Conteo de Bacterias Mesófilas Aerobias PDF

Preview

Summary

Práctica desarrollada en el laboratorio de microbiología de la Universidad del Valle de México basada en el manual de prácticas proporcionado por el profesor....

Description

CONTEO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS INTRODUCCIÓN Un conteo bacteriano consiste en determinar el número de bacterias que se hacen visibles como colonias, ya sea encima o debajo de la superficie del agar después de una incubación aerobia a 30ºC durante 24 horas. Un tipo de conteo de gran importancia es el de Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA), pues éstas se desarrollan a temperatura ambiente (25-30 °C) y por lo tanto pueden estar presentes en los alimentos. En esta práctica se llevaron a cabo dos técnicas, la de vertido de placa y Miles-Misra. La primera consiste en verter 1 ml de la dilución correspondiente (10 -7, 10-8 y 10-9) en una caja Petri para posteriormente añadir el agar. Esta preparación se debe mezclar con movimientos suaves sobre la mesa. En el método de Miles-Misra, la caja se dividió en tres partes (una para cada dilución: 10 -7, 10-8 y 10-9) añadiendo 3 gotas de 20 μL c/u a cada sección. La exactitud de los métodos depende de los cuidados que se tengan durante la preparación de las diluciones, el agar y de las cajas. En todo momento se debe aplicar la técnica aséptica y utilizar material estéril; se deben homogeneizar correctamente las diluciones y etiquetar tanto los tubos como las cajas y pipetas. También se recomienda cuidar la temperatura del agar para evitar daños a las células y obtener una distribución uniforme en el medio. Las BMA son consideradas indicadores “pobres” de la seguridad en la mayoría de los casos, ya que no se correlacionan directamente con la presencia de patógenos o toxinas. Un resultado bajo de BMA no significa que el producto o ingrediente esté libre de patógenos. Sin embargo, cuando los alimentos contienen un gran número de microorganismos (aún cuando éstos no sean patógenos) se convierten en inadecuados para el consumo. El recuento de BMA puede utilizarse para medir la calidad sanitaria y las prácticas de fabricación, además de proporcionar información acerca de la vida útil del producto.

OBJETIVOS 

Efectuar el recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA) de una muestra utilizando el método de vertido en placa y el de Miles-Misra



Comparar

los

resultados

obtenidos

por

diferentes

métodos

de

cuantificación METODOLOGÍA a) Material y equipo Mechero

Plato caliente

7 cajas petri

Propipeta

10 pipetas de 1 ml

Gradilla

16 tubos con rosca de 15x100

Micropipeta 100 μL

vaso de precipitados de 250 ml

Puntas

b) Reactivos y soluciones Agar estándar

Solución salina 0.85%

c) Procedimiento 1. Preparación de las diluciones:

9 mL de solución salina en los tubos; esterilizar

Preparar y esterilizar medio de cultivo (se mantiene a

De las diluciones 10-4 a 10-6 verter un mililitro en seis cajas

Rotular 10-1 a 10-6; la dilución 100 es el tubo con el cultivo.

Añadir en cada caja de 15 a 20 mL de agar cuenta

Se toma 1 mL de la dilución 100 y se pasa al tubo 10-1

Mover la caja: 1. En el sentido de las manecillas del reloj, 2. Al contrario de las

Se repite el procedimiento pasando 1 mL del 10-1 al 10-2 y así sucesivamente, pasando la micropipeta por una solución de hipoclorito de sodio y agitando cada tubo después de cada dilución

Dejar solidificar medio, invertir caja e incubar a 30°C 24

Verticalmente y 4. Lateralmente

dilución)

Hacer conteo en cajas con 30 - 300 UFCs y realizar los cálculos correspondient es.

2. Método de vaciado en placa

3. Método de Miles – Misra

Dividir cajas en 3 partes iguales, marcarlas (10-4 a 10-6)

Colocar 20 microlitros de la dilución correspondiente, en total se colocan 3 gotas. Dejar que se absorba en el medio.

Invertir caja e incubar, contar gotas con entre 20 y 50 colonias desarrolladas, calcular núero de UFC por mL de muestra.

Nota: Las diluciones que se utilizaron fueron reemplazadas por 10-7 a 10-9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla de # de colonias por cajas y por método Dilución 10-7 10-8

Método vaciado en placa 1 2 330 315 278* 228*

Método Miles-Misra 176 51

7

10-9

114*

46*

*Cajas seleccionadas: en vaciado en placa aquellas con colonias entre 30-300, para Miles- Misra las que tengan entre 20-50 colonias

Cálculo de UFC/ml Método vaciado en placa



10-9

UFC/ml= (114)(109)/1ml= 2.3x1012 

10-8

 Cuando dos cajas de la misma disolución entran en el rango se promedian (278+228)/2= 253 UFC/ml=(253)(108)/1ml= 2.53x1010 

10-7 Ninguna caja entró en el rango

Método Miles-Misra 

10-9 UFC/ml= (46)(109)/0.02ml= 2.3x1012



10-8 Ningún espacio entró en el rango



10-7 Ningún espacio entró en el rango

Miles-Misra Vaciado en placa

De acuerdo con la bibliografía para la cuantificación de UFC por el método de vaciado en placa se deben escoger aquellas cajas que alcancen entre 30-300 colonias, las que contengan un número mayor o menor se deben descartar. El rango que se debe seguir para el método de Miles-Misra debe ser de 20-50 colonias por espacio. (Ramos, 2010) Según nuestros resultados ninguna de las cajas 10 7 entraba en los rangos mencionados, por lo que las descartamos, para Miles-Misra también se descartó el espacio 108 porque tampoco cumplió ningún rango. Es útil realizar cajas por duplicado para disminuir el riesgo de error, pero también se toma en cuenta que si ambas cajas cumplen con el rango deseado, se hará un promedio de ambas y con este se realizara el cálculo para las UFC. (Camacho, 2009) La muestra utilizada fue Listeria innocua, esta es un bacilo Gram- positivo que puede vivir en pH extremos, grandes concentraciones de sal y diversas temperaturas (30°-37°C optima), esta es de gran importancia ya que al igual que L. monocytogenes se encuentra en los alimentos, pero a diferencia de esta , L. innocua no es patógena y al contrario diversos estudios han descubierto que tiene actividad inhibitoria contra L. monocytogenes (Banadas, 2007) CONCLUSIONES El tener en cuenta el número de UFCs para proceder a realizar los cálculos es importante porque disminuye el error que se pueda obtener al realizar los cálculos, además, el seguir esta “regla” garantiza que las colonias están

verdaderamente aisladas, que se pueden contar y que por consiguiente no hubo contaminación de otros agentes microbiológicos o que no se dejó incubar por un periodo de tiempo más largo de lo que debió haberse incubado. El método de vaciado en placa se realizó exitosamente, obteniendo UFCs aisladas y contables, no obstante, al utilizar el método de Miles Misra, las colonias que se contaron, y después de haber realizado los cálculos, se determinó que las UFCs no entraron en el rango que se había propuesto para que se consideren como resultados significativos. Con esto, se determinó entonces, que el método de vaciado en placa fue más eficiente. BIBLIOGRAFÍA Murray Brown Laboratories. Aerobic Plate Count [serie de internet] 2017 [consultado 2017 septiembre 28] Disponible en: http://mb-labs.com/resources/aerobic-plate-count/ Universidad de Murcia. Significado y características de los microorganismos marcadores [serie de internet] 2010 [consultado 2017 septiembre 28] Disponible en: http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas1/practica-1-significado-y-caracteristicas-de-los/skinless_view

Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B, Velázquez O. Cuenta en placa de bacterias [serie de internet] 2009 [consultado 2017 septiembre 14] Disponible en: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf

Ramos, M. (2010). MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL. 01.10.2017, de Universidad Autónoma MetropolitanaIztapalapa Sitio web: http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/crl/Microbiologia/16P/Manual_Micro-16P.pd Bae, E., Banada, P., Bhunia, A., Bayraktar, B., Guo, S., Hirleman, E., Rajwa, B., and Robinson, J. “Optical forward-scattering for detection of Listeria monocytogenes and other Listeria species”. Biosensors and Bioelectronics. 2007. Volume 22. p. 1644-71....