Biureet methode - Copy - Praticum biureeet PDF

Preview

Summary

Praticum biureeet...

Description

EIWITBEPALING

Inhoud Inleiding................................................................................................................................................. 2 Werkwijze.............................................................................................................................................. 3 Experiment 2: Totaal eiwitbepaling – BIUREETMETHODE..................................................................3 Experiment 3: Serum proteïne elektroforese (SPE)............................................................................4 Experiment 4: Immunofixatie elektroforese.......................................................................................4 Resultaten.............................................................................................................................................. 5 Experiment 2: Totaal eiwitbepaling BIUREET METHODE....................................................................5 Formule.............................................................................................................................................. 5 Experiment 3: SPE..............................................................................................................................5 Experiment 4: Immunofixatie.............................................................................................................5 Bespreking.............................................................................................................................................6 Biureetmethode.................................................................................................................................6 Serum Proteïne Elektroforese (SPE)....................................................................................................6 Immunofixatie Elektroforese (IFE)......................................................................................................6 Conclusies..............................................................................................................................................7 Immunofixatie Elektroforese (IFE)......................................................................................................7 Serum Proteïne Elektroforese (SPE)....................................................................................................7 Extra vragen...........................................................................................................................................8 Experiment 2: Totaal eiwitbepaling- BIUREETMETHODE....................................................................8 Experiment 3: Serum proteïne elektroforese (SPE)............................................................................8 Bijlage....................................................................................................................................................9

Inleiding

Men kan het totaal eiwit in een serumstaal bepalen op zowel semi-kwantitatief als kwantitatief methode. Maar hier wordt alleen kwantitatieve bepaling uitgevoerd. Dat doet men met behulp van de buireetmethode. Het kopersulfaat reageert tot een paars complex met peptidebindingen waaruit eiwit is opgebouwd. De intensiteit van kleur is een maat voor het aantal peptidebindingen. De absorbantie wordt gemeten met de spectrometer bij 530-570 nm. De bepaling van totaal serumeiwit is niet voldoende om diagnose vast te stellen. Daarom wordt er een serum eiwitelektroforese uitgevoerd. Onder invloed van een elektrisch veld, gaan de negatief geladen eiwitdeeltje naar de positieve pool migreren. Nadat die volledig gemigreerd, zijn worden ze gefixeerd in een zuur/alcohol medium en gekleurd met een amidozwart-oplossing en daarna terug ontkleurd en gedroogd. De gekleurde elektroforetische gescheiden zones kan men visueel waarnemen. Met densitometrie kan men de relatieve concentraties van elke fractie bepalen. Een specifieke toename of afname van een of meer fracties kan verwijzen naar bepaalde ziekten. Extra band in het gamma-gebied wijst op de aanwezigheid van monoklonaal eiwit (M-proteïne). Er wordt door middel van immunofixatie het type paraproteïne (IgM, IgA, lambda, kappa ) ketens geïdentificeerd. Om te bepalen welke type immunoglobuline verantwoordelijk is, wordt er op een agarose gel verdund serummonster aangebracht in elke spleet. Door de elektrische stroom, gaan het eiwitdeeltje migreren op basis van grootte en lading. Vervolgens worden de serumproteïnen gefixeerd door antisera met verschillende specificiteit op te brengen in de gel. Na immunofixatie worden de geprecipiteerde proteïnen met zuurviolet gekleurd waardoor men alle banden kan zien op de controle laan ELP, en op de andere lanen ziet men enkel de banden van de overeenkomstige humane antilichamen. Aan de hand van deze gekleurde banden kan me te weten komen welke elementen verantwoordelijk zijn voor de verhoogde gamma-fractie.

Werkwijze Experiment 2: Totaal eiwitbepaling – BIUREETMETHODE Pipeteerschema Reagentia (ml)

Reagens blanco Bijsluite Bij ons

Standaard

Staal

Staal blanco Bijsluiter Bij ons

r Serum 0,05 Water 0,05 Standaard 0,05 2,50 2,50 2,50 2,50 Biureet reagens Blancobiuret -Goed mengen en 30 min incuberen op kamertemperatuur

0,05

2,50

-Meet absorbantie op 546 nm Wij hebben absorbantie gemeten met Ultrospec 2100 Pro

Experiment 3: Serum proteïne elektroforese (SPE) -Zie handleiding op cursus

Experiment 4: Immunofixatie elektroforese -Zie handleiding op cursus

Resultaten Experiment 2: Totaal eiwitbepaling BIUREET METHODE

0,05 2,50

Stalen

Absorbantie t.o.v. water

Staal 3 Staal 6 Staal 7 Staal 8 Staal 10 Controle Standaard Firma reagens blanco Ons reagens blanco Staal blanco 3 Staal blanco 10 Blancobiuret

0,261 0,472 0,398 0,422 0,342 0,303 0,384 0,065

Absorbantie Absorbantie t.o.v. t.o.v. Reagensblanco blancobiuret (bijsluiter) 0,199 0,413 0,339 0,362 0,282 0,238 0,321

Absorbantie Concentratie t.o.v. Aan eiwitten biureetreagens in het staal (g/100 mL) 3,72 7,72 6,34 6,77 5,27 4,44 6,00

0,046 0,007 0,006 0,000

0,007 0,007

-0,055

Formule C= 6 x (Asample/Astandaard) g/100mL Cstaal 3 = 6 x (0,199/0,321) =3,72 g/100mL

Experiment 3: SPE Zie bijlage: Figuur 2

Experiment 4: Immunofixatie Zie bijlage: Figuur 1

Bespreking Biureetmethode De normale waarde van eiwit in serum is 6,6 -8,7 voor volwassene. Stalen 3 ,7 en 10 hebben lagere concentratie dan de normale waarde. Concentratie die men volgens de bijsluiter heeft berekend voor staal 3 en staal 10

Cstaal 3 = 3,72 g/100mL Cstaal 10 = 5,27 g/100mL Concentratie die volgens ons wordt berekend Cstaal 3 = 6 x( (0,199-0,007)/0,321)) = 3,59 g/100 mL Cstaal 10 = 6x ( 0,282-0,007)/0,321)) = 5,16 g/100mL De concentraties die op 2 manieren wordt berekend, wijken niet zo veel af van elkaar.

Serum Proteïne Elektroforese (SPE) Na het scannen van SPE gel, bekomt men elektroferogrammen van verschillende stalen. Er wordt besloten om per persoon 2 stalen te bespreken. Ik moet de elektroferogram van staal 3 en staal 4 interpreteren. Op de elektroferogram van staal 3, ziet men dat albumine in normaal hoeveelheid aanwezig is. Men merkt dat alfa 2 en bèta in verhoogde toestand aanwezig is. De verhoging van alfa 2 en bèta fractie kan wijzen op acute en chronische ontsteking, nefrotisch syndroom Op de elektroferogram van staal 4, merkt men dat albumine in normaal hoeveelheid aanwezig is. De hoeveelheid alfa 1 fractie is ook normaal. Bij de hoeveelheid alfa 2 fractie ziet men flinke stijging. Ook de bèta fractie is gestegen. De alfa 2 fractie stijgt bij ontsteking en nefrotisch syndroom. Bij ontsteking is de stijging te wijten aan de gestegen acute-fase eiwitten. Bij controle merkt men dat albumine fractie in normaal hoeveelheid aanwezig. Alfa 1 fractie is helemaal niet te zien. De alfa 2 fractie en bèta fractie zijn verhoogd. De gamma fractie is normaal.

Immunofixatie Elektroforese (IFE) Men heeft immunofixatie gedaan van staal 10. Op elektrogram van staal 10 merkt men een verhoging van gamma fractie. Met de immunofixatie elektroforese tracht men achter te halen welke paraproteïne (gamma, alfa, mu, kappa, lambda ketens) verantwoordelijk is voor de verhoging van gamma fractie. Na de kleuring van de gel waarop staal 10 de immunofixatie-elektroforese wordt uitgevoerd, zijn er verkleurde banden zichtbaar. Men ziet een dikke en donkere band in IgG en lambda (L)laan. Men ziet geen banden bij andere lanen.

Conclusies Immunofixatie Elektroforese (IFE) Er is sprake van monoklonale aandoening. Het type monoklonale proteïne die aanwezig is in het serum is IgG lambda.

Serum Proteïne Elektroforese (SPE) Persoon van wie dit serum 3 en 4 werd afgenomen kan nefrotisch syndroom of acute ontsteking hebben.

Extra vragen Experiment 2: Totaal eiwitbepaling- BIUREETMETHODE 1) Neen, het is niet foutief van de firma. Biureet reagens kan prefect gebruikt worden als reagens blanco. Reagensblanco bevat alleen maar reagens. 2) De juiste methode is de staal blanco af te lezen t.o.v. blancobiuret. Als je staalblanco t.o.v de buireetreagens meet, krijgt je veel lagere negatieve waarde. 3) Cstaal = (A staal*c standaard)/ A standaard 4)

5) cstaal =( (A staal - A staal blanco)*c standaard)/ A standaard

Experiment 3: Serum proteïne elektroforese (SPE) 1) Er vindt een redoxreactie plaats. 2)Er is evenveel buffer aan beide kanten van de gel omdat de eiwitten aan een constant snelheid moet migreren naar de andere pool. 3)Je kan de buffer enkel meerdere keer gebruiken als er geen elektroden vrijgelaten wordt in de buffer. 4) De eiwitten migreren naar de anode kant omdat in de basische buffer die we hiervoor gebruiken de eiwitten negatief geladen zijn. 5) Dat is alleen van toepassing als de iso-elektrische punt van eiwitten onder 8 liggen. Als ze boven 8 liggen dan zijn ze positief geladen. Dan gaan ze migreren naar de kathode kant. 6) Stalen waarvan de gamma fractie verhoogd is, en albumine fractie verlaagd is op de elektroferogram worden verder onderzocht. Men spreekt dan van M-proteïne. En om te weten welke paraproteïne hier betreft, wordt immunofixatie elektroforese uitgevoerd.

Bijlage...