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Cours TP Génétique microbienne...

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Cours TP Génétique bactérienne Convention de génétique bactérienne Rappel : on écrit le genre des bactéries en italique. Notion d’un gène : 3 lettres minuscule pour le « mnemonic » et une lettre en majuscule donnée par les auteurs, écriture italique (ou soulignée). Signes + ou – pour les allèles sauvages ou mutés en exposant. Notation des génotypes, protéines et phénotypes :

Remarques : - Ici, pour le phénotype, on peut écrire Met ou MetB. - Si Met est muté dans le gène MetB, on écrit Met-. - Parfois, le gène et la protéine n’ont pas le même nom. Exemple du gène rpsL qui code la protéine S12 (on ne dit pas code pour mais code), une mutation dans rpsL conduit à un phénotype de résistance à la streptomycine. On indique donc le phénotype par Strr. Conventions en absence de signe :

Lorsque rien n’est indiqué, il s’agit d’une mutation, ici proC signifie proC -. Le numéro 410 signifie que c’est la 410ème mutation dans le gène proC. Symboles :

Delta signifie délétion, on a enlevé une partie d’ADN génomique. Exemple delta lacZ= le gène lacZ a été délété. On peut donner un numéro à ses délétions, avec un premier gène xxx et un second yyy entre parenthèse. Cela signifie qu’il y a une délétion du génome entre le gène xxx et yyy. Comme pour l’exemple d’avant, autrefois on ne savait pas localiser les délétions, on donnait donc des numéros. Phi signifie fusion, regarder l’exemple.

Insertion de transposon ou « cassette » :

La notation deux fois deux points « :: » entre deux gènes ou deux marqueurs. Ici, cela signifie que l’on a une insertion du transposon Tn10 dans le gène proC.

Analyse de phénotypes sur milieux gélosés Milieux disponibles : Milieux riches : Contiennent diverses sources de carbone, tous les AA, vitamines, bases, sauf la thymine (= vitamine B1). Pas de supplémentation nécessaire, exemple : LB. Milieux minimum : Contiennent sels, vitamines B1. A supplémenter obligatoirement avec une source de carbone, si nécessaire avec des acides aminés, bases, précurseurs du métabolisme, exemple : M63.

Dans l’ensemble des ses milieux, on peut rajouter des antibiotiques ou des indicateurs colorés. Principaux test de phénotypes sur milieux gélosés : Test auxotrophie : test de n auxotrophie sur n+1 milieux minimum supplémentés. Exemple : souche Pro- Met – sur M63G Pro (-), M63G Met (-) et M63G Pro Met (+) (avec du glucose pour le carbone). 2 auxotrophie donc 3 milieux, les parenthèses signifient que la souche se développe ou non sur ce milieu. Auxotrophie : incapacité d’un organisme vivant de synthétiser un composé organique nécessaire à son développement, se teste sur milieu minimum. Test d’assimilation d’une source de carbone : - milieu minimum (=> milieu de sélection : croissance des seules cellules de phénotype voulu). Exemple : souche arabinose -, on utilise un milieu minimum avec du glucose et un autre avec de l’arabinose comme source de carbone. - milieu riche plus indicateur(s) coloré(s) (=> milieu d’identification : croissance de toutes les cellules). Test de résistance à un antibiotique : Milieu riche avec antibiotique.

Exemple de milieux riches avec indicateur coloré, test du catabolisme de sucre chez les entérobactéries car McConkey avec des sels biliaires (inhibition des bactéries non entériques) et du cristal violet (inhibition des cocci à Gram (+)) est un milieu sélectif exclusif aux entérobactéries. Dans ce milieu riche, on rajoute du sucre en excès (ici le lactose). Si elle est Lac+, la bactérie va pouvoir utiliser ce sucre en excès, grande fermentation, le pH va donc baisser, le colorant (rouge neutre) précipiter et donner cette couleur rouge/violette aux colonies. L’avantage de ce milieu, c’est le fait de pouvoir rajouter le sucre que l’on veut. On peut donc tester d’autres catabolismes si on le souhaite. L’objectif du TP de génétique procaryote est la recherche et la sélection de mutants d’E. Coli déficients pour l’utilisation du lactose comme source de carbone. L’opéron lactose d’E. Coli :

L’opéron contient 3 gènes : lacZ, lacY et lacA (pas de grande importance pour le phénotype lac). LacZ code la Betagalactosidase, cette dernière est capable de dégrader le lactose en glucose + galactose. Pour cela il est nécessaire qu’une perméase soit produite, celle-ci est lacY. Cette perméase, quand elle est produite, permet l’entrée du lactose qui va ensuite être dégradé puis le glucose va entrer dans la glycolyse etc… L’expression de la production de LacZ et de LacY est fortement régulée, la régulation principale de cet opéron a lieu au niveau transcriptionnel. Légèrement en amont de l’opéron se trouve lacI qui code un répresseur transcriptionnel. Ce répresseur va se fixer à un site au niveau de l’ADN qui s’appelle lacO, se situant juste à côté des régions -10 -35 qui sont les zones de fixation de l’ARN polymérase. En se fixant, LacI réprime l’initiation de la transcription ; l’ARNm ne peut donc pas être synthétisé. Vidéo opéron lactose : Opéron : plusieurs gènes dont l’expression est régulée par un seul et même promoteur. Opéron lactose : permet à la bactérie d’utiliser le lactose comme source d’énergie. Dans son état normal il est réprimé car la bactérie utilise préférentiellement le glucose. Il n’est actif qu’en absence de glucose et présence de lactose dans le milieu.

I. Structure de l’opéron lactose

Un opéron contient : un promoteur et un opérateur qui régulent plusieurs gènes structuraux ; il existe aussi des gènes régulateurs. Les gènes Z, Y et A codent pour 3 enzymes permettant à la bactérie de transporter et métaboliser le lactose. Le promoteur P et l’opérateur O interviennent dans la régulation de l’expression des gènes Z, Y et A. Le gène I code pour un répresseur qui maintient l’opéron lactose à l’état réprimé en présence de glucose. II. Régulation de l’opéron lactose 1. Etat réprimé En présence de glucose, les gènes Z, Y et A ne sont pas exprimés. Le gène I est actif, donc première étape de transcription, une seconde de traduction pour fabriquer une protéine : le répresseur. Cette protéine va se fixer sur l’opérateur et cela va bloquer la transcription des gènes Z, Y et A donc pas de transcription. 2. Etat induit En absence de glucose et en présence de lactose, le lactose va se lier au répresseur et l’inactiver. Le répresseur ne peut plus se fixer sur l’opérateur. Les gènes Z, Y et A sont exprimés. III. Mutants constitutifs Chez ces mutants constitutifs, l’opéron est toujours induit donc les protéines Z, Y et A sont synthétisées de manière constitutive. 1. Répresseur inactif (récessif) La mutation se trouve dans le gène régulateur I, le répresseur n’est plus synthétisé. La mutation est donc récessive car si l’autre allèle n’est pas muté, le répresseur peut toujours être synthétisé. 2. Site opérateur inactif (dominant en cis) La mutation se situe sur l’opérateur O : le répresseur ne peut plus se lier à l’opérateur pour réprimer l’opéron. Cette mutation est dominante car on ne peut pas la compenser. Le contrôle de l’opéron lactose :

Ceci est un résumé, qui permet de comprendre que la bactérie ne va synthétiser l’ARNm correspondant à l’opéron lactose que lorsque l’on a du lactose en milieu de culture. En effet, le glucose est le sucre le plus simple qui existe, les bactéries préfèrent dégrader le sucre le plus simple plutôt qu’un sucre plus complexe. Un milieu riche + X-gal + IPTG permet d’identifier des colonies LacZ + et LacZ - :

Le milieu LB supplémenté en X-gal et en IPTG permet de différencier sur boîte les colonies qui sont LacZ- et LacZ+. X-gal est un analogue du lactose qui est au départ non coloré et non inducteur (ne se fixe pas à LacI). En présence de Beta-galactosidase, il est dégradé en 5-bromo-4-chloro-3 indolyl-indogo (pas à apprendre le nom qui est de couleur indigo et insoluble qui permet donc de colorer les colonies. Les colonies blanches sont par conséquent LacZdonc Lac- car incapables de cataboliser le lactose. L’IPTG est aussi un analogue du lactose, il est inducteur mais ne peut pas être dégradé. Remarque : X-gal et IPTG n’ont pas besoin de la perméase pour rentrer dans la bactérie ! Donc une bactérie peutêtre LacZ+ mais peut ne pas être Lac+ car LacY-.

Mélibiose comme seule source de carbone dans un milieu minimum (avec IPTG) : Comment savoir si une bactérie est LacY+ ou LacY- ? Le transport du mélibiose : deux perméases impliquées : - Une perméase spécifique active uniquement à basse température (environ 30°C) - La perméase LacY (tout le temps produite)

Si le phénotype d’une bactérie est LacY-, le mélibiose ne pourra pas rentrer dans la bactérie. On utilise donc deux boîtes pour savoir si la bactérie est LacY+ ou LacY- : - Une boîte M63 + mélibiose + IPTG qu’on place à 30°C - La même boîte mais à 42°C cette fois-ci On compare alors les croissances des deux boîtes. Sélection possible des souches de phénotypes LacY+ par croissance sur milieu minimum + mélibiose à 42°C.

Génétique fonctionnelle bactérienne 2 stratégies :

A. Identifier le(s) gène(s) codant une fonction B. Identifier la fonction codée par un gène

Identifier les gènes codant une fonction particulière : stratégie 1) Mutagenèse aléatoire 2) Sélection ou/et identification 3) Localisation du(es) gènes responsables 4) Vérification que la mutation localisée est responsable du phénotype  Complémentation fonctionnelle

1) Objectif : obtenir des mutants Mutation spontanée : Chez E. coli, fréquence de 10-7 à 10-9 suivant les gènes (hotspots, efficacité du système de réparation…) - Mutation ponctuelle (erreur durant la réplication due à des mésappariements causés par des déaminations spontanées ou à la tautomérisation) - Délétion - Insertion Mutagenèse : Augmentation du taux de mutations, cible l’ADN de la cellule (chromosome, plasmides).

Mutagenèse aléatoire : Altération chimique : ne pas les apprendre par cœur  Formation de dimères de pyrimidine (UV)  Déamination (acide nitrique)  Oxydation (H2O2, radicaux superoxyde, hydroxyde) Incorporation de 8-oxo-guanine s’appariant avec l’adénine

Alkylation (Nitrosoguanidine (NTG), …) Alkylation en O6 de la guanine s’appariant alors avec la thymine

 Incorporation d’analogues de bases (4-bromo-uracyl, 2-aminopurine)  Agents intercalants (Bromure d’éthidium, acridine orange) En conditions normales, réparation par des systèmes spécifiques adaptative, etc …)

Insertion :  Séquence transposables (Transposons, cassette) 2) Sélection ou/et identification : Pression de sélection – Identification :

(photolyase, N-glycosylase et AP-endonucléase, système GO, réponse

Taux de mutations variable (1% à 1.10-6 pour la mutagenèse aléatoire) Attention : Taux de mutation corrélé à la mortalité et au taux de mutations multiples ! Dans tous les cas prévoir une stratégie de sélection ou d’identification des mutations : besoin d’un phénotype sélectionnable ou identifiable.

Comment faire une mutagenèse par transposition dans un génome bactérien ? La transposition (à ADN) : 

Mouvement d’un élément génétique mobile d’un endroit à un autre du génome, catalysé par une enzyme appelée transposase.



Les extrémités de l’élément génétique mobile sont le plus souvent répétés et inversés (IR). Leur séquence est reconnue pat la transposase qui s’y fixe.



Un élément génétique mobile ne codant que des gènes impliqués dans sa transposition est appelé séquence d’insertion (IS).



Un élément génétique mobile codant à la fois des gènes impliqués dans sa transposition mais aussi des gènes accessoires (résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds …) est appelé transposon (Tn).



Les IS ont donc une taille plus petite que les transposons (1 à 1,5 kb de longueur pour IS). Les transposons peuvent faire plusieurs kb en revanche.

Organisation génétique d’un des premiers transposons découvert : Tn10 ; qui contient des gènes accessoires codant la résistance à l’antibiotique tétracycline.

La transposition « couper-coller » :

La transposase est produite, chaque monomère se forme à chacune des extrémités, la transposase dimérise et forme un complexe transposase/ADN qui s’appelle un complexe synaptique. Les transposases coupent alors aux extrémités :

Ceci permet l’excision du transposon qui va alors se déplacer aléatoirement dans la cellule (toujours en étant complexé à la transposase). La transposase va couper en un endroit particulier de manière aléatoire le génome bactérien, permettant l’insertion du transposon dans le génome.

En 1998, a été créé un plasposon : C’est un plasmide dans lequel se trouve des cassettes de transposition. Ils contiennent une cassette de transposition se trouvant entre les 2 IR. A l’intérieur de ses IR se trouve un gène de résistance à un antibiotique qui est la kanamycine (en fonction des plasposons on peut avoir d’autres résistance que celleci). On a un terminateur de transcription juste après ce gène de résistance. A l’extérieur de cette cassette de transposition se trouve le gène qui code la transposase, un autre gène de résistance à un antibiotique (ampicilline ici), une origine de réplication R6K et une origine de transfert. 2 types de transposases : - Mariner qui cible les dinucléotides TA, pas de hotspots (insertion toujours au même endroit) - Tn5, elle s’insère entre n’importe quelle base (plus grand nombre de mutant) mais préfère les régions riches en GC et quelques hotspots. L’origine R6K est une origine de réplication conditionnelle, c’est-à-dire que le plasmide ne peut se répliquer que si la bactérie dans laquelle se trouve se plasmide contient le gène Pir. La bactérie doit donc être Pir+. De plus, l’origine de transfert de ce plasmide (oriT), cela signifie que ce plasmide est mobilisable. Donc si la bactérie dans laquelle se trouve ce plasposon contient un système de conjugaison, souvent RP4, il va reconnaître cette origine de transfert.

Quand le plasposon se trouve dans une souche que l’on veut mutagéniser, le gène qui code la transposase, produit la transposase. Elle se fixe aux extrémités, elle les coupe (type couper/coller) et forme un transpososome. Il va alors se diriger vers le chromosome bactérien, coupure du chromosome bactérien aléatoire et insertion de la cassette de transposition dans le génome. Si c’est à l’intérieur d’un gène, le gène sera inactivé car énorme insertion à l’intérieur de ce gène. Caractéristiques du plasmide pSC189, un plasmide mobilisable :

Utilisé dans le cadre de ce TP, il a les mêmes éléments que ceux décrits précédemment, mais dans des ordres un peu différents. Il a une transposase de type mariner se nommant C9, il a aussi une oriT reconnue par RP4 et une origine de réplication r6k reconnu par la protéine pi (reconnu par le gène Pir).

Comment administrer le plasposon aux bactéries cibles ? On peut transférer ce plasposon par conjugaison bactérienne :

Il y a donc deux souches, une donneuse et une receveuse. La souche donneuse doit être capable de mobiliser le plasmide. Dans le cadre du TP, la souche que l’on utilise est une souche de génotype RP4, lambda pir (elle a le gène pir) et delta dapA, elle se nomme MFDpir. dapA : Le gène dapA code une enzyme qui intervient dans la synthèse de l’acide diaminopimelic (DAP). Cet acide est un dérivé d’acide aminé que l’on trouve dans le peptidoglycane :

Une souche auxotrophe Sans DAP dans croissance, une dapA ne peut

delta dapA est pour le DAP. un milieu de souche delta pas survivre.

Si l’on veut envoyer un plasposon dans une souche a mutagéniser, on le fait par conjugaison. On va mélanger la souche MFDpir avec la souche receveuse, qui doit être sensible à la Kanamycine car on veut obtenir des mutants résistants à la Kanamycine. Le système RP4 va reconnaitre l’origine de transfert du plasposon et transférer une copie du plasmide directement dans la souche receveuse. Ce processus n’est pas à 100% efficace, certaines receveuses ne vont jamais recevoir le plasmide tandis que d’autres l’auront. La cassette de transposition va alors sauter dans le génome et va mutagéniser les gènes de manière aléatoire. Cette fréquence est plutôt rare, en général il n’y a qu’un transposon qui transpose dans un génome. Donc un mutant c’est l’insertion d’une seule cassette de transposition. Sélection des mutants après conjugaison :

On place la souche MFDpir et la souche receveuse dans un tube, on centrifuge et on obtient un culot bactérien que l’on re suspend dans un faible volume que l’on dépose sur un filtre de nitrocellulose. Ce filtre est une surface solide et sèche qui permet d’augmenter l’efficacité de conjugaison car les pilis de conjugaison sont des structures fragiles et qui cassent facilement si le milieu est humide (10 fois plus d’efficacité de transfert avec le filtre environ).

On va ensuite récupérer ces cellules et les étaler sur un milieu sélectif (kanamycine par exemple). Ici, on sélectionne spécifiquement les receveuses qui ont été mutagénisées car pas de DAP dans la boîte donc pas de souche donneuse possible et présence de kanamycine donc pas de souche n’ayant pas été mutagénisée. Seuls les mutants peuvent donc survivre. Quand on effectue une mutagénèse aléatoire, on veut en général obtenir un grand nombre de mutants donc on va utiliser de nombreuses boîtes. La nuit on incube et le lendemain on identifie les mutants d’intérêt sur nos boîtes de pétri (plusieurs centaines de boîtes)....