Compte rendu TP Microbiologie : Identification de souches bactériennes PDF

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Summary

Niveau 2e année de licence BBCP, semestre 4....

Description

BOFFY Léa ; PADOVANI Margaux

Groupe BC2

Travaux pratiques de Microbiologie I.

Int Intrrodu oductio ctio ction n

Lors de ce TP, nous réaliserons 4 expériences différentes connues de la microbiologie : Dans une première partie, nous chercherons à identifier des souches bactériennes à l’aide de deux types de coloration : la coloration de Gram et la coloration du bleu de méthylène. La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie. Ce procédé divise les bactéries en Gram positives (+) et en Gram négatives (-). Bien que plusieurs explications aient été données aux résultats de la réaction de coloration de Gram, il semble que la différence entre les bactéries Gram (+) et Gram (-) soient dues à la nature de leur paroi cellulaire. Nous allons donc lors de ce TP préparer 2 types de colorations (Coloration de Gram et coloration du bleu de méthylène) afin d’étudier la coloration de différentes souches bactériennes par observation au microscope optique. Nous allons nous intéresser dans une 2ème partie à l’étude du milieu mannitol fermentation nitrate. Ce milieu nous permettra d’étudier la fermentation du mannitol, la mobilité de la souche 4 ainsi que la recherche du nitrate réductase. La 3ème partie consistera en la recherche de la résistance aux antibiotiques (ampicilline et kanamycine) présente (ou non) chez certaines souches de bactéries. Nous nous pencherons ici sur les souches bactériennes 4 et C. Enfin, la dernière partie consistera en l’utilisation d’une galerie API 20e dans le but d’identifier les bactéries utilisées. En effet, API 20e est un système standardisé permettant d’identifier les bactéries (généralement les bacilles à Gram (-)). Cette galerie comporte 20 microtubes dans lesquels se trouvent des substrats déshydratés. Lors de la répartition d’une suspension bactérienne dans les tubes, des virages colorés et spontanés seront révélés lors de l’addition de réactifs. On fera ici 20 tests biochimiques.

II.

Mat atéri éri ériel el et m mét ét éthod hod hode e

Liste du matériel utilisé -

Bec bunsen - Eau distillée Ethanol/Acétone - Yaourt (Activia) Milieu mannitol mobilité nitrate - Pipette pasteur Colorants (bleau de méthylène, violet de gentiane, lugol, safranine) Micropipettes et embouts - Huile de paraffine Souches bactériennes (A, B, C, 4) Boîte de culture avec et sans antibiotiques (ampicilline et kanamycine)

Dès que possible, on travaille près de la flamme du Bec-bunsen pour rester en milieu stérile !

1. Pr Prép ép épar ar aratio atio ation n de dess co color lor loratio atio ations ns et id iden en entifi tifi tifica ca catio tio tion nd des es ssou ou ouches ches b bac ac acté té térie rie rienne nne nness Avant la coloration, il est impératif de bien laver les lames sur lesquelles seront déposées les différentes bactéries afin d’éliminer (aseptiser) tout contaminant extérieur. Les lavages se font toujours d’abord à l’eau distillée, puis ensuite à l’acétone. Faire chauffer les lames en les disposant à côté d’un bec bunsen permettra de les faire sécher correctement. Ensuite, à l’aide de l’embout d’une micropipette, on étale une gouttelette de culture de la souche bactérienne A ou de yaourt (pour le yaourt, on ajoute une goutte d’eau pour faciliter l’étalement, et on fait 2 lames) que l’on fera sécher à nouveau à côté du bec bunsen. Les bactéries sont ainsi prédisposées sur la lame. La fixation se fera ensuite par flambage après ajout d’un peu d’alcool sur la lame. La méthode étant dangereuse, le flambage est réalisé par l’enseignant! Les bactéries que l’on observe sont résistantes à la chaleur, le reste (qui n’est pas résistant) sera donc éliminé. On procède ensuite à la coloration de Gram pour la souche bactérienne A et les bactéries du yaourt. On commence par déposer la lame et verser quelques gouttes de violet de gentiane. Le violet de gentiane est un colorant qui va se fixer sur le peptidoglycane, un composant de la paroi des bactéries à Gram positif (+). Il ne se fixera donc pas sur les bactéries Gram moins (-). On laisse poser ce colorant durant 1 minute. Ensuite, on procède directement à l’application du lugol sur la lame, qui va permettre de fixer et de contraster le violet de gentiane. Les bactéries seront donc toutes colorées par le violet de gentiane, mais les bactéries Gram (-) perdront cette coloration lors du rinçage à l’alcool/acétone suivi du lavage à l’eau. En effet, la membrane des bactéries Gram (-) ne possède pas autant de peptidoglycane que les bactéries Gram (+) et donc l’alcool va pouvoir dissoudre les lipides de la membrane, d’où la disparition de la coloration. On terminera par l’ajout de la safranine, colorant qui va permettre la recoloration des bactéries Gram (-) uniquement. On effectue le dernier lavage : les lames sont prêtes à être observées ! Quant à la coloration de la deuxième lame de yaourt, on la réalise au bleu de méthylène.

Le bleu de méthylène est un colorant basique qui permet de colorer les bactéries non acido-alcoolo-résistantes.

2. Le m mili ili ilieu eu man annito nito nitoll m mob ob obilité ilité nitra itrate te Le but sera dans cette partie d’observer la mobilité des bactéries ainsi qu’observer la fermentation du mannitol. Dans le milieu mannitol-mobilité-réduite la teneur en agar est faible. L’agar est un gel servant principalement de milieu de culture pour les bactéries. Sa teneur étant faible, les bactéries mobiles pourront donc se déplacer dans le milieu mannitol, autour de la piqûre centrale. La fermentation du mannitol est observable grâce à un indicateur de pH : le rouge de phénol. Si le mannitol est utilisé, alors le milieu va passer du rouge au jaune par acidification. Cette acidification est produite par les bactéries aérobies strictes. Egalement, la présence de nitrate de potassium permettrait la recherche du nitrate réductase. Nous avons commencé par plonger une pipette pasteur fermée en ligne verticale dans l’axe du tube (piqûre centrale) dans lequel se trouve un milieu avec du mannitol, puis nous avons mis le tube à incuber pendant 24h à 37°C.

3. Re Recher cher cherche che des bac bactéri téri téries es ré résis sis sistan tan tantes tes aaux ux ant antibio ibio ibiotiq tiq tiques ues Nous avons possession de 2 souches bactériennes (4 et C) ainsi que 2 antibiotiques (Ampicilline et Kanamycine). Nous allons ici monter 4 types de cultures (nous avions des boîtes contenant comme antibiotique l’ampicilline) : 1) Culture de la souche 4 sans ampicilline (4-) 2) Culture de la souche 4 avec ampicilline (4+) 3) Culture de la souche C sans ampicilline (C-) 4) Culture de la souche C avec ampicilline (C+) L’autre groupe s’occupera de réaliser les mêmes cultures, mais avec comme antibiotique la kanamycine. 1) Culture de la souche 4 sans kanamycine (4-) 2) Culture de la souche 4 avec kanamycine (4+) 3) Culture de la souche C sans kanamycine (C-) 4) Culture de la souche C avec kanamycine (C+) Pour monter ces cultures, nous avons mit dans des boîtes de culture d’agar avec présence (ou non) d’antibiotique chacune. Nous avons ensuite déposé chaque souche dans chaque boîte à l’aide d’une micropipette, avec un simple « glissement »/étalement délicat de l’embout de la pipette afin de ne pas percer l’agar. Les boîtes de culture sont ensuite mises à incuber 24h à 37°C. Ces cultures nous permettrons de rechercher quelles bactéries sont résistantes et à quel antibiotique.

4. Id Ide entif ntifiica cation tion des ba bactér ctér ctériies en uti utilis lis lisant ant une galer alerie ie AP APII 220 0e Tout d’abord on commence par préparer la galerie : les substrats des 20 microtubes de la galerie étant déshydratés, on commence par répartir 5ml d’eau distillée dans les alvéoles afin d’humidifier le milieu et de le placer dans sa boîte d’incubation. Ensuite, on prépare l’inoculum. L’inoculum est un échantillon qui contient des germes vivants que l’on introduit dans un milieu favorable en vue de son identification. On le prélève à l’aide d’une pipette, puis on homogénéise les bactéries dans le milieu pour réaliser la suspension bactérienne. On inocule alors la galerie : la suspension bactérienne est introduite dans les 20 microtubes de la manière suivante :  

Tests CIT, VP et GEL : tube ET cupule Le reste : tube

On procède délicatement, la pipette légèrement sur le côté de la cupule ainsi que la boîte doucement inclinée. On créé une anaérobiose dans certains tests (ADH, LDC, ODC, H2S, URE). Pour cela, on remplit les cupules d’huile de paraffine. Les bactéries seront donc dans un milieu en absence d’oxygène. La boîte d’incubation est ensuite fermée et placée en incubation durant 24h à 37°C.

III.

Rés Résultats ultats 1. Pr Prépa épa éparatio ratio ration n de dess co collora orations tions et id identifi entifi entificatio catio cation n des sou souche che chess ba bacté cté ctérienn rienn riennes es

Souche bactérienne A (Coloration de Gram)

Les bactéries observées dans la souche A sont de couleur rose/rouge due à la safranine. Ce sont donc des bactéries Gram (-). Elles ont donc sur leur paroi un peptidoglycane mince et peu ponté.

Bactéries du yaourt (Coloration de Gram) Lactobacillus bulgarius Streptococcus thermophilus

Les bactéries observées dans le yaourt sont et Streptococcus thermophilus. Elles présentent une coloration violette due à la coloration au violet de gentiane, ce sont donc des bactéries Gram (+).

Bactéries du yaourt (Coloration au bleu de méthylène)

Lame colorée au bleu de méthylène Sur cette lame, nous avons pu observer les 2 types de bactéries lactiques Gram (+) :  Lactobacillus bulgarius : bactérie de forme bacille, en forme de court bâtonnet  Streptococcus thermophilus : bactérie ayant pour caractéristique de longues chaînes de coques se formant quand les cellules restent attachées après plusieurs divisions. On lui confère une forme de « chenille ». Observation microscopique des bactéries du yaourt, colorées au bleu de méthylène

Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgarius

2. Le m milieu ilieu man mannito nito nitoll m mob ob obilité ilité nit nitrate rate

Culture de bactérie autour de la piqûre centrale « Bulle » Milieu mannitol mobilité nitrate après incubation On observe ici que la culture ne s’est faite que légèrement, et uniquement autour de la piqûre centrale. On estime donc que les bactéries ne se sont pas déplacées dans le milieu (sinon la culture se serait diffusée dans tout le tube). Après 24h d’incubation et dans ces conditions, on observe peu de mobilité des bactéries de la souche 4. Concernant la fermentation du mannitol, nous observons une couleur rouge : c’est le rouge de phénol. Il n’a pas viré au jaune. Il n’y a donc pas eu d’acidification dans le milieu mannitol : les bactéries ne fermentent pas le milieu. Dans le fond du tube, on observe une petite bulle. La présence de nitrate pourrait expliquer la présence de cette bulle : il y’a une respiration nitrate. Il y a dans ce tube des bactéries aérobies strictes.

3. Re Recher cher cherche che des bac bactéri téri téries es ré résis sis sistan tan tantes tes aaux ux ant antibio ibio ibiotiq tiq tiques ues Après l’incubation de 24h à 37°C, nous avons récupéré nos boîtes de culture et les avons comparé à celles de l’autre groupe. Souches 4 et C confrontées (ou non) à l’ampicilline (Notre groupe)

Souches 4 et C confrontées (ou non) à la kanamycine (L’autre groupe)

Résultats des cultures des souches 4 et C en présence (ou non) d’ampicilline  Souche 4 sans ampicilline (4-) : On remarque la présence d’une culture de bactéries. Les bactéries de la souche 4 sont donc en vie et se sont multipliées. Sans ampicilline, les bactéries de la souche 4 se multiplient, il y a culture.  Souche 4 avec ampicilline (4+) : Il n’y a pas de culture de bactéries de la souche 4. En présence de l’ampicilline, les bactéries de la souche 4 meurent.  Souche C sans ampicilline (C-) : Présence d’une culture de bactéries. Sans ampicilline, les bactéries de la souche C restent en vie et se multiplient.  Souche C avec ampicilline (C+) : Il n’y a pas de culture de bactérie. En présence d’ampicilline, les bactéries de la souche C meurent, il n’y aura pas de culture possible. Résultats des cultures des souches 4 et C en présence (ou non) de kanamycine  Souche 4 sans kanamycine (4-) : On remarque la présence d’une culture de bactéries. Les bactéries de la souche 4 sont donc en vie et se sont multipliées. Sans kanamycine, les bactéries de la souche 4 se multiplient, il y a culture.  Souche 4 avec kanamycine (4+) : Il n’y a pas de culture de bactéries de la souche 4. En présence de kanamycine, les bactéries de la souche 4 meurent.  Souche C sans kanamycine (C-) : Présence d’une culture de bactéries. Sans kanamycine, les bactéries de la souche C restent en vie et se multiplient.  Souche C avec kanamycine (C+) : Etonnamment, on observe ici une culture de bactéries ! La kanamycine n’a pas été efficace ici, malgré la présence de l’antibiotique les bactéries se sont proliférées.

4. Id Ide entif ntifiica cation tion des ba bactér ctér ctériies en uti utilis lis lisant ant une Ga Galerie lerie API 20e Résultat de la galerie après incubation 24h à 37°C :

Pour chaque tube, on explique ici quelles sont les enzymes qui agissent, les conditions ainsi que les réactions engendrées :

ONPG

Enzyme/ Réaction testée Β-galactosidase

ADH

Arginine dihydrolase

Orthonitrophén yl β-D-galactosid e Arginine

LDC

Lysine decarboxylase

Lysine

ODC

Ornithine decarboxylase

Ornithine

CIT

Utilisation du citrate

Citrate

H 2S

Production d’ H2S

Na thiosulfate

URE

Urée hydrolase

Urée

TDA

Desaminase

Tryptophane

IND

Production d’indole

Tryptophane

VPNa pyruvate (VP) GEL

Décoloration

Production d’acétone

Gelatinase

Gélatine au charbon

Tube

Substrat

Réaction La Β-galactosidase hydrolyse l’ONPG : le produit incolore vire au jaune. Ici c’est le cas le test est positif l’échantillon a bien viré au jaune. Dégradation de l’arginine en libèrant de l’ammoniac en milieu basique Libère le groupement carboxyle (COO- ) de la lysine Catalyse la décarboxylation de l’Ornithine pour former de la Putrescine Certains milieu de culture utilisent le citrate comme source de Carbone Cette synthèse se fait dans un milieu contenant du Na thiosulfate l’H2S est produit par les bactéries à partir de thiosulfate. Si acidification alors le culot est jaune, en absence d’acidification le culot est rouge voir noir. Ici le test est négatif car le culot est jaune. Catalyse l’hydrolysation de l’urée en ammoniac et en dioxyde de Carbone par les uréases Catalyse la libèration du groupement amine du Tryptophane production d’acide indole-pyruvique et d’ammonium à partir du Trp grâce à la réaction précédente. La couleur vire au jaune à l’ajout de VIP 1 incolore et VIP2 de couleur brune. Cette enzyme hydrolyse la gélatine et détruit le disque pour libérer des particules de charbon dans le milieu liquide qui se teinte en noir.

Condition Aérobie

Anaérobie Anaérobie Anaérobie Aérobie Anaérobie

Anaérobie Aérobie Aérobie

Aérobie Aérobie

GLU

Fermentation/oxydation

Glucose

MAN

Fermentation/oxydation

Mannitol

INO

Fermentation/oxydation

Inositol

SOR

Fermentation/oxydation

Sorbitol

RHA

Fermentation/oxydation

Rhamnose

SAC

Fermentation/oxydation

Sucrose (= saccharose)

MEL

Fermentation/oxydation

Melibiose

AMY

Fermentation/oxydation

Amygdalin

ARA

Fermentation/oxydation

Arabinose

La fermentation correspond à une oxydation incomplète du glucose production de molécules riches en énergie. Des bactéries fermentent le mannitol dans leur métabolisme énergétique sur un milieu semi-synthètique qui vire au jaune car il y a une acidification du milieu. L’inositol fermente piur produire des produits acides le virage au jaune est indicateur de l’acidification ici ce n’est pas le cas le test s’avère négatif et l’échantillon reste bleu. Des microorganismes fermentent le sorbitol et l’utilisent comme source de Carbone un changement de couleur indique une acidification, c’est le cas test positif l’échantillon vire au jaune. Le produit final de cette fermentation est acide le mélange tourne dans notre cas au jaune, ce qui signifie qu’il y a acidification le test est positif. Il y a une fermentation alcoolique du sucrose qui correspond à son oxydation incomplète, cette réaction libère de l’énergie. Le produit final de cette fermentation est acide, le test dans ce cas est positif et la couleur jaune du produit correspond bien à une acidification. Le but de l’étude de cette fermentation est d’identifier des bactéries acides du lait Les microbes fermentent l’arabinose et s’en servent comme source de carbone. Un changement de coloration (virage au jaune) indique une acidification ici le test est positif l’échantillon a bien viré au jaune le produit de réaction est donc bien acide.

Après l’incubation de la galerie, on peut procéder au test d’identification.

Test d’indentification Biomérieux :

Anaérobie Anaérobie

Anaérobie

Anaérobie

Anaérobie

Anaérobie

Anaérobie

Anaérobie Anaérobie

Le test d’identification se fait par calcul. Les tests sont groupés par 3 successivement. Les tests négatifs sont toujours codés 0 tandis que les tests positifs sont codés 1 pour le premier test du triplet, 2 pour le deuxième et 4 pour le troisième. Les 3 résultats du triplet sont ensuite additionnés pour former un code d’au moins 7 chiffres (ici 5, 1, 4, 5, 5, 7 et 2) qui correspond au profil biochimique du microorganisme que l’on étudie. Un tableau d’identification nous a été remis pour trouver le nom du microorganisme étudié. Cependant, nous ne trouvons pas le profil correspondant à nos numéros : soit notre code a été faussé par quelques imprécisions de manipulation, soit le profil du microorganisme n’est pas présent dans le tableau de correspondance. Nous devrions normalement trouver un bacille Gram négatif. Nous nous sommes donc aidées du site https://lab.upbm.org/identifieur/galerie.php :

D’après ce site et les résultats de notre identification, le microorganisme que nous avons étudié n’est autre que Serratia odorifera. Elle est bien une bactérie à Gram négatif, nous pensons donc qu’il s’agit de la bonne bactérie.

IV.

Con onclus clus clusion ion

Ce TP nous a permit de découvrir différentes méthodes efficaces et simples (mais dans lesquelles une certaine minutie est nécessaire) pour observer et déterminer la nature de bactéries présentent dans un milieu. L’identification de souches bactériennes par les colorations de Gram et du bleu de méthylène sont efficaces. La coloration de Gram nous permet facilement de déterminer si les bactéries observées sont Gram (-) (elles abordent une coloration rose) ou Gram (+) (qui abordent une coloration bleue-violette). Les bactéries de la souche A sont Gram(-) et les bactéries du yaourt Gram (+). Quant au bleu de méthylène, il nous a permit de voir que les bactéries provenant du yaourt sont acido-alcoolo-résistantes. L’étude du milieu mannitol-mobilité-nitrate, lui, nous a permit de voir que les bactéries de la souche 4 ne fermentent pas le milieu car elles sont peu mobiles dans les conditions testées. Ce sont des bactéries ...