Citologia - Apuntes 6 PDF

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CITOLOGIA

Autor: CESOLARI, José Alberto Miguel

Material Extraído, Corregido y Aumentado de “HISTOKIT”. Autores: D’Ottavio, A.E; Bassan, N.D.; Cesolari, J.A.M.; Tellez, T.E.; 1994.

2 MEDIOS DE EXAMEN BIOLÓGICOS– MÉDICOS Microscopios Consideraciones Previas La visión es uno de los sentidos capitales de los seres vivientes. A su través, estos se adaptan al medio, relacionándose y defendiéndose. En una etapa posterior, interpretan su entorno y algunos, aun, lo modifican. En personas visualmente normales, el ojo tiene un límite en su capacidad de discriminación o separación de imágenes. Así, a una distancia de 2 metros podrá distinguir dos puntos separados, como mínimo, por 1.000.000 de Ángstrom (Aº) (ver dimensiones en el anexo). Esto constituye el límite de resolución (separación) del ojo humano. Por el contrario, una persona con incapacidad visual, no distingue, en las mismas circunstancias, ambos puntos como diferentes sino que los ve como un punto único indiscriminado El tallado de vidrios posibilitó tanto la corrección de defectos visuales (anteojos) como el acceso a una observación más detallada de varios objetos (lupas). Mas aun, el empleo de estos vidrios tallados (lentes) colocados superpuestos a lo largo de un soporte apropiado, posibilitó una nueva capacidad de visión lejana hasta el momento inaccesible. Así, el catalejo cambió las concepciones de la guerra cuando los desplazamientos de los vehículos de combate eran lentos y el telescopio aportó conceptos científicos que conmovieron profundamente las ideas de este tiempo. En suma, esta disposición de lentes superpuestas y enhebradas sobre el mismo eje óptico, a lo largo de un soporte o montura (sistema óptico centrado), permitió corregir, mejorar y aumentar la percepción del mundo visible. Otro sistema óptico centrado, dio acceso al mundo de las bacterias, las células, etc. Esto es, abrió al ojo las puertas de un mundo, hasta entonces invisible. Inicialmente rudimentario, el microscopio fue adquiriendo, a través del tiempo, perfeccionamientos sucesivos hasta llegar a la gama actual de las posibilidades que brinda cada tipo según las necesidades. MICROSCOPIO ÓPTICO (MO), de Luz, Fotónico o de Campo Claro En esencia, el microscopio es un sistema óptico centrado, porque representa una sucesión de lentes convergentes hilvanados sobre el mismo eje óptico a lo largo de un soporte o montura. Cada lente recoge y aumenta la imagen dada por la inmediata anterior; el conjunto permite la visualización aumentada y en detalle del objeto en estudio. La preparación con el objeto a estudiar se ubica sobre un soporte aplanado (platina) y debe ser iluminada convenientemente a partir de una fuente luz directa. Para eso, se

3 interpone entre ésta y el objeto, un sistema de lentes en la subplatina (el condensador) que recoge los haces de luz de la fuente y los concentra sobre el objeto. A esta acción de reunir, de condensar la mayor cantidad de rayos sobre lo visualizado, debe su nombre. Los haces que han atravesado el objeto ingresan, luego, al sistema de lentes próximo al mismo (objetivo). Cuanto mayor sea el número de ellos que penetran al objetivo (apertura numérica), mayor será la capacidad de éste, en particular, y del microscopio en general para ver como distintos dos puntos muy próximos entre sí. Esta capacidad o potencialidad del objetivo y del microscopio se designa poder de resolución del microscopio óptico. Pero en la determinación de este poder, no sólo juega la cantidad de rayos luminosos que ingresan al objetiva (vale decir, la apertura numérica) sino la calidad de los mismos (esto es, la longitud de onda). Así, el poder resolutivo (PR) del MO es directamente proporcional a la apertura numérica (AN) (a más rayos, mejor discriminación particular del objeto) e inversamente proporcional a la longitud de onda (LO) (a menor longitud de onda -color violeta- mejor PR y a mayor longitud de onda –color rojo- peor PR). En suma: PR =AN/LO (generalmente se toma la LO de la banda del verde amarilllo, 0,55 µm (micrómetros), por ser el ojo humano más sensible a los colores). Sin embargo, el poder de resolución es una capacidad o potencialidad. Se lo puede expresar como medida a través de su inversa: el límite de resolución, la mínima distancia a la que el MO distingue dos puntos próximos como distintos. Esa distancia es de 0,2 µm (2000 Aº). (200 nm). Se pueden rever estos conceptos diciendo que, a mayor poder resolutivo, menor tendrá que ser la distancia de separación de objetos próximos para percibirlos como distintos; o sea, menor tendrá que ser el límite de resolución. 1

Longitud de onda

LR = -------- x K = ----------------------------PR

x K

Apertura numérica

K = Constante estima en 0.61 Nótese que en la montura metálica del objetivo se hallan grabados dos números de tamaño relativamente considerable, separados por una barra. El primero de ellos (por ej. 10x – 40x) señala el aumento propio del objetivo, indicando las veces que aumenta lo que se observa (diez y cuarenta veces, respectivamente). Por su parte, el segundo número (por ej. 0,25 ó 1,10) señala su apertura numérica. Si el número es menor a 1 (0,25) ingresan menos de 100 rayos cada 100 que han atravesado el objeto y el objetivo trabaja al aire (objeto seco). Si el número es igual o ligeramente

4 superior a 1 significa que penetra la totalidad de rayos emitidos del objeto y se trata de un objetivo que debe operar con un líquido (objetivo húmedo o de inmersión). El líquido que se utiliza es el aceite de cedro. Hay que recalcar que aumento propio y apertura numérica, si bien son parte importante de una óptima visión microscópica, son distintos en sus resultados. El aumento está vinculado con el tamaño de la imagen final. La apertura numérica está relacionada con el poder y el límite de resolución e influye sobre la nitidez de discriminación. Superado el objetivo, los rayos lumínicos atraviesan otro sistema de lentes próximo al ojo (ocular) que aumenta, a manera de lupa, la imagen dada por el objetivo. El ocular esta compuesto por dos lentes: la inferior, de campo o colectora y la superior o frontal. El aumento final del MO resulta de multiplicar el aumento propio del objetivo (4x, 10x, ó 40x) por el del ocular (6x ó 10x), tomando como ejemplo los microscopios utilizados en trabajos prácticos. Así con objetivo 40x y ocular 10x, el aumento total será 400x (el objeto se verá 400 veces más grande que a simple vista). Los mejores microscopios ópticos pueden dar hasta 2000x. La utilidad del MO está dada porque puede trabajar con células vivas y muertas, con o sin coloración previa. Las partes mecánicas del MO son: pié, columna, subplatina, platina, revólver, tubo, tornillos macro y micrométricos. El pié o plano de apoyo del microscopio da sostén a la fuente de energía. De su parte posterior surge una elevación, el pilar, que se continúa hacia arriba por el brazo o limbo. Pilar y brazo constituyen la denominada columna; ésta porta los tornillos macro y micrométrico y sostiene el tubo. El tubo sustenta al revólver por su extremo inferior y al ocular por el superior. El revólver es el soporte de los objetivos y al rotar permite el cambio de los distintos aumentos. El tornillo macrométrico posibilita la realización de movimientos amplios del tubo o de la platina, permitiendo el enfoque grosero de la preparación. El tornillo micrométrico produce movimientos delicados del tubo o de la platina y da lugar al enfoque preciso o fino de la preparación. La platina es una superficie plana, perpendicular al eje óptico, perforada en su centro para el paso de los rayos luminosos procedentes del aparato de iluminación. Sobre ella se coloca la preparación a observar. Hay platinas fijas y platinas móviles. En las primeras, la preparación debe ser desplazada manualmente; en las móviles, el desplazamiento se logra girando unos tornillos que se encuentran en las mismas. La subplatina es el conjunto de piezas, situado debajo de la platina, destinado a servir de sostén al aparato de iluminación. Consta de portacondensador, aro y portafiltro y uno o

5 más diafragmas iris. Condensador, espejo, filtros y diafragmas iris, por su parte, integran el aparato de iluminación. El espejo, y en los modernos directamente una bombita eléctrica proyecta un haz de luz dirigido hacia el condensador. Variedades de microscopios fotónicos: Con el propósito de acceder a otro tipo de información no brindada por el microscopio de luz, se introdujeron modificaciones en la luz, antes de o durante su incidencia en el objeto o se registraron las variaciones en los rayos luminosos tras haber franqueado el objeto. Las principales variedades son:



Campo oscuro o ultramicroscopio:

Utiliza un condensador especial que bloquea los rayos que ingresan por el centro del condensador (da un campo oscuro) y refleja oblicuamente sobre el objeto, los que ingresan por la periferia haciendo brillar los objetos suspendidos en el campo oscuro (Fenómeno de Tyndall). Se lo emplea en Dermatosifilografía para visualizar en fresco (sin procesamiento alguno) el agente causal de la sífilis (treponema pallidum), extraído por hisopado de las presuntas lesiones sifilíticas. También es útil en el estudio de objetos transparentes pequeños, como lo quilomicrones (partículas de grasa en sangre) que son invisibles en un campo con iluminación brillante.



Fluorescencia:

Usa una fuente de energía que produce luz ultravioleta invisible, la que al impactar sobre determinados objetos sin colorear o sobre otros coloreados especialmente, genera una emisión de luz visible. Requiere empleo de lentes de cuarzo y se utiliza en histoquímica.



De luz ultravioleta:

Usa luz ultravioleta y registra la formación de la imagen sobre una película fotográfica. Se utiliza para localización de ácidos nucleicos.



Polarización:

Emplea una pieza en la subplatina que polariza la luz proveniente de la fuente y antes de su paso por el objeto. Polarizar significa que la luz que se emite en la fuente vibrando en todos los planos del espacio, queda vibrando sólo en uno de ellos al pasar

6 por el polarizador. Al franquear el objeto y (según la estructura de éste), la luz puede seguir vibrando en el plano que traía o cambiarlo. Esto es puesto de relieve por una pieza que analiza la presencia o no de esa desviación (analizador) y que se coloca en el ocular. La utilidad de este microscopio radica en que posibilita el estudio de componentes cristalinos y fibrosos (por ej.; tejidos óseo y muscular).



Contraste de fase:

Cuando los rayos luminosos atraviesan una preparación no coloreada, las longitudes de onda se retrasan diferencialmente por el índice de refracción variable de la trama tisular. Estas diferencias de fase o desfase, no visibles, se transforman por dispositivos especiales en diferencias de intensidad lumínica que sí resultan perceptibles. El microscopio de contraste de fase hace posible la visualización de células vivas (por ej.: espermatozoides en pruebas ginecológicas); vale decir provee información cualitativa.



Interferencia:

Basado en principios similares al de contraste de fase, con él es dable obtener datos cuanti-cualitativos. Así, puede empleárselo para determinar la masa por unidad de superficie del preparado y la masa de los elementos celulares individuales así como la cantidad de colorante unido a determinada estructura.



Barrido confocal:

Combina partes de un microscopio óptico, al que se adapta un equipo fluorescente, con un sistema de barrido a cargo de un rayo láser y una computadora asociada. Emplea cortes finos (1 um) y permite visualizar capa por capa el espécimen en todo su espesor a modo de un tomógrafo óptico. Las imágenes que brinda contienen todas sus partes en foco (confocal) a diferencia del microscopio óptico común que muestra algunas partes en foco y otras, no (no confocal). Posibilita la reconstrucción tridimensional de lo observado y, más aún, el análisis de tal reconstrucción en la orientación que se desee.

7 MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Microscopio electrónico de transmisión (MET) La búsqueda de un mejoramiento del poder de resolución llevó a reemplazar la luz visible por haces electrónicos, de muchísima menor longitud de onda (recordar la fórmula LR: LO/AN) y a efectuar modificaciones estructurales en el medio de examen para vencer las dificultades físicas que planteaba el uso de electrones. Así, los electrones (partículas con masa cargada negativamente) exigían: 

Una fuente de energía distinta: (la luz visible está formada por paquetes de energía sin masa –fotones-; aquí se necesitaban electrones). Se generaron en filamentos de tungsteno incandescente.



Alto vació en el tubo: que permitiera el desplazamiento de electrones sin frenarlos o desviarlos indeseablemente (como hubiera ocurrido de haber aire o vidrio en el trayecto).



Alto voltaje de trabajo: esto es un desnivel mayor en el polo de producción de electrones que en el impacto, que permitiera su corrimiento acelerado.



Portaobjetos especiales agujereados: para el paso de electrones por los agujeros. Son grillas (parrillitas) de cobre.



Lentes que no fuesen de vidrio y que pudiesen aprovechar la carga del electrón desviándolo a manera de condensador, objetivo y de ocular. Esto se logró con bobinas electromagnéticas.



Una pantalla fluoroscópica receptora: como la pantalla de televisión. El ojo no es sensible a los electrones. Puede reemplazarse no sólo por la pantalla fluoroscópica, sino por la placa fotográfica (ambas sensibles a aquéllos).

El microcopio electrónico descrito es el de transmisión que revela interiores (células muertas) y da imágenes en blanco y negro. Aumenta hasta 10.000.000 de veces (si se considera el aumento fotográfico). Su límite de resolución es de 4 Aº. Entre los MET, hay uno que trabaja con alto kilovoltaje y permite ver células vivas. Microscopio electrónico de barrido (MEB) Un microscopio electrónico complementario de los anteriores es el de barrido, reflexión o scanning (scan: barrer) (MEB) que dispara un haz finísimo de electrones sobre la superficie de un objeto, recorriéndolo en todos los sentidos. Da una imagen tridimensional en blanco y negro de la superficie (exterior) del objeto. Su límite de resolución es mayor que el del MET. Todos los microscopios electrónicos tienen aplicaciones diagnósticas en investigación y patología.

8

Pautas prácticas para el manejo microscópico: 

Colocar el objetivo (10x), afirmado en el tope y en el eje óptico.



Elevar la subplatina al máximo con diafragma abierto.



Ubicar la preparación en la platina, con cubreobjetos hacia el objetivo y pieza coloreada en el trayecto de la luz.



Acercar el objetivo a la preparación.



Con microscopio encendido, comenzar a descender la platina con el tornillo macrométrico hasta lograr el enfoque grueso.



Conseguir el enfoque fino (preciso) con el tornillo micrométrico.



Ajustar la iluminación descendiendo adecuadamente la subplatina (usar diafragma, eventualmente).



Recorrer sistemáticamente la preparación (“en guarda griega”).



Establecer los detalles para visualizar a mayor aumento con el propósito de ratificación o rectificación (verdadera utilidad del mayor aumento).



Ubicar el detalle en el centro del campo microscópico.



Girar el revólver, centrar en el eje óptico el objetivo 40x y afirmarlo en el tope.



Regular el enfoque con el tornillo micrométrico.



Centrar el detalle en el campo microscópico.



Ajustar la iluminación con subplatina (eventualmente, emplear el diafragma).

Consideraciones prácticas: Los diagnósticos histológicos presuntivos se realizan con el objetivo panorámico (10x), que da visiones globales del objeto a estudiar. El mayor aumento (40x) es un examen complementario para ratificar o rectificar presunciones sobre determinados detalles imprecisos a menor aumento, capaces de encaminar el diagnóstico hacia la certeza. Las dudas que generan necesidad de diagnósticos diferenciales surgen con el menor aumento y no siempre se solucionan con el mayor aumento.

9 ANEXO: Dimensiones biológicas y límites: Medidas del mundo visible: 

1 km (kilómetro)

= 1.000 mts (metros)



1m (metro)

= 1.000 mm (milímetros)



1 mm (milímetro)

= 1.000 um (micrómetros) (ex micra)

Medidas del mundo invisible: 

1 um (micrómetro)

= 1.000 nm (nanómetros) (ex milimicra)



1 nm (nanómetro)

= 10 Aº (angstron)



1 nm (nanómetro)

= 1.000 pm (picómetros) (ex micromicra)

Ejemplo: para convertir 0,2 micrómetros en nanómetros se debe multiplicar: 1.000 x 0.2 = 200 nm. Para convertirlo a su vez, en angstron se debe multiplicar la magnitud en nanómetros por 10 = 200 nm x 10 = 2.000 Aº. METODOS DE EXÁMEN MICROSCÓPICO Se denominan así al conjunto de procedimientos especiales a los que se somete el material en estudio (espécimen) para posibilitar su examen microscópico. El estudio de las estructuras celulares y tisulares puede ser inmediato, ya sea del organismo vivo o de partes aisladas del mismo que sobreviven cierto tiempo, o bien mediato o post mortem, de elementos que han sido muertos por la fijación y luego coloreados:





Inmediato: -

Sin cambios (estado fresco).

-

Con coloración vital: -

Intravital.

-

Supravital.

Mediato: post fijación y coloración.

Examen inmediato: 

Sin cambios (estado fresco): Esta técnica se basa en las diferencias del índice de refracción que presentan los elementos constitutivos de células y tejidos. Se utiliza para animales microscópicos, como protozoos, crustáceos, etc., y células descamadas de los epitelios de

10 revestimiento, ya sea de la boca, vías urinarias, epitelio vaginal, etc., suspendidas en medios líquidos apropiados. Coloración vital:



Entre la obtención y la visualización al MO no se utilizan reactivos de ningún tipo. Las técnicas de coloraciones vitales se basan en la propiedad funcional de determinadas células de incorporar ciertas sustancias coloreadas. Este hecho permite, al observar el material en estudio, detectar las células que han incorporado el colorante y diferenciarlas de las que no lo han hecho.

-

Intravital: En este tipo de técnica se utilizan colorantes vitales, es decir aquellas que requieren que las células que se desean estudiar estén vivas. Con el animal vivo, se le administra una sustancia que se distribuye por toda su economía y es captada por determinadas células. Luego se sacrifica el animal o se extrae el material a estudiar sin sacrificarlo, se obtiene y se observan los especimenes requeridos cuyas células se revelan indirectamente por el depósito del colorante. Son colorantes intravitales: el azul pirrol, el rojo neutro, la tinta china, etc.

-

Supravital: Se denomina así a la que se practica sobre células y tejidos separados del organismo al que pertenecen y que continúan vivos un tiempo variable, coloreándose en ese lapso. Un colorante utilizado para esta técnica es el verde jano B.

Examen Mediato, Post Fijación y Coloración: Son métodos que implican un conjunto de procesos a aplicarse sobre los tejidos o células con el objetivo de obtener preparaciones histológicas. Dentro ...