrano lentamente solo nelle strutture più grosse • viene quindi sfruttata la differente velocità di penetrazione dei 2 coloranti acidi: - praticamente la colorazione viene interrotta quando si presume che le strutture più fini siano state raggiunte dal colorante a fin dispersione e non ancora da quello grossolano (controllo microscopico o rigoroso rispetto dei tempi). Tricromica di Masson (secondo Goldner): • metodo di elezione per evidenziare nuclei, gameti, neurofibrille, nervoglia, colagene, cheratine ecc.. • colorazione nucleare: ematossilina ferrica (di Weigert)→ blu più scuro rispetto a quella argentica I nuclei vanno sempre colorati, anche nell’IIC i nuclei vanno sempre colorati con un contro-colorante nucleare per dare una collocazione spaziale delle diverse cellule (di Weigert) • miscela a base di fucsina acida: colora il citoplasma • verde luce (colorante a fine dispersione): fibre connettivali • acido picrico: emazie • acido fosfomolibdico (prima del verde luce): agisce come mordente prima delle f. collagene SEQUENZA: ematossilina ferrica→ acido picrico→ miscela di fucsina→ mordente→ verde luce è considerabile quasi una quadricromica per l’aggiunta dell’acido picrico. Risultato: • nuclei/gameti: blu/blu scuro • citoplasmi, cheratina, f. muscolari (per non confonderle con le f. collagene): rosso • collagene, muco: verde (il muco si colora in tanti modi, la colorazione delle mucine non è per tanto una marcatura specifica ma una diffusione aspecifica del colorante. • emazie: gialle Tricromica di Massono (blu di anilina): è identica alla precedente. Si differenzia solo per : verde luce→ blu di anilina Risultato: Fibre collagene blu

Esame!! sapere principio non nello specifico i vari coloranti!!

Tricromica di Van Gieson: È indicata per evidenziare le f. collagene differenziandole dal connettivo. • Colorazione nucleare: ematossilina ferrica (di Weigert) • colorazione citoplasmatica: acido picrico • colorazione fibre collagene: fucsina acida • non è necessario aggiungere acido fosfomolibdico perché il mordente già c’è (acido picrico) Risultato: • nuclei: blu scuri • fibre collagene: rosso porpora • citoplasma, muscolo liscio e striato, strato corneo epitelio, eritrociti, nevroglia: giallo Attenzione: la colorazione tende a sbiadire nel tempo, in realtà questa osservazione potrebbe essere ridimensionata se il preparato viene correntemente montato (senza bolle d’aria) in un ambiente chiuso ed al buio. Preparati Fish: mantenuti a 4°C e al buio.

Colorazione per le fibre reticolari Sono difficilmente differenziabili sul piano morfologico alle fibre collagene. Sono ricche di glicoproteine (PAS+), ma molto aspecifico. Possono legarsi ai sali di argento a non di ridurli (argiro o argentofilia). Argentaffinità: capacità di legare l’argento e di ridurlo ad argento metallico. Nelle colorazione per le f. reticolari questo viene ottenuto artificialmente. 1. Ossidazione preliminare con permanganato di K 2. Pre-trattamento delle sezioni con Fe trivalente (ferro ammonio solfato) Gli ioni ferrici, più reattivi degli ioni Ag, si legano in modo rapido e selettivo alle strutture argirofile. 3. Trattamento con soluzione ammoniacale contenente Ag in forma di un complesso idrosolubile: catione diamminoargentico: si sostituisce al Fe già legatosi 4. Aldeide formica: sottrae O e libera argento metallico che resta depositato nella struttura argirofila 5. Il catione D.A. che non ha reagito viene asportato con sodio trisolfato: si forma un complesso Ag2S2O3 (triosolfato di argento) molto solubile ma non più ossidabile (fase detta di fissaggio) serie di reazione che fanno si che Ag metallico possa precipitare nella struttura argilofila e si renda otticamente visibile: le strutture per tanto appaiono nere. Nelle metodiche di impregnazione argentica: • vetreria perfettamente pulita • usare acqua distillata o deionizzata e priva di cloro • evitare depositi di polvere sulle sezioni • non porre oggetti metallici a contatto con le soluzioni (pinze, ecc..) in quanto l’argento viene ridotto dai metalli Queste accortezze permettono di avere un vetrino ben osservabile e impediscono la possibilità di avere falsi positivi. Risultato: Fibre reticolari e nervose: nere Colorazione per le fibre elastiche Possono assumere coloranti (anche il PAS in quanto l’elastina ha una componente glucidica). Le colorazioni più efficaci sono quelle a base di orceina e fucsina-resercina (legami elettropolari con l’elastina). Ma non c’è una spiegazione esatta sul meccanismo di funzionamento).

Colorazione di Weigert: • viene sfruttata l’affinità per le f. elastiche del precipitato (creofucsina) che si ottiene facendo reagire resorcina + fucsina basica + cristalvioletto con Fe perclorico. • Specificità del metodo non assoluta: si possono colorare anche altre strutture come f. collagene e o membrana basali • fibre elastiche appaiono colorate in nero • successivamente si può applicare una qualsiasi altra colorazione (EE, Van Gieson) per colorare le rimanenti strutture tissutali, l’importante è che il composto di base (creofucsina) sia presente per colorare le fibre elastiche • le componenti elastiche sono numerose nelle arterie elastiche, utile per evidenziare sindrome di Marfan (patologia del collagene, le fibre elastiche sono assemblate in maniera anomala). Questi soggetti sono più sensibili alla formazione di aneurismi o ateroscleroci (la lamina interna dell’arteria appare frammentata). Glucidi Più importante della colorazione delle f. collagene ed elastiche. Possiamo avere: • Omopolisaccaridi → es. glicogeno → gruppi alcolici ossidabili ad aldeidi→ reazione PAS che evidenzia i gruppi aldeidici, amilasi sensibili. Il principale è il glicogeno: localizzazione citoplasmatica, serbatoio energetico, si trova in fegato, cuore e muscolo scheletrico. Viene studiato infatti nella patologia epatica dove si può accumulare in epatiti alcoliche e cirrosi. • Eterossidi = formati dall’unione di -osi e derivati di esosamine, abbinati ad una componente proteica - Glicoproteine→ componente proteica è dominante rispetto a quella glucidica che comprende -osi, esosamine e acido sialico→ glicoproteine della parte amorfa dei connettivi, delle membrane basali, del secreto delle ghiandole a secrezione muscosa, tireoglobulina, TSH, FSH, LH, eritropoietina→ gruppi alcolici ossidabili ad aldeidi→ reazione PAS che evidenzia i gruppi aldeidici, amilasi resistenti. La diastasi aggiunta alla pas identifica la differenza tra glicogeno e proteine (se la colorazione si mantiene con la diastasi siamo difronte a mucine). - Proteoglicani acidi→ la componente glucidica è dominante rispetto a quella proteica. Oltre ad esosi es esosamine contengono acidi uronici, esteri fosforici e gruppi solfato che conferiscono carattere acido→ acido ialuronico, condroitinsolfato, eparansolfato, eparina→ per la ricchezza in radicali acidi reagiscono con coloranti basici (basofilia)→ Alcian blu, Metacromasia rossa con blu di toluidina e azzurro A, non sono PAS positivi. Glicogeno Mucine: mucopolisaccaridi, mucosostanze, glicoconiugati. È un polisaccaride semplice composto da una serie di unità di D-glucosio. Si può trovare in tre isoforme alfa, beta e gamma. Ha n genere una localizzazione citoplasmatica. Si trova: fegato, cuore, muscolo scheletrico follicoli piliferi ecc.. Le mucine sono ritrovabili anche all’intero di neoplasie e sapere se una neoplasia produce muco si può identificarne la natura (adenocarcinoma). Mucine A) mucine acide: hanno gruppi acidi in grado di legarsi a coloranti basici. La loro capacità di legame dipende dalla loro dissociazione in gruppi reattivi e quindi dal pH. - Mucine fortemente solforate: tessuto connettivo (proteoglicani) ed epiteli→ si colorano a pH = 1 - Mucine debolmente solforate - Sialomucine carbossilate: enzima labili ed enzima resistenti→ si colorano a pH = 2-5 - Sialomucine solforate Se si stanno ricercando le mucine si utilizzano enzimi (sialidasi) che scindono queste sostanze, ma alcune di queste sialomucine sono resistenti e non si modificano. B) Mucine neutre: più rappresentate, non sono presenti gruppi acidi reattivi

Proteoglicani acidi: la componente glucidica è dominante rispetto alla proteica, queste molecole contengono dei gruppi acidi (fosforici, uronici). Possono essere colorati in condizione di pH acido. Meno distribuiti, prevalentemente sono mucine prodotte dalle cellule di origine mesenchimale (fibroblasti, cartilagine,) Colorazione Alcian blu, metacromasia rossa con blu blu di toluidina e azzurro A; non sono PAS+ Acido ialuronico Mucina prodotta dai fibroblasti. Contiene N-acetil-D-glucosammina e acido glucuronico. Reagiscono istochimicamene attraverso i gruppi carbossilici dell’acido glucuronico. Si colorano con coloranti cationici agli stessi valori di pH delle sialomucine: distinzione in base alla differente sensibilità. Metodiche di colorazione del glicogeno e delle mucine: 1. Ematossilina -eosina - poco utile - solo una debole colorazione aspecifica con eosina o ematossilina (Ehrlich) 2. Pas, Alcian, Mucicarminio 3. Uso di enzimi (per la ricerca del glicogeno) - amilasi - diastasi - ptialina - pectinasi (in corso di glicogenosi, dove l’eccesso di glicogeno anomalo non è digeribile dagli altri enzimi) Si effettua un pre-trattamento delle sezioni 37°C x 1h in una soluzione contente diastasi. Quindi si colora con la metodica prescelta (PAS, Alcian, ecc..). Alcuni fissativi ritardano la digestione con diastasi (glutaraldeide, tetraossido di osmio). pH può influire: - alfa-amilasi→ pH 5.5-6.0 - beta-amilasi→ pH 4.0-5.7

PAS (MacManus 1946). Metodo di elezione per la dimostrazione della presenza del glicogeno o delle mucine neutre. Si basa sull’impiego dell’acido periodico e del reattivo di Schiff. l’acido periodico provoca la rottura di gruppi glicolici adiacenti con formazioni di gruppi aldeidici: si rendono reattivi per reagire con il reattivo di Schiff (fucsina solforosa) che va a legarsi ai gruppi aldeidici andando a formare un composto colorato di rosso magenta. l’importante è che non passi troppo tempo dal posizionamento dell’ac. periodico e il reattivo di Schiff, perché i gruppi aldeidici potrebbero trasformasi in gruppi carbossilici e non legarsi più con il reattivo di Schiff. Fasi del PAS: 1. sparaffinatura e reidratazione delle sezioni (processo contrario!) 2. trattamento con acido periodico 0,5% (5-10’) 3. lavaggio in acqua 4. soluzione di Schiff (20-40’) 5. lavaggio in acqua 6. controcolorazione con ematossilna di Harris 7. lavaggio, ecc.. Affinché la reazione avvenga: • gruppi idrossilici liberi • composti formatici dopo l’ox non devono diffondere nel tessuto • azione dell’acido periodico deve essere rapida: gruppi aldeidici→ gruppi carbossilici • gruppi aldeidici devono essere numerosi→ polisaccaridi e mucine neutre • i mucopolisaccaridi acidi non reagiscono perché la presenza del gruppo SO3H blocca i gruppi reattivi • l’uso del pre-trattamento con diastasi distinzione tra glicogeno e mucine Con la colorazione PAS sono evidenziabili Candida e Aspergillus, in casi di ascessi polmonari, lesioni orali o genitali.

ISTOCHIMICA Colorazione per: Mucine o Mucopolisaccaridi acidi: - presenti net tessuti connettivi (collagene, parete dei vasi) - la componente gluidica è dominante rispetto a quella proteica, la presenza di gruppi acidi condizione la colorazione: queste sostanze non reagiscono con il PAS→ utilizzare altre colorazioni che permettono di mettere in risalto questi gruppi acidi (reagenti basici → CUPROFTALOCIALINE) I radicali acidi sono dissociati o in meno in funzione del pH del mezzo. - più il pH è basso e più rimarranno dissociati solo i radicali solfato rispetto a quelli fosfato o ai deboli radicali carbossile. Variano il pH della soluzione colorante si possono mettere in evidenza i mucopolisaccaridi ricchi in gruppi solfato da quelli c.d. non solforati (alcian blu a diversi valori di pH, da 1 a 2,5). ALCIAN Colorazione elettiva per mucine acide. Fanno parte del gruppo delle cuproftalocialine. Sono coloranti cationici in grado di legarsi ai gruppi polianionici dei mucopolisaccaridi acidi (radicali solforici e carbossilici) (i radicali fosfati degli acidi nucleici non reagiscono). Le colorazione dipendono dal pH: • pH 2,5→ ionizzate la maggior parte delle mucine acide (comprese quelle debolmente solforate, sialomucine o acido ialuronico) • pH1→ ionizzate solo le mucine fortemente solforate • facendo quindi 2 colorazioni della stessa sezione si potrà distinguere tra le varie mucine (neutre/acide) Alcian blu a pH 2,5 si può associare il PAS: Sostanza PAS+ Umucine neutre e glicogeno): rosso magenta, mucopolisaccaridi acidi: blu (colorazione alcianpas). I proteoglicani acidi pur avendo una cospicua componente glucidica nella molecola non sono PAS +. Poichè i gruppi vic-glicol sono impiegati in legami con catene laterali e non possono subire l’ox ad aldeidi. Tale proprietà è sfruttata nella colorazione Alcian-PAS. *Metaplasia intestinale si carica di una serie di mucine acide che sono facilmente visibili grazie alla colorazione Alcian che le colora il blu scuro. MUCICARMINIO Metodo indicato per l’evidenziazione dei mucopolisaccaridi acidi di natura epiteliale (mucine). È relativamente specifico perché le mucine derivate dai fibroblasti in genere si evidenziano debolmente. La soluzione colorante è formata da: • carminio • idrossido di alluminio • cloruro di alluminio • etanolo 50% Si ritiene che l’alluminio contenuto nella soluzione possa formare un complesso con la mucina (lacca). Come controcoloranti si può usare: • ematossilina di Mayer o di Weigert: nuclei→ coloro scuro quasi nero) • giallo metanile o la tartrazina: per gli altri costituenti tissutali Procedura standard: 1. preparare la soluzione di lavoro ematossilina ferrica Weigert secondo le istruzione 2. deparaffinare i vetrini in acqua deionizzata 3. colorare nella soluzione di lavoro ematossilina per 5 min 4. lavare in acqua corrente per 5 min 5. colorare ella soluzione di lavoro mucicarminio per 30 min o più a lungo, a T ambiente. Esaminare al microscopio il vetrino (controllo) 6. sciacquare in acqua deionizzata 7. colorare nella soluzione tartrazina per 1-5 min 8. scala degli alcool, xilolo, montaggio vetrino

Risultato: • mucine: da rosa scuro a rosso • nuclei: blu-viola • altri componenti: giallo chiaro PAS utilizzabile anche per molti microorganismi, come spore ed ife, ma anche Criptococcosi→ con mucicarminio

COLORAZIONI PER I LIPIDI Sono molecole solubili in sostanze quali xilolo usate nei processi di inclusione, disidratazione e sparaffinatura. Nei comuni preparati istologici colorati con ematossilina-eosina, le zone occupate dai lipidi appaiono come spazi otticamente vuoti. Se si vogliono mantenere in situ e opportunamente evidenziare si base istochimica: • si devono usare sezioni di tessuto congelato • tagliate al criostato Sezione istologica in formalina (base acquosa)→ congelamento → cellula viene danneggiata. Coloranti dei lipidi: Sudan III, Oil Red, Sudan nero B: • rosso-arancione per il Sudan III e Oil red • blu-nerastro per il Sudan nero B Non sono dei veri coloranti • non interagiscono con la sostanza che devono colorare • sono liposolubili e si concentrano dove vi è materiale lipidico OIL RED (OLIO ROSSO) Identifica soprattutto i lipidi neutri e gli acidi grassi nei tessuti Reagenti: • soluzione con olio rosso: 0,2 g di olio rosso in propanolo in 100 ml • soluzione di propanolo al 60% • ematossilina di Mayer Fasi colorazione: 1. immergere brevemente le sezioni congelate in 2-propanolo al 60% 2. colorazione in soluzione olio rosso e immergere in 2-propanolo brevemente 3. sciacquare con acqua distillata 4. collocare la sezione su vetrino 5. eseguire la controcolorazione con la soluzione emallume secondo Meyer 6. sciacquare con acqua distillata 7. differenziare (azzurramento) in acqua di rubinetto corrente 8. montare con gelatina glicerinata di Kaiser (mezzo di montaggio a base acquosa→ durata limitata per possibile disidratazione) (non utilizzabile balsamo perché richiederebbe passaggio in alcool e in xilolo per essere eliminati, questo provocherebbe la perdita della parte lipidica della sezione).

COLORAZIONI PER I PIGMENTI I pigmenti sono sostanze di natura organica o inorganica ce restano insolubili nella maggior parte dei solventi. Anche la formalina può dare un pigment...