Biophysik und Strukturbiologie - Zusammenfassung PDF

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Diese Zusammenfassung enthält die Vorlesungen der Strukturbiologie aus dem Sommersemester 2019. ...

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Biophysik und Strukturbiologie

VL1: Bioenergetik Bioenergetik untersucht Energieumwandlung in lebenden Strukturen: -

Zelle: Stoffwechselprozesse genau aufeinander abgestimmt Zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen:  Umwandlung verschiedener Formen von Energie ineinander  Energie = Fähigkeit Arbeit zu verrichten  Arbeit kann geleistet werden, wenn Materie sich in Richtung eines Potentialgradienten bewegt

3 Formen von Arbeit: -

Mechanische Arbeit (Fallhöhe x Gewicht) Elektrische Arbeit (Spannung x Ladung) Chemische Arbeit (Änderung der freien Enthalpie ΔG x Stoffmenge)  Einheit der Arbeit = J(oule) (N x m)

Energieumwandlung der Lebensprozesse gehorcht 2 Gesetzen der Thermodynamik: Offenes System: -

Tauscht mit Umgebung sowohl Energie als auch Materie (z.B. lebende Zellen)

Geschlossenes System: -

Tauscht mit Umgebung nur Energie, keine Materie (z.B. Proteinlösung in einem abgeschlossenen Behälter)

Innere Energie U -

In einem Medium gebundener Energiebetrag, der über kinetische und potentielle Energie des Schwerpunktes hinausgeht Ergibt sich aus mehreren Anteilen:  Physikalisch-thermisch (beruht auf kinetischer Energie, Rotationsenergie, Schwingungsenergie der Moleküle und intermolekularen WW)  Chemisch (potentielle Energie der Bindungskräfte)  Kernphysikalisch (beruht auf potentieller Energie in Atomkernen (Zerfälle, Spaltung, Fusion)  Weitere WW (z.B. von Dipolen mit äußeren Feldern)

Erster Hauptsatz der Thermodynamik -

Aus Prinzip der Energieerhaltung abgeleitet: Energie kann nur ineinander umgewandelt, aber nicht aus Nichts erzeugt oder vernichtet werden - In geschlossenem System:  Innere Energie U konstant, wenn keine Energie in Form von Wärmeenergie Q oder in Form von mechanischer Arbeit W an dem System geleistet wird  Bei Zuführung von Wärmemenge ΔQ von außen zu einem System: ΔQ = ΔU – ΔW  Zelle: könnte umgewandelte Energie recyclen  sich wie ein geschlossenes System verhalten (FALSCH)  in Natur offene Systeme Zweiter Hauptsatz der Thermodynamik -

Entropie S beschreibt Grad der Unordnung in einem System

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In geschlossenem System:  Grad der Ordnung kann beibehalten oder erniedrigt werden (ΔS >/= 0) Überlässt man geschlossenem System sich selbst, so bleibt alles wie es ist oder Chaos entsteht

Prozesse: Reversible und Irreversible Thermodynamische Potentiale beschreiben: Kann Reaktion spontan ablaufen? -

Enthalpie H: H = U + pV (innere Energie + Volumenarbeit) Gibbs-Energie G (freie Enthalpie): G = H – T x S  ΔG < 0  exergone Reaktion (spontan)  ΔG > 0  endergone Reaktion (nicht spontan)  ΔG = 0  Gleichgewichtzustand  Energetisch gekoppelte Prozesse möglich (z.B. ATP-gekoppelte Prozesse in Zellen)

Reversible chemische Reaktionen: Massenwirkungsgesetz!  GG-Zustand (ΔG = 0) -

im geschlossenen System  Zelle tot im offenen System erfolgt ständiger Stoffaustausch, der verhindert GG-Einstellung mit Umgebung  Fließgleichgewicht (konstante Stoffkonzentration weit vom thermodynamischen GG)  wichtigstes Kennzeichen des Lebens  Nur durch Entzug freier Enthalpie aus Umgebung können Organismen hohen Ordnungsgrad aufrecht erhalten (Leben = Insel der Ordnung)  Fließgleichgewicht als wichtiges Kennzeichen des Lebens

VL 2a – Molekulare Wechselwirkungskräfte, Wasser Molekulare Wechselwirkungskräfte Energien molekularer WW -

Kovalent: 200-500 kJ/mol Ionisch: 10-50 kJ/mol Dipol: 4-10 kJ/mol V.d.W.: 1-4 kJ/mol Wasserstoffbrücken: 4-30 kJ/mol

Ion-Ion und Ion-Dipol-WW -

Coulombsches Gesetz:

Elektrisches Dipolmoment μ = q x l [Cm]  Einheit 1 D (Debye) = 3,33564 x 10-30 Cm

Van-der-Waals-WW

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Lennard-Jones-Potential: Evdw = A/r12 – B/r6

Abstandsabhängigkeit molekularer WW -

Ion-Ion: 1/r Ion-Dipol: 1/r2 Dipol-Dipol: 1/r3 Ion-induzierter Dipol: 1/r4 Induzierter Dipol-induzierter Dipol: 1/r6 (Dispersion)

Wasser und Wasserstoffbrückenbindungen -

55% des Körpergewichts eines Erwachsenen besteht aus Wasser (Gewichtsanteile des Wassers variiert in verschiedenen Organen und Körperflüssigkeiten variiert) Struktur biologischer Makromoleküle hängt auch von ihrem Lösungsmittel ab Wasser besitzt großes elektrisches Dipolmoment μel:

Struktur von hexagonalem Eis: -

Struktur mit maximaler Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen Koordinationszahl 4 (2x Donor, 2x Akzeptor):  D-A Abstand: 2,76 A  Bindungsenergie: ca. 20 kJ/mol

Komplexe Struktur des flüssigen Wassers: Bei Raumtemperatur im Vergleich zu Eis: -

9% höhere Dichte Durchschnittliche Anzahl nächster Nachbarn = 4,5 Mittlerer Abstand nächster Nachbarn = 0,1 A größer Ungeordnete, dreidimensionale, wasserstoffverbrückte, dynamische, partielle Netzwerkstruktur

Oxonium-Ion: -

Lebensdauer des Oxonium-Ions ist sehr kurz (10-13 s)

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In Lösung: kontinuierlicher Übergang zwischen hydratisierten Protonen Begrenzende Spezies:  Zundel-Ion H5O2+  Eigen-Ion H9O4+

Grotthuss-Mechanismus -

Umlagerung von Bindungen Erklärt schnellen H+- und OH—Ionen-Transport im Wasser

 Wassermoleküle schwächen elektrostatische WW zwischen geladenen Gruppen durch Ausbildung von Lösungsmittelhüllen (ausgezeichnetes LM für polare und ionische Moleküle) Der hydrophobe Effekt -

Bildung eines einzigen Wasserkäfigs um 2 unpolare Moleküle  verringert Käfigoberfläche (Entropiegewinn) Wasserkäfig (Clathrat-Struktur) um ein unpolares Molekül (z.B. Öltröpfchen) Hydrophober Effekt bestimmt die Struktur amphiphiler Moleküle in Wasser (Detergenz-Micelle, Lipid-Doppelschicht)

VL 2b – Strukturen und Eigenschaften von Nukleinsäuren und Proteinen Nukleinsäuren

Strukturen der Purin- und Pyrimidinbasen

Raumstrukturen von DNA und RNA -

mRNA/ rRNA/ tRNA meist einzelsträngig DNA doppelsträngig DNA-Doppelhelix:  Basen innen  Phosphat-/Zuckerreste außen  Große/kleine Furche  DNA-Doppelhelix und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den heterocyclischen Stickstoffbasen und Stapelwechselwirkung der übereinanderliegenden Basen

 Stapelkräfte stabilisieren DNA-Doppelhelix erheblich Unterschiedliche Strukturen der DNA

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B-Doppelhelix kann Superstrukturen ausbilden, die durch unplanare Basenstellungen entstehen (Tilt, Roll)  Basenpaare können Propeller Twist aufweisen (A-DNA (18°), B-DNA (16°), Z-DNA (0°))

Raumstrukturen von t-RNAPhe aus Hefe -

Einzelsträngig Teilweise Basenpaarung stabilisiert L-förmige Struktur

Strukturen und Eigenschaften von Proteinen -

Monomere Bausteine: 20 natürlich vorkommende alpha-Aminosäuren

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Peptidbindung: Kondensation einer alpha-Carboxylgruppe einer AS und einer alphaAminogruppe einer zweiten AS  Peptidbindung ist nahezu planar  Cis- und trans-Peptidbindungen möglich, i.d.R. meist trans-Bindung aufgrund von sterischen Gründen (Ausnahme: Prolin)

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Disulfidbindungen: kovalente Bindungen, die bei Proteinfaltung eine große Rolle spielen

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Wichtige Strukturen:

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Konsequenz der Seitenkettenverteilung für die 3D-Struktur löslicher Proteine:  Hoher Anteil (40%) unpolare Reste  Verkleinerung der Oberfläche günstig  Globuläre Struktur bevorzugt Hierarchische Organisation von Proteinstrukturen

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V3 – Kooperativität und Allosterie Kooperativität -

Bei mehreren analogen Prozessen in einem Makromolekül bzw. makromolekularem Komplex (z.B. Bindung/ Dissoziation mehrerer Exemplare eines Liganden) Durch erfolgen dieses Prozesses an einer Stelle im Komplex, kann der Ablauf analoger Prozesse an anderen Stellen des Komplexes erleichtert (positive Kooperation) oder erschwert werden (negative Kooperation)

Allosterie -

In Proteine: Effektoren (regul. Molekül) binden an anderer Stelle als ihre Liganden Bindungsstärke ist abhängig von Zahl bereits gebundener Liganden (Kooperativität)

Schmelzkurve von DNA -

Kräfte, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, sind einzeln recht schwach Erwärmung, pH-Wert-Änderung führt zu:  Bruch H-Brückenbindung zwischen Basenpaaren  Beide Stränge der Doppelhelix trennen sich rasch  Hohe Viskosität einer DNA-Lösung geht verloren Messung der Absorption 260 nm:

Denaturierung der DNA Struktur denaturierter DNA Zu schnelle Abkühlung denaturierter DNA führt zu imperfekt basen-gepaarten DNA-Einzelsträngen. Energetik der Denaturierung

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Für stabile Helix muss ΔG > 0  ΔH > T ΔS ΔH positiv wegen WW zwischen den Basen (sowohl H-Brücken innerhalb der Basenpaarungen als auch v.d.W.-WW (Base-stacking) zwischen Basenpaaren  diese müssen stärker sein als Absorptionskräfte der negativ geladenen Phosphatgruppen (werden teilweise durch WW mit Na, K, etc. neutralisiert)) Helices mit höherem G+C-Gehalt höhere Schmelztemperatur (stabiler)  3 H-Brücken (bei AT-Paaren nur 2) und mehr Stacking für GC-Paare

Zusammenfassend steigt DNA-Schmelzpunkt: -

Mit höherem Anteil der GC-Paare Mit Zunahme der Ionenstärke Mit Verlängerung der Kettenlänge

Zusammenfassung -

Reversible Denaturierung ist kooperativ Wichtig für viele Prozesse:  In vitro – DNA-Sequenzierung, PCR, Oligonucleotid-Mutagenese, DNA-Nachweis)  In vivo (Replikation, Transkription)

Allosterische Regulation von Hämoglobin Sauerstoffproteine in Vertebraten

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Myoglobin (Mb): Transport- und Speicherfunktion, im Muskel Hämoglobin (Hb): Transportfunktion, im Blut Enthalten beide Häm, nur Ferroform (Fe-II) bindet O2

Struktur Myoglobin -

1 Kette (153 AS) Innen unpolar 75% alpha-helical Hämgruppe in unpolarer Nische gebunden Modell der Sauerstoffbindungsstelle des Mb: fünfter Ligand (His F8), sechster Ligand (O2), distales His E7 verhindert CO-Bindung und Oxidation zur Ferriform (FeIII)

Quartärstruktur von Hämoglobin 

4 Ketten mit je 1 Hämgruppe alpha2beta2 (Hb A Erwachsene) alpha (141 AS) beta (146 AS) Hb-Ketten sind denen des Mbs ähnlich

Eigenschaften des tetrameren Hämoglobins, die das monomere Myoglobin nicht besitzt: -

H+ und CO2-Transport Bindung O2, H+ und CO2 durch allosterische WW reguliert Hb ist das am besten verstandene allosterische Protein Hämoglobin zeigt 3 Arten allosterischer Effekte:  Sauerstoffbindung erfolgt kooperativ  H+ und CO2 begünstigen Sauerstoffabgabe (Bohr-Effekt)  2,3-Bisphosphoglycerat erniedrigt Sauerstoffaffinität von Hb

Kooperative Bindung von Sauersoff an Hämoglobin

Hill-Koeffizient -

Maß für Kooperativität Wert n steigt mit Ausmaß der Kooperativität an n < Zahl der Bindungsstellen

Kooperativität erhöht Sauerstoffbelieferung durch Hämoglobin -

Änderung Sauerstoffpartialdruck verändert Sauerstoffsättigung des Hämoglobins stärker als bei unabhängigen Bindungszentren Unter typischen physiologischen Bedingungen kann Hb 1,83 mal mehr Sauerstoff transportieren als mit 4 unabhängigen Bindungsstellen

Bohr-Effekt: -

H+ und CO2 erleichtern die O2-Freisetzung aus Hämoglobin In Gewebe mit intensivem Stoffwechsel: hohe Konzentration von H+ und CO2 erleichtern O2Freisetzung von aus Hämoglobin In alveolären Lungenkapillaren: hohe Konzentration von O2 erleichtert Freisetzung von H+ und CO2 aus Hb

2,3-Bisphosphoglycerat:   

Kleines Molekül mit hoher negativer Ladungsdichte Bindet an Desoxyhämoglobin, nicht aber an Oxyhämoglobin Erniedrigt Sauerstoffaffinität des Hb Ohne 2,3-BPG hätte Hb gleiche Sauerstoffaffinität wie Myoglobin Entscheidend, dass Hb in Gewebskapillaren Sauerstoff abgeben kann

Fötales Hb bindet 2,3-BPG schwächer als erwachsenes Hb:

Weitere wichtige Infos: -

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Allosterische Eigenschaften des Hämoglobins entstammen den WW zwischen seinen alphaund beta-Untereinheiten:  T-state: erhält durch Salzbrücken eine Spannung  senkt Sauerstoffaffinität (Desoxyhämoglobin)  R-State: Salzbrücken fehlen  hohe Sauerstoffaffinität (Oxyhämoglobin) Sauerstoffbindung initiiert Strukturänderung:  Bewegung Histidin F8  Bewegung der F-Helix  Übertragung auf Kontaktflächen der UE  Aufbrechen der Salzbindungen Kohlenstoffdioxid bindet endständige Aminogruppe des Hbs:  Carbamatgruppe bildet Salzbindungen aus  Stabilisierung T-Form  Senkung Sauerstoffaffinität

Zusammenfassung

VL 4 – Biophysik des Herzens Transport

Wie entsteht das Ruhemembranpotential? Zeitlicher Verlauf eines Nerv-Aktionspotentiales

Veränderung Natrium- und Kalium-Permeabilität während Aktionspotential

Aufbau des Herzens

Aktionspotential des Herzens

Erregungsleitung

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SK: Spontanes Aktionspotential  Kein Ruhepotential, geringe stabilisierende K-Leitfähigkeit  Maximales (minimales), diastolisches Potential -55 … -60 mV  Langsame diastolische Depolarisation durch If (HCN 1, 4)  Aufstrich durch Ca-Kanäle (keine Na-Kanäle)  Repolarisation durch K-Kanäle Fortleitung über GAP-Junctions durch Connexone (Kalium) Aktionspotential nächste Zelle Vorhoferregung (Aktionspotentiale) Aktionspotential AV-Knoten (Schwelle wird erreicht bevor er selbst depolarisiert) Erregungsleitung über His-Bündels, Kammerschenkel, Purkinje-Fasern ins Arbeitsmyokard Erregung im Arbeitsmyokard (innen nach außen, Basis zur Spitze, Aktionspotentiale) Repolarisation des Arbeitsmyokards

Elektromotorische Kopplung (EC)

Frank-Starling Mechanismus Anpassung des Herzzyklus an erhöhte Volumenbelastung (Preload) oder Druckbelastung (Afterload) EKG (Elektrokardiogramm) - Mittel zur Diagnostik

VL 5 – Einführung in die Strukturbiologie Methoden zur Strukturbestimmung biologischer Objekte

Lichtmikroskopie -

Entdeckung von Zellen, ihr Aufbau aus Zellkern und Zellplasma von Mitochondrien, Golgi etc. Natürliche Grenze der Vergrößerung durch Beugung der Lichtwellen (diffuses Bild) Getrennte Abb. Zweier kleiner Objekte, wenn Beugungsscheibchen nicht überlappen Kritischer Abstand d = Auflösungsvermögen des Mikroskops

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Je kleiner die Wellenlänge, desto größer Auflösungsvermögen  Immersionsöl ermöglicht höhere Auflösung als Luft

Elektronenmikroskopie Biologische Anwendungen der Elektronenmikroskopie: -

Organelle: ca 40 A Membranen mit eingebetteten Proteinen (ATPasen): 20-30 A Einzelmolekül-EM (Kombination von Cryo-EM, Bildanalyse und -mittelung): 10-20 A EM an 2D-Kristallen (vorwiegend Membranproteine) in Kombination mit Elektronendiffraktionsaufnahmen

Rasterelektronenmikroskop (REM) -

Elektronenstrahl wird rasterförmig über Probe geführt Von Probe reflektierte Elektronen werden gemessen Sekundärelektronenausbeute von Punkt zu Punkt verschieden  Berechnung eines dreidimensionalen Abbildes der Oberfläche Vorteil: große Tiefenschärfe

TEM -

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Probenpräparation:  Kontrastierung: Streufähigkeit nimmt mit zunehmender Kernladungszahl zu, biolog. Material hat niedrige Ladungsdichte, Kontrast sehr gering, einfärben der Probe/Umgebung mit Salzen von schweren Elementen  Positiver Kontrast („positive staining“): Schwermetallsalze werden an verschiedenen Organellen/Makromolekülen fixiert, Probe dunkel, Umgebung hell  Negativer Kontrast („negative staining“): Probe bleibt ungefärbt, wird aber eingebettet in einen trockenen Film, Probe heller Fleck auf dunklen Untergrund Vorteil: hoher Kontrast Nachteil: während der Eintrocknung kann es zur Schrumpfung der biologischen Probe kommen Probleme: Detailverlust, erzielbare Auflösung durch Korngröße des Schwermetallansatzes auf 2 nm begrenzt

Cryo-EM -

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Problem bei konventionellem EM:  Probe trocken und im Hochvakuum  Färbetechniken recht harsch  Erzeugen Detailverlust  Biolog. Proben werden stark in Struktur verändert Aufgabe:  Biologisches Material im Hochvakuum stabilisieren ohne dass es austrocknet Lösung:  Wässrige Suspension der Probe wird auf einen Träger-Grid in dünner Schicht aufgebracht  Grid wird schlagartig in flüssiges Ethan getaucht  Wasser in Probe kann sich nicht kristallin anordnen  Wasser erstmal amorph = vitrifiziertes Eis

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Vorteile:  Empfindliche biologische Objekte in ihrer natürlichen Umgebung fixiert, behalten native Form bei  Durch Schockgefrieren und Arbeiten bei Temp. von flüssigem Stickstoff ist Probe im hydratisierten Zustand im Hochvakuum stabil

Vorteile und Limitierungen der EM -

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Vorteile:  Sehr kurze Wellenlänge  Starke WW mit Materie  Elektromagnetische Linsen (kontinuierlich durchstimmbar)  Hohe Strahlenintensität ist leicht zu erzeugen Limitierungen:  Hochvakuum erforderlich  Elektronenmagnetische Linsen (ermöglicht nur Bündelung)  Objekte müssen sehr dünn sein  Biologisches Material zeigt wenig Elektronenkontrast  Strahlenschaden ist hoch (starke WW mit Materie) Informationsgehalt:  Topographie: Oberflächenstruktur  Morphologie: Form und Größe der Teilchen, die das Objekt bilden  Zusammensetzung: Art und Menge der Elemente, die das Objekt aufbauen  Struktur: innerer atomarer Aufbau des Objektes

Schritte der EM-Einzelpartikel-Rekonstruktion -

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Probe herstellen, Bilder aufnehmen Partikel auf Bildern identifizieren Partikel ausrichten, klassifizieren und mitteln Orientierung der Partikel bestimmen 3D-Rekonstruktion Partikel-Identifizierung:  Manuell: per Auge Partikel im Bild eindeutig selektieren (anstrengend, mühsam speziell bei großen Datensätzen)  Automatisch: gut für große Datensätze, erfordert Kenntnis der Partikelgröße (Radius), Nutzer muss ggf. korrigieren Partikel-Klassifizierung:  Suche nach gemeinsamen Merkmalen innerhalb einer Untergruppe der Partikel  Nutzt spezielle mathematische Operationen, um aus EM-Bildern sog. Eigenbilder zu erzeugen  Prozess läuft literativ ab: zunächst grobe Gruppierung, schrittweise feinere Gruppierung Partikel-Orientierung:  Verschiedene Projektionen werden miteinander in Beziehung gebracht  kippen um eine bzw. um zwei Achsen

Probleme bei Einzelpartikel-Rekonstruktion: -

Probe muss sehr homogen und rein sein Je mehr Partikel ausgewertet werden, umso besser Benötigt sehr viel Rechenzeit Ohne Kippen des EM-Grids muss davon ausgegangen werden, dass die Partikel in zufälligen Orientierungen fixiert werden

Beispiele für Einzelpartikelrekonstruktion: -

am einfachsten Viruspartikel mit Massen von bis zu 100 MDa, ikosaderischer Struktur (höheres S/N, weniger Aufnahmen nötig) Strukturlösung eines Virus in unter einem Monat mögl, Entwicklung zur Routinemethode

Weitere EM-basierte 3D-Methoden -

2D-Kristallographie: ermöglicht in Einzelfällen atomare Auflösung, fast ausschließlich Anwendung auf Membranproteine Elektronen-Tomographie: 3D-Strukturbestimmung von großen Einzelpartikeln

Beispiele für Elektronenkristallographie (2D-Kristalle):

αβ Tubulin bei 3,7 A -

2D-Kristall Dritte Proteinstruktur mit dieser Methode nach bR und LHCII Qualität aufgrund guter Phaseninformation besser als die aus Röntgenstrukturanalyse bei gleicher Auflösung

Abtastende Verfahren -

Rastertunnelmikroskop (STM) Rasterkraftmikroskop (AFM)

Neutronen- und Röntgenwinkelstreuung Kleinwinkelstreuung -

Aussage über Struktur und Dynamik in Lösung befindlicher Moleküle

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Klärung konformationeller Übergänge (Effektor-Bindung, Neubildung, Faltung, Entfaltung) Leichte Präparation, geringe Proteinkonzentratio...