Capitulo 10- Estragias Reguladoras PDF

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BIOQUIMICA II, las enzimas deben regularse debido a que todas las con mayor eficacia cuando reguladas por CITIDINA TRIFOSFATO (CTP) que es el producto final de una ruta etapas, controla el flujo a de esta inhibiendo una etapa por la ASPARTATO TRANSCARBAMILASA actividad se regula por 5 maneras Contro...

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BIOQUIMICA II, Capítulo 10

ESTRAGIAS REGULADORAS

Todas las enzimas deben regularse debido a que todas las vías metabólicas fluyen con mayor eficacia cuando están reguladas por señales. LA CITIDINA TRIFOSFATO (CTP) que es el producto final de una ruta con muchas etapas, controla el flujo a través de esta vía inhibiendo una etapa clave catalizada por la ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCASA) La actividad enzimática se regula por 5 maneras principales:

1- Control Alostérico: las proteínas Alostéricas contienen distintos centros reguladores y múltiples centros funcionales. Las proteínas Alostéricas exhiben una propiedad llamada cooperatividad (debido a que la actividad de un centro funcional afecta la actividad de los demás). Las proteínas que muestran control Alostérico son transductoras de información: su actividad se puede modificar en respuesta a las moléculas de señal o a la información compartida entre los centros activos. LA ENZIMA ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCASA), cataliza la primera etapa en la síntesis de Pirimidinas, que se inhibe a través de LA CITIDINA TRIFOSFATO (CTP) (que es el producto final de esta biosíntesis) Esta inhibición nos muestra un ejemplo representativo de retroinhibición (o inhibición feedback). 2-Múltiples Formas enzimáticas: las isozimas; permiten regular de modo diverso una misma reacción en diferentes lugares y tiempo. LAS ISOZIMAS: son enzimas homologas dentro de un mismo organismo que catalizan la misma reacción pero presentan pequeñas diferencias en su estructura; y también en los valores de KM y VMáx; como también las propiedades reguladoras. 3- Modificación Covalente Reversible: se puede alterar la actividad catalítica de muchas enzimas por medio de la unión covalente de un grupo químico que los altera y los modifica. Por lo general un grupo fosforilo. El ATP actúa como donador de fosforilo en las reacciones catalizadas por proteínas Quinasas. Por ejemplo la Proteína Quinasa A (PKA).

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Las proteínas Fosfatasas, se encargan de la eliminación de los grupos fosforilos mediante hidrolisis. 4- Activación Proteolítica: hay diferentes modos de regulación para convertir de manera irreversible a una enzima inactiva a su forma activa. Muchas enzimas se activan por la hidrolisis de uno o unos pocos enlaces peptídicos de sus precursores inactivos, llamados Zimógenos o Proenzimas (por ejemplo la Quimotripsina, la Tripsina y la Pepsina) La cascada de coagulación se da por la activación de Zimógenos Las enzimas activas digestivas y de la cascada de coagulación se pueden desactivar uniéndolas irreversiblemente con proteínas inhibidoras específicas que actúan como cebos irresistibles para sus presas moleculares. 5-Control de la Cantidad de Enzima Presente: se da habitualmente durante la transcripción y se puede regular la actividad enzimática ajustando la cantidad de enzima presente.

LA ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCASA): se inhibe alostéricamente por el producto final de su propia vida (CTP). -Cataliza la primera etapa de la biosíntesis de Pirimidinas: la condensación de Aspartato y Carbamilfosfato para formar --> N-Carbamilaspartato y ortofosfato. Esta reacción es una etapa limitante de la ruta que al final proporciona Pirimidinicos, como LA CITIDINA TRIFOSFATO (CTP)

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¿COMO SE REGULA ESTA ENZIMA? La ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa) se inhibe por CTP el producto final de la vía iniciada por ella misma.

Entonces cuando hay bajas concentraciones de CTP, la velocidad de reacción catalizada por la ATCasa es elevada. Pero a medida que aumenta las concentraciones de CTP, se va disminuyendo la velocidad de reacción catalizada por la ATCasa. Entonces se produce Pirimidinas hasta que se acumulan cantidades suficientes de CTP. (Esto es un ejemplo de retroinhibición)

La retroinhibición causada por CTP asegura que cuando haya bastantes Pirimidinas; no se produzcan innecesariamente ni N-Carbamilaspartato ni los compuestos intermediarios. Se sabe que el CTP es muy distinto estructuralmente a los sustratos de la reacción. Por lo que nos lleva a suponer que el CTP se une a un centro distinto del centro activo donde se unen los sustratos. (Centros Alostéricos o centro reguladores). En la ATCasa, los centros catalíticos y los centros reguladores están situados en distintas cadenas polipeptidicas.

LAS ENZIMAS REGULADAS ALOSTERICAMENTE NO SIGUEN CINETICAS DE MICHAELIS-MENTEN Las enzimas Alostéricas son susceptibles a ser reguladas por otras moléculas, además se distinguen por su respuesta a los cambios en las concentraciones de sustrato.

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En esta imagen podremos observar la velocidad de formación de producto por la ATCasa en función de la concentración de sustrato que haya. La curva no es igual a una enzima que sí sigue la cinética de Michaelis. La curva que se observa se denomina Sigmoidea. La mayoría de representan esto.

enzimas

Alostéricas

Las curvas sigmoideas reflejan la que hay cooperatividad entre las subunidades: la unión de un sustrato a un centro activo aumenta la posibilidad de que más sustrato se una a otros centros activos.

LA ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCASA) La ATcasa puede disociarse en subunidades reguladoras (r) y subunidades catalíticas (c) por medio de un tratamiento con un compuesto mercurial, como el p-hidroximercuribenzoato que reacciona con los grupos sulfhidrilos (AA Cisteina) Se demostró que la ATcasa está formada por dos tipos de subunidades se logró mediante estudios de ultracentrifugación ayudados con tratamiento con Mercurio. Las subunidades pueden separarse fácilmente por cromatografía de intercambio iónico: ya que estas difieren en su carga o por centrifugación en gradiente de densidad en sacarosa, porque difieren en su tamaño. Diferencias en los Coeficientes de sedimentación: El de la enzima nativa es de 11.6 S mientras que los coeficientes de las subunidades disociadas son 2,8 S y 5,8 S.

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Para liberar el p-mercuribenzoato unido a las subunidades separadas se agrega Mercaptoetanol en exceso.

-LA SUBUNIDAD MAYOR: ES LA SUBUNIDAD CATALITICA, presenta actividad catalítica PERO no se ve afectada por el CTP y no muestra cinética sigmoidea. Consta de 3 cadenas (C3) de 34 kDa cada una. -LA SUBUNIDAD MENOR: ES LA SUBNIDAD REGULADORA, puede enlazar el CTP pero no tiene actividad catalítica. Consta de 2 cadenas (de 17 kDa cada una). Al mezclar, las dos subunidades (C) y (R) estas se combinan con rapidez, dando como resultado un complejo con las misma estructura C 6R6 que el de la enzima nativa: dos trímeros catalíticos y tres dímeros reguladores. 2(C3)+3(R2)C6R6 ¿QUE INTERACCIONES ENTRE SUBUNIDADES SON RESPONSABLES DE LAS PROPIEDADES DE LA ATCASA? Los 2 trímeros catalíticos están apilados uno encima del otro, unidos por 3 dímeros de cadenas reguladoras. Hay contactos importantes entre las subunidades catalíticas y las subunidades reguladoras; entonces cada cadena r de un dímero regulador interacciona con una cadena c del trímero catalítico. La cadena C está en contacto con un dominio estructural de la cadena R que está estabilizado por un ion de Zinc que se une a 4 residuos de Cisteina. La capacidad del p-mercuribenzoato para disociar las subunidades catalíticas y reguladoras está relacionada con la afinidad del mercurio para unirse fuertemente a los residuos de Cisteína, desplazando al zinc (carga +2) y desestabilizando este dominio de la subunidad R.

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Para poder localizar los centros activos, se cristalizo la enzima en presencia de N(fosfonacetil)-L-aspartato (PALA) un análogo bisustrato. Parece ser un intermediario en la reacción. EL PALA: es un potente inhibidor competitivo de la ATCasa: se une a los centros activos y los bloquea. Este se une a los centros situados en la interfase de las parejas de las cadenas C, dentro de cada trímero catalítico. El complejo ATCasa-PALA revela que al unirse el PALA hay un cambio importante en la estructura cuaternaria de la enzima: los dos trímeros catalíticos se desplazan unos 12 A, alejándose uno del otro y girando aproximadamente unos 10° alrededor de su eje ternario. Además los dímeros reguladores giran aproximadamente unos 15°. Por lo que al unirse PALA, la enzima se expande.  EN RESUMEN, La ATCasa presenta dos formas diferentes de estructura cuaternaria: 1- una que predomina en ausencia de sustratos o sus análogos y 2- otra que predomina cuando están unidos los sustratos o los análogos. Estas formas se denominan respectivamente, ESTADO T (Tenso) y ESTADO R (Relajado.

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Sabemos que la enzima está en equilibrio entre el estado R y el estado T. En ausencia de sustrato, casi todas las moléculas de la enzima están en estado T. El estado T (porque el estado T es más estable que el estado R.) tiene poco afinidad por el sustrato por lo tanto muestra baja actividad catalítica. A medida que se va uniendo una molécula de sustrato a un centro activo de la enzima aumenta la probabilidad de que la enzima completa se desplace al estado R aumentando la afinidad. LA ADICCION DE MAS SUSTRATO TIENE 2 EFECTOS  Primero, aumenta la probabilidad de que cada molécula de enzima se una a otra nueva molécula de sustrato.  Segundo, aumenta el promedio de moléculas de sustrato unidas a cada enzima. La presencia de más sustrato aumentara la fracción de moléculas de enzima en el estado R más activo, PORQUE la posición del equilibrio depende del número de centros activos que estén ocupado por sustrato.

Los efectos de los sustratos en las enzimas Alostéricas se denominan homotrópicos El mecanismo para la regulación alostérica se denomina Mecanismo Concertado, debido a que el cambio en la enzima es “todo o nada”; la enzima se transforma de T a R, afectando por igual a todos los centros catalíticos. El mecanismo Secuencial, supone que la unión de ligando a un centro del complejo puede afectar a los centros vecinos, sin obligar a que todas las subunidades tengan que experimentar la transición de T a R. La curva sigmoidea para la ATCasa, se considera como una curva compuesta por dos curvas de Michaelis: 1-Una en estado T, 2- la otra en estado R. Un aumento den la concentración de sustrato favorecería la transición de la curva del estado T al estado R.

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En el estado T, los dímeros reguladores mantienen los trímeros catalíticos lo suficientemente cercanos entre sí para que colisionen bucles clave de sus superficies e intervengan en los ajustes conformacionales necesarios para conseguir una elevada afinidad por el sustrato y por la catálisis.

LOS REGULADORES ALOSTÉRICOS MODULAN EL EQUILIBRIO ENTRE T Y R Los estudios por rayos X de la ATCasa en presencia de CTP han demostrado que: 1- La enzima se une al CTP cuando está en estado T y 2- que hay un centro de unión para este nucleótido en cada cadena reguladora, en un dominio que no interacciona con la subunidad catalítica. Cada centro activo está situado a más de 50 A del centro de unión a CTP más próximo. La unión del inhibidor CTP desplaza el equilibrio hacia el estado T, disminuyendo la actividad neta de la enzima. La unión del CTP dificulta que la unión de sustrato convierta la enzima al estado R. En consecuencia.

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El CTP aumenta la fase inicial de la curva sigmoidea. Se requiere más sustrato para alcanzar una velocidad de reacción determinada. UTP, es el precursor inmediato de la CTP, también regula la ATCasa. Mientras que es incapaz de inhibir la enzima sola, el UTP inhibe sinérgicamente la ATCasa en presencia de CTP.

Los cambios estructurales cuaternarios observados en la unión del sustrato de analógico sugieren un mecanismo para la inhibición por CTP (figura 10.13). La unión del inhibidor de CTP al estado T desplaza el equilibrio entre T-R en favor del estado T, disminuyendo la actividad enzimática. El CTP aumenta el coeficiente Alostérico de 200 en su ausencia a 1250 cuando todos los sitios reguladores están ocupados por CTP. La unión de CTP hace que sea más difícil para la unión del sustrato para convertir la enzima en el estado R.

EL ATP, también es un efector Alostérico de la ATCasa, uniéndose al mismo sitio que el CTP. Sin embargo, la unión de ATP estabiliza el estado R, reduciendo el coeficiente de alostérico 200 a 70 y por lo tanto el aumento de la velocidad de reacción a una concentración de Aspartato dado (figura 10.14). (El efecto del ATP consiste en aumentar la velocidad de reacción a una determinada concentración de Aspartato.) A altas concentraciones de ATP, el perfil cinético muestra un comportamiento sigmoidal menos pronunciada. El ATP compite con el CTP por unirse en los centros reguladores. Debido a que el ATP y el CTP se unen en el mismo sitio; entonces altos niveles de ATP previenen la inhibición de la enzima por CTP.

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Los efectos de moléculas que no son sustratos de las enzimas Alostéricas (tales como el CTP y el ATP en la ATCasa) se denominan Efectos Heterotropicos. Los sustratos hacen que la curva se haga sigmoidea (efectos homotrópicos) mientras que los reguladores modifican la K M (efectos heterotrópicos). Ambos tipos de efectos se generan al modificar la relación entre T/R.

-A bajas concentraciones de sustrato, la curva se parece mucho a la de la enzima estado T. A medida que aumenta la concentración de sustrato, la curva se desplaza progresivamente para asemejarse a la de la enzima estado R (figura 10.10). ¿Cuál es la ventaja bioquímica de la Cinética sigmoidal? R/: La transición de las enzimas Alostérica desde un estado menos activo a un estado más activo dentro de un rango estrecho de concentración de sustrato. El beneficio de este comportamiento se ilustra en la figura 10.11, que compara la cinética de Michaelis-Menten una enzima (curva azul) a la de una enzima alostérica (curva roja). En este ejemplo, la enzima Michaelis-Menten requiere un aumento de aproximadamente 27 veces en la concentración de sustrato para aumentar V0 de 0,1 Vmáx a 0,8 Vmáx. En contraste, la enzima alostérica requiere sólo alrededor de un aumento de 4 veces en la concentración de sustrato para alcanzar el mismo incremento en la velocidad. La actividad de las enzimas alostéricos es más sensible a los cambios en la concentración de sustrato que están cerca de KM que las enzimas de MichaelisMenten con la misma Vmáx. Esta sensibilidad se llama un efecto de umbral: por debajo de una cierta concentración de sustrato, hay poca actividad de la enzima. Sin embargo, después de que se haya alcanzado el umbral, la actividad enzimática aumenta rápidamente. En otras palabras, al igual que un "switch” onoff, la cooperatividad asegura que la mayor parte de la enzima es ya sea en on

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(estado R) o (estado T) Off. La gran mayoría de las enzimas alostéricos visualizan cinética sigmoidal. El aumento de la actividad de la ATCasa en respuesta al incremento de la concentración de ATP tiene 2 posibles explicaciones fisiológicas:  La primera, es que las elevadas concentraciones de ATP denotan una alta concentración de nucleótidos púricos en la célula; el aumento de la actividad de la ATCasa tendera a equilibrar los depósitos de purinas y de pirimidinas.  La segunda, una alta de concentración de ATP indica que en la célula existe suficiente energía almacenada para promover la síntesis de ARNm y la replicación del ADN, lo que conduce a la síntesis de Pirimidinas necesarias para estos procesos. La relación de la concentración de la enzima en el estado T para que este en el estado R se denomina la constante de alostérico (L). Para la mayoría de enzimas alostéricos, L es del orden de 102 a 103.

LAS ISOZIMAS APORTAN MODOS ESPECÍFICOS DE REGULACIÓN A LOS DIFERENTES TEJIDOS Y EN DISTINTAS FASES DEL DESARROLLO

LAS ISOZIMAS, son enzimas que difieren en sus secuencias de aminoácidos, pero que catalizan la misma reacción. (Diferentes Km y responde a diferentes moléculas reguladoras) La existencia de isozimas permite el ajuste fino del metabolismo para satisfacer las necesidades de un tejido o una etapa determinada del desarrollo. Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa (LDH), es una enzima que cataliza una etapa del metabolismo anaeróbico de la glucosa y de la sintesis de glucosa. Los humanos disponemos de dos cadenas polipeptídicas isoenzimáticas para esta enzima: la isozima H, que se expresa abundamente en el musculo cardiaco, y la isozima M, que lo hace en el musculo esqueletico. Sus secuencis aminoacidicas son identicas en un 75% . Mirar figura 10.16 en la guia

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LA MODIFICACIÓN COVALENTE ES UNA FORMA DE REGULAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La union covalente de una molécula a una enzima o proteina puede modificar su actividad. La mayoria de las modificaciones son reversibles. (La fosforilación y la desfosforilación, la union de grupos acetilos) Las enzimas que catalizan las acetilaciones (Acetiltransferasas) y desacetilaciones (desacilasas) estan sometidas a regulacion por fosforilación. Proteinas implicadas en la transducción de señales tales como Ras (una GTPasa) y Src (una proteina Quinasa) se unen a la cara de la membrana plasmatica que da con el citoplasma, gracias a la union irreversible de un grupo lipidico. Una vez fijadas allí, las proteinas tienen mas capacidad de recibir y transmitir información que circula a lo largo de las vias de señalización. Las mutaciones de estas proteinas se manifiestan en algunos casos de cáncer. La unión de una proteina pequeña, la ubiquitina, es la señal de que una proteina va a ser destruida, la ultima etapa de su regulación. La proteina Ciclica debe unirse a la ubiquitina (es decir “ubiquitinarse”) y ser destruida antes de que la célula entre en anafase y continue su ciclo celular.

LAS QUINASAS Y LAS FOSFATASAS CONTROLAN EL GRADO DE FOSFORILACIÓN DE LAS PROTEINAS

La fosforilación se emplea como un mecanismo de regulación Proteinas quinasas: enzimas que catalizan las reacciones de fosforilación. EL ATP, es el dador de grupos fosforilo más universal, su grupo fosforilo terminal (denominado y) se transfiere a un aminoácido específico de la proteina o enzima receptora.

EN EUCARIOTAS, el residuo aceptor siempre es uno de los 3 que contiene un grupo hidroxilo en su cadena lateral. La transferencia a residuos de Serina y Treonina la cataliza una clase de proteinas quinasas, mientras que a residuos de Drsebasboss

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Tirosina lo hace otra clase (las Tirosinas quinasas que son exclusivas de organismos pluricelulares, desempeñan un papel central en la regulacion del crecimiento y las mutaciones de estas enzimas, son habituales en células tumorales). En las reacciones de fosforilación de proteinas, los aceptores estan localizados en el interior celular donde abunda el ATP, (el dador de fosforilos). Las proteinas enteramente extracelulares no se regulan por fosforilación reversible. Las proteinas Quinasas especializadas, fosfrilan una unica proteina o unas pocas muy emparentadas.

La coagulación sanguínea se consigue mediante una cascada de activación de zimógenos Los seres humanos utilizan frecuentemente cascadas enzimáticas para obtener respuestas rápidas. La señal inicial establece una serie de pasos catalizados por una enzima. En cada paso la señal se amplifica activando un enzima que a su vez activa a otras 10 más y de esta forma se logra una gran amplific...